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探究昆虫的克隆基因的制备方法

时间:2013-11-11 09:35:38   阅读:175

1材料与方法

4~6周龄的清洁级家兔由中国农业科学院兰州兽医研究所动物场提供。莫氏巴贝斯虫裂殖子的纯化与总RNA的提取莫氏巴贝斯虫临潭株单克隆株G7由兰州兽医研究所虫媒与虫媒传播病课题组提供。莫氏巴贝斯虫的体外培养参照文献进行,当染虫率达到8%~10%时,收集细胞培养物,利用渗透压差法进行裂殖子的纯化[15]。向100μL裂殖子中加入反复吹打以破碎细胞,加入200μL氯仿,12000×g离心10min。上层水相转入干净的离心管中,加入500μL异丙醇,室温静置10min,4℃12000×g离心10min。弃去上清,总RNA沉淀用750mL/L的乙醇洗涤1次,置于超净台内吹干。最后用20μL无RNA酶的去离子水溶解,用微量核酸蛋白检测仪测定浓度,并对其进行凝胶电泳分析。1.3全长基因的RACE扩增根据GenBank中公布的顶复门原虫相关基因序列,在基因的保守区域设计RACE扩增引物,进行基因的5′RACE和3′RACE扩增,引物序列。RACE操作按照说明进行。扩增的RACE产物插入到pGEM-TEasy载体,转化到JM109感受态细胞中,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定为阳性的菌落,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。获得的测序结果应用DNAStar软件进行序列拼接和开放阅读框预测。全长CDS的PCR扩增与基因结构分析actin,aldolase和trap基因全长的扩增引物根据RACE的测序结果,在预测的开放阅读框外侧设计上游引物和下游引物,引物序列。分别以莫氏巴贝斯虫cDNA和基因组DNA为模板进行PCR扩增。扩增产物切胶回收后,克隆至pGEM-TEasy载体,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。原核表达载体的构建与融合蛋白的诱导表达根据全长基因的测序结果,利用PrimerPre-mier5.0软件进行引物设计,引物序列见,下划线处为酶切位点。以莫氏巴贝斯虫临潭株G7cD-NA为模板,进行基因的扩增。扩增产物经切胶回收后,酶切产生具有黏性末端的基因分别与pGEX-4T-1载体的酶切产物连接,连接产物转化至E.coilJM109感受态细胞中。用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性菌落。经PCR鉴定为阳性的重组原核表达载体,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证。将测序验证正确的原核表达载体分别命名为,重组表达载体分别转化到BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,37℃、200r/min培养至D600nm达到0.6~0.8时,加入IPTG使其终浓度为0.8mmol/L,继续振荡培养4h。4℃、3900×g离心10min,收集细菌沉淀,纯化融合蛋白,操作步骤按说明书进行。分析表达的重组蛋白,用微量核酸测定仪测定蛋白的质量浓度。抗血清的制备、特异性检测及效价测定融合蛋白免疫家兔前耳缘静脉采血作为阴性血清。纯化的融合蛋白和分别与等量的佐剂乳化后,以皮下多点注射法免疫家兔制备多克隆抗体。初次免疫时,每只家兔注射200μg,此后以100μg/只注射;每2周免疫1次,共免疫3次。初次免疫使用弗氏完全佐剂,加强免疫使用弗氏不完全佐剂。末次免疫10d后,耳缘静脉采血,分离抗血清进行抗体效价与反应性测定。用ELISA方法测定抗体效价,分别以纯化的融.1RACE扩增RACE扩增获得的和trap基因片段,经10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。将上述基因5′和3′末端序列的测序结果进行装配、BLAST分析,

2结果

基因结构分析扩增的基因全长分别为1110、1199和2254bp,开放阅读框大小分别为。将获得的基因用BLAST/P软件进行同源性分析、开放阅读框预测及基因特性分析,结基因没有内含子。trap基因由4个内含子和5个外显子组成,内含子长度分别为39、36、38和37bp。并将所获的aldolase基因序列登录GenBank/NCBI,获取登录号。融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定重组质粒诱导表达的融合蛋白分子质量大小约为,与预期融合蛋白的大小基本一致。利用纯化融合蛋白,结果见图4。经微量核酸蛋白测定仪测得蛋白的质量浓度分别为。纯化的融合蛋白经GST标签抗体识别,在预期大小的目的蛋白处出现单一条带。结果表明,纯化获得了正确的融合蛋白,可以用于后续的家兔免疫制备多克隆抗体。多克隆抗体的鉴定及效价测定分别以纯化的融合蛋白样品GST-Actin、GST-Aldolase、GST-TRAP为抗原,获得的家兔免疫血清为一抗(血清用大肠杆菌裂解物和GST蛋白中和处理后,经ELISA验证该血清与大肠杆菌菌体蛋白和GST不发生反应),分别用HRP标记的山羊抗兔IgG和AP标记的鼠抗兔IgG为二抗,进行ELISA和Western-blot鉴定。结果分别出现了分子质量大小约74ku、76ku和118ku的单一条带(见图6),说明获得的多克隆抗体具有良好的特异性。用免疫前的家兔血清作为对照,阳性血清用间接ELISA测定抗体效价。结果显示免疫后抗血清的效价均高于1∶12800。

3讨论

顶复门原虫的醛缩酶具有双重功能;一是催化糖酵解和糖异生,二是介导肌动蛋白丝与跨膜蛋白的相互作用,即把参与细胞黏附、滑行运动和入侵相关的微线体蛋白(MIC)锚定在肌动蛋白马达上,从而使微线体蛋白可以与宿主细胞表面的受体相互作用。因此醛缩酶被认为是抗寄生虫感染药物设计的分子靶位,此外醛缩酶还可以作为疟疾的潜在诊断抗原。在疟原虫、弓形虫的子孢子、牛巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫、隐孢子虫和艾美耳球虫中都发现了TRAP家族蛋白。TRAP在多种顶复门原虫的入侵中起重要作用。大多数TRAP家族蛋白都具有整合素A样结构域和TSR结构域;寄生虫利用该结构域结合红细胞表面受体、多糖和磷脂样分子。疟原虫子孢子TRAP蛋白的TSR和A结构域结合肝细胞表面的硫酸肝素糖蛋白,当TSR或A结构域失活后,子孢子的入侵受阻,但不影响其滑行运动。因此,trap可能是疫苗设计的靶基因。在疟原虫中可以作为候选诊断抗原。本研究中所克隆的基因和制备的多克隆抗体,为开展莫氏巴贝斯虫的滑行运动和细胞入侵方面的研究奠定了基础,为巴贝斯虫病血清学诊断技术的建立提供了候选抗原,同时也为预防和治疗抗巴贝斯虫病药物的设计提供了候选靶位。

作者:王锦明杨吉飞李安岩单位:中国农业科学院

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