高效液相色谱
高效液相色谱范文第1篇
关键词：葛粉;葛根素;HPLC
Abstract:Object:DeterminationofPuerariainPuerariaPowderMethods:PuerariaweredeterminedbyHPLC.ThemobilephasewasMeOH－H2O－HAc（30：70：0.5）.Detectionwavelengthwasat250nm.Results:Puerariashowedagoodlinearrelationship.Theaveragerecoverywas98.6%andRSDwas1.76%.Conclusion:Thismethodwassimple,quickandaccurate.
Keywords:PuerariaPowder;Pueraria;HPLC
葛根为豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根,是常用中药材,具有解肌退热，生津，透疹，升阳止泻功效，用于外感发热头痛、项背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢，泄泻，高血压颈项强痛等[1]。现代研究证实，葛根中的主要有效成分为葛根素等异黄酮类化合物，具有抗炎解热、扩张冠状动脉血管、增加冠状动脉血流量的作用，同时也有降低血压的作用。有关葛根中葛根素等异黄酮的含量测定研究已有不少报道[2-5]，但对葛粉中葛根素含量测定报道不多。本文对葛粉中葛根素的提取条件和测试条件等进行比较研究,并采用高效液相色谱法对葛粉样品进行了定量分析,结果令人满意。
1实验部分
1.1仪器与试剂
岛津LC－10Atvp高效液相色谱仪；SPD－10Avp紫外检测器；岛津UV－265紫外分光光度仪，多功能榨汁机/搅拌机SG300－I（上海科骏电器有限公司）。甲醇（色谱纯），水（二次蒸馏），其余均为分析纯。葛根素对照品（中国药品生物制品检定所）；鲜葛（浙江省永嘉县潘坑乡）。
1.2色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱C18diamonsil5ul(150×4.6mmI.D)，MeOH－H2O－HAc（30：70：0.5）为流动相，紫外检测波长250nm。
2结果与讨论
2.1提取溶剂浓度的选择
精密称取同一样品约0.1g,分别加30%乙醇、50%乙醇和80%乙醇10ml，超声提取60分钟，进样5ul,比较峰面积，实验结果表明30%乙醇提取最好。
2.2超声提取时间的选择
精密称取同一样品约0.1g,分别加30%乙醇10ml，超声提取30分钟、45分钟、60分钟，进样5ul,比较峰面积，实验结果表明超声60分钟为最佳提取条件。
2.3流动相及流速的选择
试验时曾采用下述流动相进行测定：甲醇－水（25：75）、甲醇－水－醋酸（30：70：0.5）、甲醇－水（30：70）为流动相，结果采用甲醇－水－冰醋酸（30：70：0.5）为流动相，样品分离好。而流速也以1.0ml/min为合适。
2.4标样溶液的制备
称取一定量葛根素对照品,用30%乙醇溶解配制成浓度为13ug/ml的葛根素标准液。
2.5葛粉制备
取鲜葛用水洗净切片,称取20g放入搅拌机内，搅拌三次，每次1分钟，每次加水200ml，150ml，100ml，合并浆汁放置二天，去掉上面的水，下面的粉浆用定量滤纸过滤，低温干燥，放入干燥器中备用。
2.6供试品溶液制备
精确称取一定量葛粉于10mL容量瓶中,加30%乙醇10ml,超声提取1h,滤纸过滤,滤液过0.45um滤膜作为供试品溶液。
2.7线性关系考察
在上述色谱条件下，分别进标样溶液0.5、3、5、7、10μl，测得各峰面积。以葛根素为横座标（A），以峰面积（Y）为纵座标，计算得回归方程：Y=3.90×106x+728.14,相关系数r＝0.9999；结果紫外检测葛根素在0.0065-0.13μg范围内呈良好线性关系。
2.8精密度试验
取上述标样溶液，连续进样5次，测定，RSD为1.11%。
2.9重复性试验
取同一样品重复测定5次，RSD为1.61%。
2.10稳定性试验
取上述供试品溶液，0、2、5、7、10h进样，RSD为2.1%，10小时内进样稳定。
2.11回收率试验
取已知含量的样品，分别加入葛根素标样，按上述方法测定5次，平均回收率为98.6%,RSD为1.76%。见表1。
2.12样品分析
精密吸取标样溶液5μl与供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，结果:葛粉中葛根素的含量为0.06%（n=3），见下图。
3讨论
本文采用高效液相色谱法测定葛粉中葛根素的含量,方法简单、快速、准确，结果满意，可用于葛粉中葛根素的含量测定。
[参考文献]
[1]中国药典2005版一部.2005:233-234.
