1实验部分

1.1主要仪器与试剂LB962型化学发光分析仪

（德国伯托公司）；白色96孔板（美国康宁公司）。鲁米诺（Sigma-aldrich公司）；8-羟基喹啉（Sig－ma-aldrich公司）；FeCl3（Sigma-aldrich公司）；过氧化氢（30%，Sigma-aldrich公司）；ATP生物发光检测试剂盒（ENLITEN，美国普洛麦格公司）；实验用水均为经Milli-Q（Millipore公司）纯化的超纯去离子水。实验中所用试剂均为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1储备液的配制

鲁米诺储备溶液：称取一定量的鲁米诺溶于1mol/L的NaOH溶液中，配制成1×10-2mol/L的鲁米诺储备液，储存在棕色瓶中，避光4℃保存。8-羟基喹啉储备溶液：称取一定量的8-羟基喹啉溶于0.1mol/L的HCl溶液中，配制成1×10-2mol/L的8-羟基喹啉储备液，4℃保存。Fe（III）标准储备溶液：称取一定量的烘干恒重的FeCl3溶于pH2.5的HCl溶液中，配制成1×10-3mol/L的Fe（III）标准储备溶液，其摩尔浓度通过硫代硫酸钠滴定法准确确定，通过GBW(E)081235硫代硫酸钠滴定溶液标准物质进行溯源。ATP标准储备溶液：称取一定量的ATP标准物质候选物溶于无ATP水（ATP生物发光检测试剂盒自带）中，配制成1×10-7mol/L的ATP标准储备液，-20℃保存。作为实验室研制的标准物质候选物，需要按照ISO导则35要求，摩尔浓度经过8家单位联合验证，并经过一系列均匀性、稳定性的考查。

1.2.2工作溶液的配制

鲁米诺工作溶液：用纯水将鲁米诺储备液稀释成1×10-3mol/L的鲁米诺工作溶液（其中NaOH的摩尔浓度为0.1mol/L）。8-羟基喹啉工作溶液：用纯水将8-羟基喹啉储备溶液稀释成1×10-3mol/L的8-羟基喹啉工作液（其中HCl的摩尔浓度为0.01mol/L）。Fe（III）标准工作溶液：用pH2.5的HCl溶液将Fe（III）标准储备溶液逐级稀释成Fe（III）标准工作溶液（1×10-4mol/L，3×10-5mol/L，1×10-5mol/L，3×10-6mol/L，1×10-6mol/L）。过氧化氢溶液：取一定量体积分数为30%的过氧化氢，用水稀释至1%，用时现配。ATP标准工作溶液：用检测缓冲液（ATP生物发光检测试剂盒自带）将ATP标准储备溶液逐级稀释成ATP标准工作溶液（1×10-8mol/L，1×10-9mol/L、1×10-10mol/L，1×10-11mol/L），现用现配。

1.2.3实验方法

1）化学发光标准体系的建立

化学发光反应动力学检测：在1.5mL离心管中分别依次加入以下溶液，立刻将该离心管放到化学发光分析仪中，进行动力学检测，每秒取一个点，检测时间共100s。①10μL鲁米诺工作溶液、100μL过氧化氢溶液、10μLpH2.5的HCl溶液（相当于10μLFe（III）标准工作溶液）、85μLpH2.0的HCl溶液（相当于85μL8-羟基喹啉工作溶液）；②10μL鲁米诺工作溶液、100μL过氧化氢溶液、10μLFe（III）标准工作溶液（3×10-5mol/L）、85μLpH2.0的HCl溶液（相当于85μL8-羟基喹啉工作溶液）；③10μL鲁米诺工作溶液、100μL过氧化氢溶液、10μLpH2.5的HCl溶液（相当于10μLFe（III）标准工作溶液）、85μL8-羟基喹啉工作溶液；④10μL鲁米诺工作溶液、100μL过氧化氢溶液、10μLFe（III）标准工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羟基喹啉工作溶液。8-羟基喹啉的用量对体系发光值稳定性的影响：在10μL鲁米诺工作溶液、100μL过氧化氢溶液、10μLFe（III）标准工作溶液（3×10-5mol/L）中分别加入不同体积的8-羟基喹啉工作溶液，并用pH2.0的HCl溶液将体系补足205μL，立即检测当前发光值。pH对体系发光值稳定性的影响：在1.5mL离心管中依次加入10μL鲁米诺工作溶液、100μL过氧化氢溶液、10μLFe（III）标准工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羟基喹啉工作溶液，利用HCl或NaOH调整体系的pH值，立刻将该离心管放到化学发光分析仪中检测当前发光值。反应介质对体系发光值稳定性的影响：在1.5mL离心管中分别加入50μL的Tris-HCl、H3BO3-KOH、Na2CO3-NaHCO3和B-R缓冲溶液，然后分别依次加入10μL鲁米诺工作溶液、100μL过氧化氢溶液、10μLFe（III）标准工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羟基喹啉工作溶液，立刻将该离心管放到化学发光分析仪中检测当前发光值。

