细胞分化范文第1篇

【关键词】脐血间充质干细胞　脂肪细胞　诱导分化

1 引言

间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs) 于1976年由Fridenshtein首次发现，是一种具有多分化潜能的成体干细胞，存在于人类等生物的骨髓等组织中， 具有向骨、软骨、脂肪、神经元和肌肉及肌腱等组织分化的潜能［1，2］。研究发现脐血中含有MSC，与骨髓间充质干细胞具有相同的多向分化和造血支持功能[3，4]。脐血间充质干细胞与其他来源的干细胞相比具有免疫原性弱， 来源广泛， 采集方便，更强的增殖能力和无伦理问题等诸多优点。目前脐血间充质干细胞作为多种疾病治疗的细胞来源，在临床应用方面具有广阔的前景。我们的实验分离培养脐血MSCs，并向脂肪细胞转化的研究，了解MSCs诱导分化前后的生物学特征，为组织工程研究方面奠定实验基础，为骨质疏松、代谢综合症等疾病的发病机制提供细胞模型。

2 材料和方法

2.1 材料

所有脐血取自解放军401医院妇产科，征得病人及其家属同意。低糖型DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清(FBS) 购自杭州四季青生物工程公司；1-甲基-3-异丁-2黄嘌呤（IBMX）、地塞米松和胰岛素、Percoll 分离液、油红O染料购自上海化学品采购公司。CD44、CD34单克隆抗体购于Neomarker 公司。

2.2 方法

2.2.1 脐血MSCs的分离培养

参照国外[4]成熟分离方法，在无菌条件下抽取脐血3ml，肝素抗凝后与3mlPBS混匀，然后按1：1的比例缓慢加入3ml的percoll淋巴细胞分层液(1.073g/ml)中，2000转/min离心10分钟，取白膜层，PBS冲洗稀释后1000转/min离心10分钟，共2次。离心后的沉淀细胞加入5%FBS的LG-DMEM 制成单细胞悬液后接种于培养瓶中， 37℃，5%CO2培养箱下培养，24h细胞贴壁，呈圆形形状生长。72小时后细胞呈纺锤形或多角形，每2-3天换液1次，当细胞汇合85%时胰蛋白酶消化按1∶3比例传代。第3～4代以后， 细胞形态开始比较均一。

2.2.2 脐血MSCs透射电镜样本制备

取第3代脐血MSCs制成单细胞悬液，2.5%戊二醛固定，4℃过夜。PBS洗涤，1%锇酸固定，梯度乙醇脱水，环氧丙烷浸透，Epon812包埋并聚合，常规超薄切片。醋酸双氧铀及枸橼酸铅双染色。透射电镜下观察。

2.2.3 MSCs细胞向脂肪细胞的诱导培养

我们配置了含1-甲基-3-异丁-2黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰岛素、和胎牛血清的培养基诱导液诱导脐血MSCs向脂肪细胞分化。6孔板每孔接种1×106个细胞，标准培养基培养24 h后换成脂肪诱导基质(含10%FBS，1μmol/L地塞米松， 10μg/ml胰岛素，0.5mmol/L IBMX)，每3d换液1次。油红O为特异性的脂质结合剂，在第3周时来检测脂肪沉积。PBS液洗涤诱导后细胞，10%中性缓冲甲醛固定20～30min，60%异丙醇漂洗去除多余染液，蒸馏水冲洗10min。光镜下观察，随机抽取计数10个非重叠视野(×100)，计算脂肪细胞占细胞总数的比例。结果用均数±标准差(x-±s) 表示。单纯的LG-DMEM培养，每3～4d换液。

3 结果

分离脐血得到的白膜层接种到培养瓶中在第2～3天时贴壁，两端有较长突起，胞核椭圆形，细胞增殖生长， 形成集落，起初生长缓慢，2周左右达到90%汇合。细胞形态呈现多元化，有的呈小圆形、星形，有的体积较大有多个核，多数在传代后死亡，形态与骨髓间充质干细胞相似，随培养时间延长，细胞体积逐渐增大伸展。