[2]章育中，杨凡。高效液相色谱法测定葛根及其片剂中异黄酮的含量.药物分析杂志，1984,4(2):67.
[3]张蕾,潘扬，朱蓉贞，等。不同品种及产地的葛根中葛根素含量的比较。中国中药杂志，1995,20(7):399.
高效液相色谱范文第2篇
目的建立吴茱萸的hplc指纹图谱分析方法。方法高效液相色谱（hplc）分析，diamond c18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，柱温35℃；流动相为乙腈－0.1%磷酸梯度洗脱，流速1.0 ml/min；检测波长327 nm。结果建立了吴茱萸的指纹图谱，标定了14个共有峰（rsd≤3.0%），符合有关规定。结论hplc指纹图谱为吴茱萸的质量控制提供了更全面的信息，可较全面地控制吴茱萸的质量。
【关键词】 吴茱萸 高效液相色谱 指纹图谱
fingerprints of fructus evodiae by hplc
liu bo?ping ，tan wen，hong shu?hua，tan rui
school of bioengineering，southwest jiaotong university，chengdu 610031，china
abstract：objectiveto study the hplc fingerprint of fructus evodiaea. methodschromatographic column:diamond c18 column（4.6 mm×250 mm,5 μm）;mobile phase: acetonitrile and 0.1% phosphoric acid in water in a gradient mode；column temperature:35℃;flow rate: 1.0 ml/min;wavelength:327 nm.resultsthe fingerprint of fructus evodiae was established and 14 common peaks（rsd≤3.0%） were found in the fingerprint, and reached to some relevant provision. conclusionthe hplc fingerprint provided much further information for the quality control of the fructus evodiaea, and can be used to control the quality of fructus evodiaea.
key wordsfructus evodiae； hplc ； fingerprints
吴茱萸（fructus evodiae）为芸香科植物吴茱萸evodia rutaecarpa（juss.） benth.及疏毛吴茱萸evodia rutaeca（fuss.）benth. var. bodinie（dode）的干燥近成熟果实。具有散寒、止痛、降逆、助阳、止泻的功效，近代药理研究发现尚具有扩张血管、降压、强心等功效。吴茱萸的性味辛、苦、热，有小毒。常用于厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀痛、呕吐吞酸、五更泄泻等症的治疗［1］。
指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的手段，其根据色谱指纹图谱的模糊属性，着眼于宏观的规律性的特征分析，而不是求索细枝末节。目前，多用吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量控制吴茱萸的质量，但不能全面反映吴茱萸中其他成分的情况，难以真正控制其质量。因此，本文建立了吴茱萸的指纹图谱分析方法。对10批全国不同产地来源吴茱萸进行了分析，并进行方法学考察，初步建立了指纹图谱，并标定了14个共有色谱峰［2］。
1 器材
1.1 仪器
岛津lc-10a高效液相色谱仪，二级管阵列检测器（dad），岛津class-vp色谱工作站，超声波清洗器sb2200-t，1/10000电子分析天平（北京赛多利斯），中药色谱指纹图谱相似度评价系统（中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件2004版a）。
1.2 试剂
乙腈为色谱纯（美国fisher公司），水为超纯水，磷酸为分析纯。
1.3 材料
对照品，吴茱萸碱对照品（
结果见图2。从中总结出吴茱萸指纹图谱中典型的14个色谱峰（其中13号峰为s峰）。见图3。
高效液相色谱范文第3篇
关键词：高效液相色谱仪；农药分析；原理；应用
一、高效液相色谱仪的工作原理
高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相） 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来，液相色谱仪的具体分离类型见表1.
