1材料与方法

试验动物选用5只成年太行青山羊公羊，对其实施阉割手术，采集睾丸组织，放入已处理过的冻存管后投入液氮保存。RNA提取依照说明书操作要求提取山羊睾丸总RNA，通过核酸蛋白测定仪检测纯度、浓度及和，然后琼脂糖变性电泳检测RNA的完整性，贮存于－80℃冰箱。1．3引物设计根据中公布的人、鼠、牛、绵羊基因同源序列的序列进行分析，在高度保守区域设计扩增序列特异性引物SP1，5’RACE和3’引物根据生物公司．试剂盒操作说明要求，通过Primer5．0软件设计，引物交由上海生物工程公司合成，试验所用引物序列。基因全长c克隆基因cDNA中间片段克隆使用SYBR?中的反转录反应试剂进行反转录实验，构建10μL反转录体系：．5μL，R；反应条件：。mRNA转录为cDNA后用作后续PCR模板，扩增引物SP1，构建15μL体系：cDNA模板聚合酶；反应条件：94℃预变性个循环；72℃延伸8min。反应结束后1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。和5’RACE扩增以提取的山羊睾丸组织总RNA为模板，严格按照TaKaRa生物公司试剂盒说明进行3’RACE和5’RACE扩增。扩增产物经割胶回收、连接转化、定向克隆至，测序。序列分析分段扩增及RACE获得的山羊基因序列利用DNAStar软件中的SeqMan程序拼接，拼接产物（核酸序列）用DNAStar软件中的EditSeq程序翻译成氨基酸序列。并通过

2结果与分析

基因cDNA特异片段及RACE扩增结果本试验从成年太行青山羊睾丸组织提取的RNA进行cDNA第一条链的合成，然后以山羊睾丸cDNA第一链为模板，用R引物进行扩增基因cDNA特异性片段，产物经1．2％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下成像分析，观察到一条带，为900bp左右，与预期的目的条带大小相符，说明扩增成功。以合成的RACEcDNA为模板，通过套式PCR反应，3’RACE和5’RACE分别扩增得到约250bp、1000bp的片段（图1），将所得产物进行纯化，与pMD18－T载体连接，转化到感受态细胞，筛选单克隆质粒后送上海生工测序，经结果表明，该序列属于基因3’端和5’端序列。基因cDNA全长序列分析结果cDNA全长序列的获得用DNAS－TAR软件SeqMan程序对RT－PCR和RACE产物测序结果进行拼接分析，山羊cDNA全长序列为，包含有960bp的开放阅读框，编码319个氨基酸。该基因3’非翻译区长87bp，3’非翻译区有真核生物典型的PolyA加尾结构。功能结构域的预测应用SMART服务器分析对结构域功能进行预测，发现在319个氨基酸序列中，73到115之间有一个“pKID”区域，259～316之间含有一个典型的“BRLZ”结构，说明属于bZIP转录因子家族。跨膜区分析用ExPASy提供的在线TM－HMM跨膜区预测软件分析山羊氨基酸序列未发现跨膜区。二级结构的预测通过GOR方法对二级结构预测分析结果如图5显示，山羊蛋白由α－螺旋（约占37．30％），β－折叠（约占18．81％）和卷曲螺旋3种模块组成，以α－螺旋和卷曲螺旋为主三级结构预测通过SWISS－MODEL软件在线预测所推导的山羊蛋白三级结构。以PDB数据库中的1kdxB（99．9）被选定为模板，待测蛋白质与模板的序列相似性达到88．889％，建模的氨基酸由82～108，评估值为2．33172e－05，符合建模标准。预测模型。可见，山羊蛋白三级结构包括两个核心螺旋。运用Swiss－PdbViewer软件进行模型质量评价。图8为预测3D模型的拉氏构象图。从结果可以看出，氨基酸在拉氏构象图中较集中的位置形成二级结构，基本判断3D模型是合理的。三级结构预测结果显示螺旋结构的全部氨基酸在第三象限的黄色区域内，说明模型可信度高。序列多重比对和分子进化树分析将山羊基因编码区核苷酸和氨基酸序列分别与GenBank中已登录的牛、绵羊、狗、人、褐鼠的基因进行比较，结果显示核苷酸同源性分别为，氨基酸同源性分别为。并用基于氨基酸序列的NJ法构建分子系统发育树，结果显示山羊与牛亲缘关系最近，人次之，与小鼠、褐鼠、马、狗和绵羊的亲缘关系较为相近，与鲑鱼的亲缘关系最远。

3讨论

自1991年Foulkes等首次获得小鼠基因cDNA序列，随后许多物种的基因cD－NA序列被成功克隆。本研究通过RACE技术成功克隆得到全长1183bp山羊基因cDNA序列，包含有960bp的开放阅读框，编码319个氨基酸。该基因3’非翻译区长87bp，3’非翻译有真核生物典型的PolyA加尾结构。3’非翻译区有一个“ATTTA”序列，与RNA的稳定性有关。山羊基因cDNA序列与牛相似，3’非翻译区仅存在一个PolyA位点，区别于小鼠等其他哺乳动物基因的3’末端的两个polyA位点。对氨基酸序列预测发现包含两个富含谷氨酸结构域，一个PKA磷酸化位点，以及一个碱性亮氨酸拉链结构域，均属于CREB亚族典型的功能结构域，表明本研究克隆出的基因cDNA序列及氨基酸序列属于典型的bZIP转录因子家族。通过应用SMART服务器对结构域功能进行预测，发现在319个氨基酸序列中，73～115之间有一个“pKID”区域，259～316之间含有一个典型的“BRLZ”结构，pKID区域为激酶诱导结构域，是蛋白激酶对蛋白进行磷酸化的部位，是激活蛋白必不可少的区域“BRLZ”结构为bZIP结构域，其主要作用是调控蛋白／DNA的相互作用，二聚化是蛋白结合DNA所必需的，二聚化的蛋白与CRE启动子元件结合。现已证实，许多参与精子发生过程的基因，其启动子位点均含有CREs。因此，bZIP区对发挥正常的生物学功能是必需的，而且也是保守的。CDS序列同源性分析结果表明，与牛、绵羊、狗、人和褐鼠同源性分别为，氨基酸序列同源性分别为，说明在进化过程中具有较高的保守性。蛋白质的生物功能很大程度上取决于其空间结构，致使蛋白质结构的预测成为了目前研究的热门课题。二级结构预测分析结果显示，山羊蛋白有α－螺旋、β－折叠和卷曲螺旋3种模块，以α－螺旋和卷曲螺旋为主。通过同源建模，与PDB数据库中1kdxB（99．9A）三维结构高度相似，通过的三级结构和拉氏构象图同样也验证了蛋白结构非常保守。本试验通过对山羊cDNA序列成功克隆，并对其进行生物信息学分析，为后续深入探讨山羊蛋白生物学功能打下基础。

作者：施力光荀文娟张春香单位：中国热带农业科学院