2）生物发光标准体系的建立

用ATP标准物质代替ATP生物发光检测试剂盒中的ATP校准溶液，采用试剂盒中的其他溶液建立生物发光标准体系：首先，将10μL检测缓冲液加入有100μL荧光素/荧光素酶试剂的1.5mL离心管中，立刻将该离心管放到化学发光分析仪中进行检测，作为背景信号；然后，将10μLATP标准工作溶液加入有100μL荧光素/荧光素酶试剂的1.5mL离心管中，立刻将该离心管放到化学发光分析仪中进行检测。

2结果与讨论

2.1化学发光标准体系的建立

鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼）是最常见的化学发光试剂之一，具有发光效率高、结构简单、容易合成、水溶性好等优点；在碱性条件下，鲁米诺被氧化剂（如过氧化氢）氧化后能发出波长425nm的蓝光。在不同体系中，鲁米诺发光形式不同：金属离子-过氧化氢-鲁米诺体系是闪光型发光；辣根过氧化物酶（HRP）-过氧化氢-鲁米诺体系[9-10]是辉光型发光。HRP-鲁米诺体系虽是辉光型发光，但生物酶的活性很难控制和复现，不适用于仪器的计量校准。本文将8-羟基喹啉（8-Ox）引入鲁米诺-过氧化氢-金属离子体系中，实现发光方式由闪光型到辉光型的转变，建立了发光强度稳定的鲁米诺-过氧化氢-铁（III）-8-羟基喹啉化学发光标准体系。

2.1.1添加8-羟基喹啉

初步实现稳定辉光型信号鲁米诺在碱性溶液中，与OH-反应生成阴离子，该阴离子被某些氧化剂氧化产生氨基邻苯二甲酸根离子，氧化过程中产生的化学能被氨基邻苯二甲酸根离子吸收，使其处于激发态，回到基态时发出波长为425nm的光，Fe（III）可以催化该反应过程，增强化学发光信号，而8-羟基喹啉可以与Fe（III）络合，从而起到稳定剂的作用。不同体系中鲁米诺-H2O2的发光情况，其纵坐标为相对发光强度（RLU）。曲线a说明鲁米诺与H2O2混合后，被H2O2氧化并发光，刚开始发光值缓慢上升，随着反应物的消耗，发光值开始缓慢下降，发光形式呈现一个较平缓的闪光；曲线b说明在鲁米诺-H2O2体系中加入了Fe（III）之后，加速了鲁米诺与H2O2反应，因此一开始体系的发光就达到了最大值，之后随着反应物的快速消耗，发光值也急速下降；曲线c说明当在这个体系中加入8-羟基喹啉，Fe（III）与其络合，保证了在碱性条件下Fe（III）的稳定性，使化学发光反应变成非常平稳的辉光型，在100s内发光值的相对标准偏差仅为1.1%。曲线d是没有Fe（III）的空白对照实验。

2.1.2优化反应体系的稳定性

为获得稳定且容易操作的化学发光反应体系，选择了10μL鲁米诺工作溶液（摩尔浓度为1×10-3mol/L）和100μL过氧化氢溶液（体积分数浓度为1%）的基础上，考察8-羟基喹啉的用量、反应体系最终pH和反应介质3个方面的因素，最终确定了该化学发光体系优化浓度比例。

1）8-羟基喹啉的用量对体系发光值稳定性的影响

随着向体系中加入8-羟基喹啉工作溶液的增多，体系的发光值持续降低，直到当加入50μL8-羟基喹啉工作溶液，体系的发光值不再随着8-羟基喹啉加入量的增加而降低。在仪器计量工作中，可以选择加入50~85μL8-羟基喹啉工作溶液，此时8-羟基喹啉的体积对发光强度的影响最小。在后续实验中，选择65μL作为优化的8-羟基喹啉加入量。

2）反应体系最终pH对体系发光值稳定性的影响

鲁米诺的化学发光反应需要OH-的参与，因此体系的pH也是影响发光值的重要因素之一。当pH＞10.0，体系的发光值会随着pH增大而呈指数增加，体系不容易控制；当pH值在8.80~9.60范围内，体系的发光值增长比较稳定，可以满足仪器计量检定中操作方便的需求。

3）缓冲体系对体系发光值稳定性的影响

考察了相同浓度的Tris-HCl、H3BO3-KOH、Na2CO3-NaHCO3和B-R缓冲溶液对鲁米诺-过氧化氢-铁（III）-8-羟基喹啉化学发光体系的影响，发现Tris-HCl中化学发光信号最为稳定，故选择Tris-HCl缓冲溶液；最终体系定为：加入50μL0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液，pH=9.10。通过对8-羟基喹啉的用量、反应体系最终pH和反应介质3个方面的考查，确定了化学发光分析仪计量用鲁米诺-过氧化氢-铁（III）-8-羟基喹啉体系，其用量分别为：10μL摩尔浓度为1×10-3mol/L鲁米诺工作溶液（pH13.0）、100μL体积分数为1%过氧化氢溶液、65μL摩尔浓度为1×10-3mol/L8-羟基喹啉工作溶液（pH2.0）、和50μL0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH=9.10）。此时化学发光强度与Fe（III）的摩尔浓度具有很好的线性关系。