二、高效液相色谱仪的特点
特点主要有高压、高速、高效、高灵敏度和适应的范围比较广泛。第一高压，液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到的阻力较大，因此为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350 × 105Pa；第二高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h ；第三高效：近年来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高；第四高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升；第五适应范围广泛：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法只要求试样能制成溶液，而不需要汽化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占 20%，而能用液相色谱分析的约占70%～80%。
三、高效液相色谱仪的应用
液相色谱仪以独特的特点及其技术的发展，已被广泛地应用到化工、食品分析、环境分析、天然产物分析以及医药、生化、临床检验，如农药检测方面，高效液相色谱仪可以分析农药的含量，农药的残留量等。在生化方面高效液相色谱仪可以分离分析与生命密切相关的多种物质 ， 如氨基酸、肽、蛋白质、核酸、维生素、酶、糖等。
四、农药分析
农药分析中的分析源，在整个分析过程中占据重要地位，从分类上讲，我们将农药分析分为两大类，一者为原药制剂分析，二者为残留量分析。其中原药制剂分析更侧重对于准确度的分析，而残留量着重研究农药的效能作用。
在农药分析史上手工计算居多，我国最早使用滴定法进行农药分析，即：根据指示剂的颜色变化指示滴定终点，然后目测标准溶液消耗体积，计算分析结果，但是手工与目测存在着很大的主观性且误差较大。二十世纪中叶电位滴定法、银量法、用光度法、分光光度法即：通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法，而就目前的分析水平来讲，相色谱法是最为高效和科学的方法，也是目前应用在本行业最为广泛的方法。对于一般现用农药的分类见表2.
表2 生物农药分类
五、具体样本分析
1.残留量分析案例
取准备好的蔬菜10克，放置在带盖的离心管中，之后加入五毫升无水硫酸钠进行简单的组织脱水，脱水工序之后在离心管中加入适当的农药分析丙酮正乙烷混合液，适当搅匀，放置到超声波提取器中做提取工作十分钟左右，十分钟后以滴管深入上层汲取液体样本，将样本滴入到烧杯内，之后再加入无水硫酸钠进行脱水，对于样本不充足的情况可以采取在样本残渣中不断加入混合液进行提取知道提取足量。
2.原药制剂分析（10%吡虫啉）
（1）介绍。吡虫啉是烟碱类超高效杀虫剂，具有广谱、高效、低毒、低残留，害虫不易产生抗性，对人、畜、植物和天敌安全等特点，并有触杀、胃毒和内吸等多重作用。害虫接触药剂后，中枢神经正常传导受阻，使其麻痹死亡。产品速效性好，药后1天即有较高的防效，残留期长达25天左右。药效和温度呈正相关，温度高，杀虫效果好。主要用于防治刺吸式口器害虫。
（2）质量测定步骤。随机从包装中取出样品源，从中取出100克药剂。试样用甲醇溶解，以甲醇+水为流动相，使用NovapakC18、5μm为填料的色谱柱和可变波长紫外检测器，通过分离手法进行检测。
抽取样本后，取0.1克样品滴取到容量瓶中，加入甲醇溶液稀释，手工摇均匀 ，摇摆均匀后提取溶液5毫升到新容量瓶中定容。在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻两针吡虫啉峰面积相对变化小于1.5%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。
之后进行计算，计算公式：x1=（A2・m1・p）/（A1・m2） 其中：
A1――标样溶液中，吡虫啉峰面积的平均值
A2――试样溶液中，吡虫啉峰面积的平均值；
m1――标样的质量，单位为克（g）；
m2――试样的质量，单位为克（g）
p―― 标样中吡虫啉的质量分数，单位为百分数（%）