图1 第3代的脐血MSCs 图2 第3代脐血MSCs电镜结果

3.1 脐血MSCs的鉴定

在透射电镜观察胞核类圆形，核仁明显核膜有核袋及核突，有些细胞呈现1～2个核仁，在核膜周围有染色质排列。胞质中有多量的粗面内质网、线粒体、微管等。贴于盖玻片表面的细胞呈长梭形突起较长，细胞表面有微绒毛。

3.2 诱导组与对照组结果

第3d诱导组中可观察到脐血MSCs的由扁平渐收缩变小，圆形胞体外形成突起，细胞逐渐变成圆形（图2），胞突起逐渐变圆钝，胞浆内出现类似脂滴样物质。第7天后高折光性的脂滴沉着细胞数目逐渐增多，第20d油红O染色示胞核呈蓝色， 脂滴呈橙色（图3），绝大多数脂肪细胞的脂肪颗粒充满整个细胞。而对照组的MSCs培养8d时，大部分细胞依然是脐血MSC长梭样形态特点，油红O染色阴性结果。

图3 油红O染色脂肪细胞

4 讨论

本实验联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法，并在此基础上采用单克隆培养法来分离、培养脐血MSCs， 使获得的hMSCs尽可能为同源细胞，从而提高其纯度[5]。经密度梯度离心后获得的MSCs贴壁生长，形态呈梭形，具有形成成纤维集落的能力[6]。在特定环境脂肪诱导过程中，细胞形态、结构和功能均发生了显著变化。诱导7d细胞形态开始由成纤维样梭形细胞变为圆形突起或多角形细胞，至20d时细胞体积增大，胞内出现高折射率的脂滴，呈脂肪细胞样细胞表现。

脐血间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞的研究领域较少，随着临床组织工程医学的兴起， 脐血间充质干细胞作为种子细胞具有生物学特性和来源的多样化，尤其是脐血来源的间充质干细胞具有分离简单、低免疫原性、无伦理性等很多优点已成为研究热点。目前越来越多的证据表明，骨髓脂肪细胞和成骨细胞表型间存在相互转化的关系，抑制骨髓脂肪细胞生长成为预防骨质疏松的有效途径，骨髓脂肪细胞则被视为骨质疏松症防治的靶细胞，利用脐血MSCs 作为种子细胞定向诱导分化为脂肪细胞， 有助于深入探讨其诱导分化机制，同时也为骨质疏松治疗提供自体细胞来源。

参 考 文 献

[1] Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC．et a1．Muhilineage　potential of adult human mesenchymal stem cells[J]．Science，l999，284(54l1)：l43．

[2] Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，el al．Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult　marrow［J］．Nature，2002，418(6893)：41．

[3]Kuznetsov SA，Mankani MH， Gronthos S，et al. Circulating skeletal stem cells[J] . J Cell Biol， 2001，153 (5) :1133-1140.

[4] Rosada C，J ustesen J，Melsvik D， et al. The human umbilical cord blood :a potential source for osteoblast progenitor cells[J] . Calcif Tissue Int，2003，72 (2) :135-142.

细胞分化范文第2篇

[关键词] 骨髓间充质干细胞;神经干细胞；成纤维细胞生长因子;表皮生长因子;全反式维甲酸;骨形态发生蛋白-7

[中图分类号] R329.21；R329.24 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7562（2008）02-0102-04

Study on the culture and differentiation of bone marrow stromal cells fromrats

YU Hai-liu1，JIANG Zan-li2，MAO Zu-bin2

（1.School of Clinical Medical Science,Southeast University，Nanjing 210009,China;2.Department

of Orthopaedics,Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China)

