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探研水稻相关基因的克隆技术

探研水稻相关基因的克隆技术

1不定根和主根相关基因

OsIAA23第II结构域发生突变后,纯合突变体Osiaa23表现为无不定根、无侧根和无根冠,并且该基因在发育过程中特异性在主根、不定根和侧根根尖的静止中心表达,推测是生长素信号在根尖静止中心被中断导致突变表型,说明生长素信号传导对于静止中心细胞维持功能是必需的,且OsIAA23基因介导了静止中心的生长素信号传导.与拟南芥GNOM1同源的水稻基因CRL4/OsGNOM1编码鸟嘌呤核苷酸交换因子,它作用于二磷酸腺苷-核糖基化因子,该基因突变后影响水稻体内的生长素的极性运输,从而影响不定根原基的起始,导致突变体不定根缺失,并且侧根的发生也受到严重的抑制,同时向地性缺失.水稻的主根在苗期对水稻生长发育有所贡献,但根系的主干,成熟水稻的数目可以达到几百条.水稻的构造与主根几乎完全相同,但其属于胚后发育的器官,发生的位点一般在茎基部未伸长的低节位上.原基起始于邻近维管束的中柱鞘最内层的分生细胞,通过1~2次的平周分裂形成不定根原基的原始细胞,其中,外层原始细胞发育成根冠的原始细胞,内层细胞发育为表皮-内皮层、中柱原始细胞,最终形成根冠、表皮、内皮层、皮层和维管组织等.不定根的整个发生与发育过程可以分为原始细胞的建立、表皮-内皮层、中柱和根冠原始细胞的建立、表皮和内皮层的分化、皮层的形成、不定根基本组织的建立、细胞开始伸长及液泡化和不定根原基出现等7个连续的阶段.目前克隆到的水稻不定根基因大多与生长素信号传递通道相关,主要调控不定根的起始和发生.第1个被克隆的控制不定根发育基因是ARL1/CRL1.不定根缺失突变体在不定根原基形成原始细胞的第1次平周分裂中受到抑制,从而不能形成不定根原基,导致不定根缺失.ARL1/CRL1基因编码1个植物特异的结构域的转录因子,CRL1启动子上的1个蛋白的直接靶子,其基因表达受AUX/IAA正调控,说明CRL1通过生长素信号途径调控不定根原基的起始.OsPIN1是水稻的一个生长素输出载体,该基因的RNAi转基因植株的不定根数量呈现大幅下降,说明不定根的发生与发育受生长素的影响和调控.突变体的不定根原基能正常形成,但不定根形态建成后不能突破表皮,且呈不定根缺失表型,外源生长素能够部分回复突变体不定根,推测OsCAND1可能通过影响生长素信号调控不定根形态建成后的G2到M期细胞分裂过程有些与生长素信号传递相关的根系基因的作用呈多效性,不但调控不定根起始和发生,同时也会影响到主根和侧根等性状.将水稻OsIAA3第II结构域的Pro突变为Leu后的Osiaa3突变体表现为主根变短,不定根与侧根数目显著减少,对生长素不敏感和重力反应迟钝.超表达OsIAA1基因在外加生长素处理时,主根伸长增加,侧根数目增多,但不定根的数量减少.生长素响应因子OsARF16是调控生长素响应基因表达的转录因子,基因被敲除后的突变体Osarf16对生长素不敏感,削弱主根、侧根和根毛对外源生长素和缺磷的响应.不定根的起始与发生不但受生长素调控,细胞分裂素和其它激素也共同参与这个调控过程基因发生突变后表现不定根缺失或稀少,而超表达该基因的转基因水稻产生大量的不定根,并在异位产生不定根.WOX11同时受到生长素和细胞分裂素的诱导,细胞分裂素双元信号系统中A型的基因直接受WOX11负调控,表明该基因可能是生长素和细胞分裂素信号传导的整合器,并通过RR2调节不定根发育过程中的细胞增殖.突变体因不定根原基起始的缺陷,呈不定根稀少的表型,CLR5基因编码的蛋白属于P2/ERF转录因子家族,虽然它与CRL1一样均是ARF蛋白的直接靶子受生长素的调控,但遗传学证据证明它们对不定根起始的作用是属于不同的信号途径,CLR5基因受生长素诱导后,通过正向调控OsRR1基因抑制细胞分裂素的信号通道,从而促进不定根的发生,表明它参与了水稻体内生长素信号对细胞分裂素信号的作用.