通过计算，一次测试计算吡虫啉为10.22%浓度，二次测试为10.16%浓度，经过平均后，吡虫啉浓度为10.19%浓度。
六、结语
就我国的农药应用现状而言，农药残留愈来愈严重，而由此害虫的免疫机能也愈加增强，这就陷入了一场无尽的竞争中，也同时制造了一场食物链的恶性循环，由于害虫免疫力增强所以加重农药浓度在很多农药制造工序中体现出来，而把握能力的欠失又造成了残留量的加重，在这种情况下检测力度的加大势在必行，不仅仅体现了科学性的分析，另一方面也着眼于人类的健康生活，本文通过对液相色谱仪的应用进行分析，对具体参数、流动相、进样量等进行描述，旨在技术检测部门严格把关，为农药检测做出贡献。
参考文献：
高效液相色谱范文第4篇
[关键词]高效液相色谱法、色谱柱、检测器、矫正
中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）11-0365-01
高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、重现性好、准确度和灵敏度高等优点，其应用范围之广，是其它分析仪器所不能比拟的。随着仪器的普及和蒸发光散射检测器、质谱检测器的商品化，本法已成为生药含量测定的首选和主流方法。
1.对仪器的一般要求
（1） 色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。
填充剂的性能以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在15nm以下的填充剂适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填充剂。
以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相。当pH大于8时，载体硅胶会被溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用 pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。这些特殊的色谱柱已有商品供应。
（2） 检测器最常用的检测器为紫外检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关。示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关。二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱测定和色谱峰的纯度检查。
紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。
不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至少符合紫外 - 可见分光光度法对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。
（3） 流动相 可采用固定比例（等度洗脱）或按规定程序改变比例（梯度洗脱）的溶剂组成作为流动相系统。由于C-18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。
2.系统适用性试验
色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。
通常用规定的对照品对色谱系统进行系统适用性试验。
（1） 色谱柱的理论板数（n）在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位） 和半高峰宽（Wh/2），按n=5.54（tR/W h/2）2计算色谱柱的理论板数。
（2） 分离度 （R） 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。
（3） 重复性取对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。
（4） 拖尾因子（T）为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合相关规定。
3.测定法