2.2生物发光标准体系的建立

在众多生物发光体系中，ATP-荧光素-荧光素酶发光体系应用最为广泛，ATP检测也经常被业内用于化学发光分析仪灵敏度的衡量指标。其原理是：荧光素酶在有氧条件下，可以和荧光素结合后催化ATP转化成AMP（磷酸腺苷），同时释放出光子（波长562nm），发光效率高，而且发光强度与ATP含量呈很好的线性关系。为了统一仪器灵敏度的评价方法，我们研制了ATP标准物质，并结合商品化ATP检测试剂盒，建立了一套稳定可靠的ATP生物发光标准体系，用于化学发光分析仪的计量校准。

2.3生物化学发光标准体系

在仪器计量校准中的应用最终将化学发光标准体系和生物发光标准体系联合，共同对化学发光分析仪进行计量校准研究，对仪器的计量性能进行全面的考察：采用鲁米诺-过氧化氢-铁（III）-8-羟基喹啉化学发光标准体系对伯托LB962型化学发光分析仪的测量重复性、交叉污染和线性相关系数的计量特性进行评价；采用ATP生物发光标准体系作为标准光源对伯托LB962型化学发光分析仪的灵敏度的计量特性进行评价。

2.3.1测量重复性

以1×10-5mol/LFe（III）标准工作溶液进行测量，重复测量6次，相对发光强度值分别为302579，298800，321145，299523，338856，356041，计算其相对标准偏差为7.4%，即为仪器的测量重复性。实验数据说明仪器测量重复性较好；同时也说明建立的化学发光标准反应体系发光值稳定，完全可以用于仪器测量重复性的计量特性的评价。

2.3.2交叉污染测量中心孔

（样品位置，1×10-5mol/LFe（III）标准工作溶液）发光值I0和周围孔发光值I0i，如表1所示，周围孔发光值的平均值与中心孔发光值之比的百分数即为化学发光分析仪的交叉污染。由实验数据可以看出，中心孔的发光对周围孔发光影响很小，仪器的交叉污染仅为0.02%，与仪器的出厂指标无明显差异；同时证明了我们建立的化学发光标准反应体系可以用来评价仪器的交叉污染的计量特性。

2.3.3线性相关系

数采用化学发光标准体系对0，1×10-6，3×10-6，1×10-5，3×10-5，1×10-4mol/LFe（III）标准工作溶液进行测量，考察仪器测量线性相关系数，以检测发光值信号减去本底信号得到的相对发光值ΔI为纵坐标（本底信号为Fe（III）摩尔浓度为0时的发光值），Fe（III）的摩尔浓度为横坐标绘制标准曲线，Fe（III）在1×10-6~1×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系：ΔI=2×1010C-22396，线性相关系数r=0.9986。使用ATP生物发光检测试剂盒对0，1×10-11，1×10-10，1×10-9，1×10-8，1×10-7mol/LATP标准工作溶液进行分析，考察仪器测量线性相关系数，以相对发光值Δ（IΔI为检测发光值信号减去本底信号，本底信号为ATP浓度为0时的发光值）为纵坐标，ATP的摩尔浓度为横坐标绘制标准曲线。ATP在1×10-11~1×10-7mol/L范围内呈良好的线性关系：ΔI=7×1012C+550，线性相关系数r=0.9999。采用化学发光标准反应体系和生物发光标准反应反应体系评价仪器的线性相关系数分别为0.9986和0.9999，说明仪器的线性相关系数的性能指标较好；这两种反应体系均能评价仪器的线性相关系数的计量特性。

2.3.4灵敏度使用

ATP生物发光检测试剂盒对空白溶液的本底信号进行测量，平行检测11次，本底信号相对发光强度分别为29，34，32，34，40，47，37，42，34，39，32，计算检出限（3×S/N）为2.24×10-16molATP（100μL样品体积），即为化学发光分析仪的灵敏度，达到仪器的出厂指标，说明ATP生物发光标准反应体系可以用来评价仪器的灵敏度的计量特性，统一了化学发光分析仪灵敏度的表示方法。

3结束语

本文模拟化学发光分析仪的实际工作状态，建立了可溯源的鲁米诺-过氧化氢-铁（III）-8-羟基喹啉化学发光标准体系和ATP-荧光素-荧光素酶生物发光标准体系，并将这两种标准体系联合，应用到化学发光分析仪的计量校准工作中，对仪器测量重复性、交叉污染、线性相关系数和灵敏度计量特性进行实验研究，实现了对化学发光分析仪计量性能的全面考察，为化学发光分析仪日常的校准工作以及国家计量校准规范的制订提供了实验基础。

作者：李兰英徐勤许丽闻艳丽武利庆任淑贞刘刚单位：上海市计量测试技术研究院中国计量科学研究院