2实验

Anti-OsCK1的转基因植株的根系主根变短、不定根和侧根数目减少,但外加IAA培养时根系呈正常的发育,推测OsCK1参与生长素的代谢从而调控根系的生长发育,此外,anti-OsCK1的转基因植株对脱落酸和油菜素内酯不敏感,说明它有可能参与不同的激素信号途径.基因编码一种金属硫蛋白,在水稻中表达被细胞分裂素下调,该基因的RNAi植株根系中细胞分裂素浓度显著上升,主根变短,不定根和侧根数量减少,超表达的转基因植株根系中细胞分裂素浓度略有下降,不定根数目增多,并且有很多粗侧根产生.说明在根系生长发育过程中存在OsMT2b基因对内源细胞分裂素浓度的反馈调节机制.相对来说,造成主根、不定根甚至侧根变短的短根突变基因涉及机理比较广泛,与离子通道型谷氨酸受体基因、糖基化、细胞壁多糖和纤维素合成、蔗糖代谢、金属离子等相关.水稻短根突变体glr在苗期主根和不定根变短,不定根、侧根和根毛的发生不受到影响,GLR3.1基因编码与植物离子通道型谷氨酸受体的基因,它与根系的生长发育相关,参与调控根尖分生组织细胞的分裂和凋亡,该基因突变后呈短根表型.OsGNA1基因参与糖基化供体UDP-GlcNAc合成途径,OsGNA1基因突变后,内源UDP-GlcNAc水平显著降低,导致N或O连接的GlcNAc糖基化水平相应降低,同时细胞代谢细胞形状和微管稳定性出现异常,产生短根表型.突变体Osdgl1因主根、不定根与侧根生长受阻呈短根表型,但不定根和侧根的数量及根毛与野生型没有显著差异,细胞学实验发现是因为细胞分裂与细胞伸长二个方面的原因导致短根,并伴有细胞死亡和活性氧的改变.OsDGL1基因编码多萜长醇二磷酸寡糖蛋白环糊精糖基转移酶亚基前体,当基因突变时导致根部组织的N-糖基化(N-glycosylation)缺陷,从而改变了根细胞壁的多糖合成.突变体Osglu3的主根和不定根长度变短,OsGLU3基因编码水解纤维素β-1,4-糖苷键的β-1,4-葡聚糖内切酶,参与根细胞壁纤维素合成,通过影响根细胞的分裂及细胞的伸长来调控根系的发育.OsCyt-inv1基因编码碱性/中性蔗糖转化酶,其突变体Oscyt-inv1的主根、不定根和侧根变短成短根表型,细胞学实验发现细胞伸长受阻是造成短根的主要原因,在提供外源葡萄糖培养时,突变体的短根表型能恢复正常,说明OsCyt-inv1基因在根系生长发育中起着重要的作用.突变体Osspr1的主根、不定根和侧根的伸长受到严重的抑制,呈短根系表型.OsSPR1基因编码一个含有Armadillo重复域的线粒体蛋白,该基因突变造成植株对二价金属离子锰、铁、锌的吸收受到抑制,说明OsSPR1基因参与根系的伸长和金属离子的平衡.

3侧根相关基因

突变体蛋白结构域II序列中的脯氨酸被亮氨酸所替代,且体内的基因表达减弱,表现为无侧根表型,与Osiaa13突变体一样其不定根发生与发育正常,说明OsIAA13和OsIAA11基因均特异调控侧根原基的起始和发生.拟南芥等双子叶植物侧根起源于木质部极的中柱鞘细胞,水稻等单子叶植物侧根起源于韧皮部极的中柱鞘和内皮层.除了上述与侧根相关的水稻多效根系基因外,有2个特异调控侧根原基起始发生的基因得到克隆,并且这2个基因编码的蛋白都属于Aux/IAA蛋白家族,且突变都发生在结构域II核心序列,导致Aux/IAA蛋白不能被泛素化后降解,而与ARF长久结合,阻断生长素的信号传导,进而影响与侧根原基起始发生相关基因的表达.突变体Osiaa13的OsIAA13蛋白结构域II核心序列中的甘氨酸被丝氨酸所替代,表型为侧根数目显著减少,但不定根数目没有减少.根毛相关基植物根表皮细胞可分为根毛细胞和非根毛细胞,根毛是表皮细胞外伸形成的管状突出物.根表皮细胞分化成根毛细胞有三种类型:随机模式(如水稻)、位置依赖性模式(如拟南芥)和不对称分裂模式(如卷柏).根毛发育可分为表皮细胞特异化、起始、伸长和成熟四个阶段[26].在根尖分生区根毛细胞与非根毛细胞开始出现形态差异,到了伸长区根毛开始发生,在成熟区根毛细胞成熟并完全分化.至今已有4个水稻根毛相关基因被克隆,并都与根毛的伸长相关.OsCSLD1与拟南芥KOJAK/AtCSLD3同源,编码为1个纤维素合成酶基因.突变体csld1根毛只有野生型长度的30%左右,且形态异常,但密度与野生型没有差异,因此OsCSLD1基因功能与根毛起始无关,主要调控根毛伸长.并发现OsCSLD1基因只在根毛中特异表达,超表达时会导致根毛比野生型更长.但随后筛选到与csld1等位的突变体,呈无根毛表型,但根毛细胞有凸起,并发现OsCSLD1基因不只特异在根毛中表达,而是可以在包括地上部的多个组织中表达.OsAPY基因编码了1个水解NTPs的三磷酸双磷酸酶,该基因突变时,突变体rth1呈无根毛表型,但根毛细胞仍有凸起,说明OsAPY基因功能与OsCSLD1相似都参与根毛伸长,而与根毛起始无关.此外,OsAPY基因具有多效性,还调控了根的伸长和植株地上部的发育.是1个bHLH转录因子,当OsRHL1突变后,2个等位Osrhl1和Osrhl2的根毛性状与突变体csld1和rth1相似,根毛伸长受到抑制后呈无根毛表型,但根毛起始正常.超表达OsRHL1能使根毛比野生型长1倍多,而且根毛数量变多,说明OsRHL1除调控根毛伸长外,可能还与表皮细胞特异化相关.OsEXPA17基因属于EXPANSIN家族一员,发生突变后,水稻呈现短根毛,说明OsEXPA17参与调控根毛的伸长.互补实验发现,EXPANSIN家族的OsEXPA30基因能回复OsexpA17突变体短根毛表型,拟南芥中同源的AtEXPA7基因能部分回复OsexpA17突变体短根毛表型.

作者:丁沃娜朱世华单位:宁波大学