（1） 内标法加校正因子测定供试品中某个成分含量精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照品溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：
校正因子（f）=式（3-8）
式中As为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；CS为内标物质溶液的浓度；CR为对照品溶液的浓度。
再取含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：
含量（Cx）=f×式（3-9）
式中Ax为供试品峰面积或峰高；Cx为供试品溶液的的浓度；A′s为内标物质的峰面积或峰高；C′s为内标物质的浓度。f为校正因子。
当配制校正因子测定用的对照品溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量同一浓度的内标物质溶液时，Cs=C′s，则配制内标物质溶液不必精密称 （量）取。
（2）外标法测定供试品中某个成分含量 精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图。
由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某成分含量时，以定量环或自动进样器进样为好。
（3）面积归一化法 是测量色谱图上某色谱峰和除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算某色谱峰占总面积的百分率。该法通常用于对照品纯度的检查。
参考文献
高效液相色谱范文第5篇
高效液相色谱法是药物分析的重要方法之一，也是中药制剂分析课程中一项实践性很强的教学内容，其中如何更好地使用高效液相色谱仪进行实验教学，提高学生的自主学习能力以及科研创新能力显得极为重要。在传统高效液相色谱课程教学的基础上，以研究问题为中心，开设综合性、设计性的实验，由浅入深的进行了与高效液相色谱相关的实践教学改革。在激发学生的科研兴趣以及提升大型仪器实验教学的整体质量和水平方面，取得了良好的效果。
关键词：
高效液相色谱；设计性；综合性；实验教学
随着科学技术的突飞猛进和国家经济建设的快速发展，高效液相色谱作为一种重要的分离分析技术，需求和应用越来越广泛[1]。国家对高等教育的投入日益增大，高校的办学规模、教学质量和基础设施建设都有了明显的改善和提高[2-5]，同时对实验设备的经费投入也逐年增加，各高校也相继添置了大量大型仪器设备，实验教学和科研条件都有了极大的改善。其中在药学相关专业中应用最广、使用频率最高的是高效液相色谱仪。针对如何充分利用现有仪器，如何有效的提高大学生运用大型仪器进行科学研究的自主创新能力，以及建立系统的、渐进的实践教学新体系成为当前高校实验教学的主要目标。高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChro－matography，HPLC)技术始于20世纪60年代末期，是以气相色谱和经典液相色谱法为基础的新型分析技术[6]。高效液相色谱具有分辨率高、速度快、分析精准等优点，从而使其在药物分析研究中对于物质的分离和分析占据越来越重要的作用，成为目前医药行业研究中的一种重要分析手段，也是各大高等学校药学等相关专业药物分析课程中的一个重点内容。近年来，由于素质教育的提出社会的需求不仅仅看重学生的知识及学习能力等，对学生的实际动手能力更是越来越看重，这使得实验教学的重视程度提高到了一个新高度，尤其是高效液相色谱仪等大型贵重仪器的理论及实验教学引起了各高等学校的普遍关注和高度重视[7]。在HPLC的实验教学方面，许多高校由于设备条件、实验室经费以及实验技术人员水平等方面的限制，使HPLC的实验教学受到较大的影响，只能做简单的演示实验，本科生基本没有个人接触、操作相应的实验设备的机会。
为改变这一现象，我校实验教学中心从实验设备、人员配备及教学内容与方法等诸多方面对高效液相色谱的实验传统教学做了改进。以研究问题为中心，开设相关专业的综合性的，自主设计性实验选修课及设计性实验，不仅能够让学生独立思考、设计实验以及处理问题，还能够让学生真正的操作运用该仪器并熟练的掌握。实践表明，新的实验教学方式使得学生能够全面地了解实验的内容，使学生能够根据实验数据结果对自己的进一步研究做出相对比较合理的判断与推理，为学生在创新课题的申报及毕业实习打下了良好的基础。
1高效液相简介
高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点：①高压；②高效；③高灵敏度；④应用范围广；⑤分析速度快、载液流速快。高效液相色谱法按分离原理可分为离子色谱、吸附色谱、分配色谱、亲和色谱、体积排阻色谱[8]。根据两相极性差异，又可将其分为正相色谱与反相色谱。高效液相色谱法是目前应用最为广泛的方法，也是药物分析及实验教学中最常采用的方法，其中最为常用的是反相高效液相色谱法，即采用极性流动相和非极性固定相对样品进行分析的方法。高效液相色谱仪主要包括进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等五大系统。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等。
2高效液相色谱实验在传统的实验教学中存在的问题
高效液相色谱法是分析分离混合物最有效的方法，被广泛应用于各个领域，在医药学领域更为看重，占据药物分析的主导[9]。高效液相色谱相关课程的理论性和实践性很强。相对于一般的色谱实验该仪器分析理论性相对较抽象，仪器结构更加复杂，并且在其理论的学习中涉及的相关学科较多。在该仪器的实践教学方面，首先是目前在实验教学方面教育教学方法比较单一，具体以教师的传授-强化-记忆的过程为主的填鸭式的传统教学，即“以教师为中心”的教师讲学生听。这种教学模式不利于培养适合当今快速发展的科学技术人才，也不能培养具有创新精神和实践能力的人才，难以保证教学的质量与效率；其次是理论课程的教学与实际实验的相脱节，仪器分析实验在诸多高校里的实验课程多数是以演示型或验证型实验为主，从而学生只要按实验讲义的内容按部就班的进行实验，不必也不会主动的利用理论课堂的知识来完成实验，其结果是学生动手不动脑，时间一久也就对接触到的仪器相关知识忘记的一干二净；再有目前各大高校在实验教学方面仪器较少，相关仪器的教学课程也相对较少，因此学生接触的机会也就相对较少。并由于学校的扩招，每个实验组的学生人数大约二十几人，造成学生多仪器少的现象，因而不利于每个学生亲自动手学习。同时也会使一些较为懒散的学生产生能不做就不做的想法，这样的仪器分析实验课则会变成“参观仪器”；最后因分析仪器的更新在很短的时间内就有很大的突破，而HPLC的使用与功能的开发和科研结果有着非常密切的关系，HPLC的教学体系未能跟上分析仪器的发展，因此HPLC仪器基础理论教学和实验教学急待完善、充实、深化与提高[10-12]。
3高效液相色谱实验在实验教学中的应用与改革
目前很多高校内都置办了诸多的大型仪器设备，如高效液相色谱仪这类大型的精密仪器，如何让学生接触并且掌握其原理和使用方法，开设实验课则变成了整个过程的关键。但传统教学中往往是学生按照实验讲义的具体步骤做，只是动手不动脑。如何让学生完成该从文献调研、实验设计、复杂样品前处理、柱子与流动相的选择，方法学的考察，结果分析等环节建立完整的仪器的使用与研发，提高学生的科研创新能力是目前各大高校急需解决的一个问题。我校实验教学部根据现有的设备提出了高效液相色谱实验的设计内容，针对传统仪器分析实验的“实验技术路线及方案固定、实验结果已知或固定、规定有限的时间内完成”教学模式。提出以“解决实际问题为中心，开设综合性、设计性实验”，从而有效的提高学生运用现代大型仪器进行科学研究的科研创新能力。为了让同学们充分了解高效液相色谱的相关知识及熟练掌握其操作，我校安排了设计性的实验，其相关步骤内容如图1。为了抓好学生操作的规范性，注重实验过程。实验过程划分为四个部分:系统适应性实验、方法学考察、样品测定、仪器操作及报告：系统适应性实验考核的内容是基本的理论参数概念，诸如理论板数、分离度、拖尾因子等，要求学生通过实验得出的色谱图，计算出其各内容的相关数值，从而加深对HPLC系统适用性的认识与理解。方法学考察分别从线性范围试验、精密度实验、加样回收率实验、稳定性实验和重复性实验等方面考核标准曲线方程、相关系数、线性范围等，这部分实验经过老师指导分析后开始，由学生以小组为单位讨自主设计具体的实验方案。首先通过对样品的前处理、配制对照品溶液、按照已设计的线性范围方案稀释对照品、样品经微孔滤膜过滤后进样、仪器数据处理的峰面积、求出标准曲线方程、相关系数、线性范围；精密度实验，该实验主要考察了学生对精密度概念的理解和掌握；加样回收率试验，在老师的指导下由学生自主设计，采用诸多科研文献的方法设计高、中、低的浓度进行实验。根据线性范围确定中间浓度，比如已确定的线性范围是10~100μg，则其中间浓度设定为50μg，本底值的确定按照《药典》规定：本底与加入的比例1∶1确定样品的本底值，再根据线性范围确定各浓度的加入值；样品的测定实验考核的是学生根据数理统计学对数据的处理和计算，已达到对数据处理的规范性与合理性。而仪器操作及报告部分考核的是学生对实验的预习以及查阅相关的文献资料，再有就是实验过程中的记录和实验报告部分，规范其记录的内容和形式，从而强调原始记录的重要性。通过这四部分考核，要求学生注重实验的具体操作过程，在实验中培养学生严谨的逻辑思维和使用HPLC仪器的方法。
3.1具体的实验-HPLC法测定复方丹参滴丸中丹酚酸B的含量
3.1.1实验目的的确定和方向的选择目前《中药制剂分析》实验课程在高效液相色谱教学中选取的供试品多为原药材，改革后实验选取的待测样品是现代中药制剂新剂型的成药制剂复方丹参滴丸，复方丹参滴丸(FufangDanshenDiwan)是根据《中国药典》2010版一部复方丹参片的处方，在现代高科技条件下提取丹参、三七的有效成分再加入适量冰片而制成的新型纯中药滴丸剂，其药理作用为活血化瘀，理气止痛，用于气滞血瘀所致的胸痛，心前区刺痛，临床上用于治疗胸中憋闷、心绞痛。随着研究的深入，复方丹参方的物质基础及作用机制也逐渐明晰，其主要成分是丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R、龙脑、异龙脑等。在2010版《药典》中对复方丹参片和复方丹参颗粒的含量测定都有关于丹酚酸B的方法，但是对于复方丹参滴丸中相关含量测定却没有提到丹酚酸B的测定[13]，现代药理研究表明丹酚酸B是丹参水溶性物质中活性最强的成分，具有抗氧化、清除自由基、抑制细胞凋亡等多方面的药理作用，同时对心、脑、肝、肾等多个器官具有保护作用[14]。因此建立可行的分析方法用于测定复方丹参滴丸中丹酚酸B的含量具有重要的意义，选择这个实验用于高效液相相关的实验教学改革，对我校学生的综合能力、创新能力和独立思考能力及交流合作能力的培养都将会有非常大的帮助。
3.1.2实验方案的确定以及实验内容的安排在老师的指引下，由学生和老师共同探讨确定实验的方向，提出相关的问题。让学生带着问题查阅一定的文献资料，初步建立实验方案；接着在老师的监督下以小组为单位进行相互的讨论，总结查阅文献和整理过程中的一些问题，及提出一些自己的见解，在老师的指导下建立初步的实验方案；随后让学生带着未解决的问题查阅相关资料，进行第二次讨论，最后确定最终实验方案。最后确定的实验流程见图2。
3.1.3实验具体内容
3.1.3.1实验的前期准备查阅相关文献资料，设计试验方法，准备试验所需仪器与试剂和药品。Softa单泵液相色谱仪，紫外检测器；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为超纯水。复方丹参滴丸（天津天士力公司）；丹酚酸B对照品。
3.1.3.2液相条件的选择流动相和测定波长的选择：经查阅文献参考流动相有以下几种，甲醇-乙腈-甲酸-水=30∶10∶1∶59、甲醇-0.2%磷酸水溶液=40∶60、乙腈-0.05%磷酸水溶液=25∶75；测定参考波长为280nm、283nm、286nm；流速1.0ml/min，柱温室温。参考以上条件选择最佳的流动相和测定波长。最后确定最佳的流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液=25∶75，最佳波长为280nm，柱温为室温。
3.1.3.3供试品提取条件的选择选择提取溶剂：纯甲醇、75%甲醇、50%甲醇、水；提取方法：纯加热回流、超声处理（功率300w，频率50khz）；提取时间：20min、30min、40min。对以上条件做正交试验，选取最佳供试品提取条件为75%甲醇超声处理，提取时间为30min。
3.1.3.4对照品和供试品溶液的配制准确称量对照品1mg于10ml容量瓶，用75%甲醇溶解并定容至刻度，配制成0.1mg/ml的对照品溶液；准确称量0.2g的复方丹参滴丸样品，于25ml容量品，加大约20ml75%甲醇，密塞，超声提取30分钟，放冷，定容得供试品溶液。对照品与供试品的色谱图见图3。
3.1.3.5方法学考察a.线性范围考察：分别用手动进样器进5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、125μg/ml、250μg/ml的对照品溶液20μl，记录色谱图，以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，做线性回归。进样量在0.050~0.250μg范围内与峰面积呈良好线性关系，得到的线性方程为Y=10440X-67963，其R2=0.9999.（n=6）b.精密度试验：取同一对照品溶液，连续进样6次，每次20μL，记录丹酚酸B的峰面积，计算RSD值。最后得丹酚酸B峰面积的RSD值为0.53%。c.重现性试验：取复方丹参滴丸供试品溶液，连续进样6次，每次20μl，记录供试品中丹酚酸B的峰面积，计算RSD值为1.06%。d.稳定性实验：取供试品溶液，每隔2小时进样一次，共测定6次，峰面积RSD=0.91%（n=6），结果表明，样品溶液在12h内稳定，故用于实验教学是一个较为合理的选择。e.加样回收率实验：准确称取已知丹酚酸B含量的样品9份，分别加入高、中、低量的对照品各3份，测定溶液中丹酚酸B的含量，计算回收率。
3.1.3.6样品含量的测定取复方丹参滴丸样品溶液3份，平行测定其含量，求取平均值，最后得复方丹参滴丸中丹酚酸B的含量为0.36%。
3.1.4实验结果汇总实验完成后，老师组织参与实验的同学进行实验汇报，总结交流心得，并以PPT、实验报告等形式上交实验结果，同时记录在整个实验过程出现的问题、心得以及体会，规范实验记录的内容和形式，强调原始记录的重要性。通过对实验结果的总结和分析，培养学生严谨的逻辑思维以及分析问题、解决问题的能力。
4结语
以研究问题为中心，开设综合性、设计型实验，提高本科生的科研创新自主学习能力。结合高效液相色谱实验，教会学生“提出问题分析问题解决问题”的系统学习方法，培养学生系统全面的分析解决问题的能力；培养相关专业学生的使用高效液相色谱仪的实践动手操作能力，使学生在进入实习后可以独立操作高效液相色谱仪；通过总结分析实验结果，提高学生的分析问题及解决问题的能力，并且定期在全校范围内开展与高效液相色谱仪的相关汇报与学习交流，形成浓厚的学术交流气氛。通过本项实验教学改革，使得高效液相色谱仪在我校能够物尽其用，充分发挥我校培养高素质、高技能人才的作用，提升我校毕业学生的就业竞争力。
参考文献
[1]陈立仁，蒋生祥.高效液相色谱基础与实践[M].北京：科学出版社，2001：4-6.
[2]阮慧，李五一.大型仪器共享管理的实践与探索[J].实验技术与管理，2010，27(9):6-8．
[3]程宝晶，徐良梅，李仲玉，等.大型仪器开放共享的探讨[J].实验室研究与探索，2010，29(7):334-335．
[4]卞宁生，徐铮，李翔，等.教学型大型仪器实验室资源共享平台的构建与管理[J].实验室研究与探索，2009，28(3):288-290．
[5]刁叔钧.高校大型仪器设备共享管理机制的探讨[J].实验技术与管理，2010，27(7):194-196．
[6]王强.高校计算机实验室管理模式初探[A].创新源于实践[M].武汉：华中科技大学出版社，2006：44-47.
[7]张新铭.实验室管理模式的改革与实践[J].重庆大学学报，2001，5:172-173.
[8]盘炜生.计算机实验教学示范中心建设的实践与探索[J].装备制造技术，2007，3:105-107.
[9]徐仲玉，马红梅，吕霞，等.高效液相色谱法的实验教学探讨[J].实验科学与技术，2008，1672-4550.
[10]陈丽华.通过实验教学提高学生的综合素质[J].实验室研究与探索，2003，22(3):12-13．
[11]谢友宝.大型综合性创新实验设计研究[J].实验室研究与探索，2005，24(12):70-71．
[12]李少玲.实施开放实验提高学生素质[J].实验室研究与探索，2006，25(12):1569-1570.
[13]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:中国医药科技出版社，2010:904-907.