Abstract:Objective To investigate the isolating and culturing methods of rat bone marrow stromal cells（BMSCs）in vitro and to study whetherBMSCs could be induced to differentiate into neural stem cells（NSCs）and neurons by basic fibroblast growth factor（bFGF）,epidermal growth factor(EGF）,all-transretinoic acid（RA）andbone morphogenetic protein-7（BMP-7）.MethodsAdult marrow stromal cells were cultured from bone marrow of four week-old SD rats.bFGF+EGF+RA(group A)and BMP-7(group B)were used to induce the third-generation BMSCs,and contrasted with the cells that had not been induced.Phase contrast microscope was used to observe the differentiation of BMSCs daily.Immunohistochemistry technique was used to identify the differentiated BMSCs with neuron specific enolase（NSE).Results After seven days of culture,some BMSCs in grupe A appeared typical morphological neuronal traits.Cell bodies appeared refractile,cone-like or spherical with long processes,NSE was expressed in group A.The cells in group B and group C still had no NSE expression.Conclusion Combination of bFGF,EGF and RA can induce BMSCs to differentiate into NSCs and neurons,and can regulate the differentiation and promote the maturation of neurons.But BMP-7 can not induce BMSCs to differentiate into NSCs and neurons at this condition.

Key words:bone marrow stromal cells;neural stem cells;fibroblast growth factors;epidermal growth factor;all-transretinoicacid;bone morphogenetic protein-7

(Modern Medical Journal,2008,36:102-105)

神经系统损伤后的修复是困扰神经科学的一大难题,神经干细胞(NSCs）的发现和移植治疗为解决此难题提供了一条新的途径,并成为近年来的研究热点。然而,传统的胚胎来源和脑来源的NSCs由于取材困难,并受伦理道德的约束,使其应用受到极大的限制。骨髓间充质干细胞(BMSCs）具有多分化潜能,可以在体外诱导生成骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞和神经元样细胞[1] 。因此,使用诱导BMSCs生成的NSCs治疗神经系统的变性、外伤或遗传性疾病将成为可能。而寻找和探索恰当的细胞因子和培养条件,将BMSCs诱导分化成合适的神经前体细胞,是神经细胞移植的前提条件。本研究以SD大鼠为实验对象,观察BMSCs 体外培养的生长行为，探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、全反式维甲酸(RA)联合及骨形态发生蛋白-7（BMP-7）在体外对BMSCs向NSCs和神经样细胞分化的诱导作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

出生4周SD大鼠(雌雄不拘),体质量150g左右,由东南大学医学院实验动物中心提供。低糖DMEM培养基、胎牛血清(FCS)、BMP-7、EGF、bFGF、RA、神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体均为SIGMA公司产品。SABC试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂为武汉博士德公司产品。

1.2BMSCs的培养和纯化

取SD大鼠1只,100g•L-1 水合氯醛麻醉后体积分数75%乙醇浸泡3 min,于超净工作台上严格无菌条件下取大鼠双下肢,剪除软组织,留取股骨和胫骨。将骨骺端剪去,暴露两端骨髓腔,使用5ml注射器抽取DMEM培养液反复冲洗骨髓腔,冲洗液收集于无菌离心管中,1000 r•min-1 离心5min 。弃去上清液,加入体积分数20%血清培养液,充分吹打至单细胞悬液,调细胞浓度为4×108个•L-1,接种于培养瓶中。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。4d后全量换液,去除未贴壁细胞。以后每3d换液1次,待细胞长至80%～90%融合后,用含0.25 g•L-1 胰酶的消化液消化,以细胞密度4×108个•L-1 接种传代。

1.3诱导和分化

传至第3代MSCs按1×104个•ml-1浓度接种于6孔板中,培养液改用DMEM加20%胎牛血清,待细胞融合达90%后,分为A、B、C3组。预诱导24h后，A组加入EGF、bFGF和RA联合诱导剂（终质量浓度为300ng•L-1），B组加入BMP-7诱导剂（质量浓度为20μg•L-1），C组不加因子继续培养。倒置显微镜逐日观察细胞形态变化。

1.4细胞免疫组化染色及观察

3组细胞诱导培养后第7天,调细胞浓度为4×108个•L-1,分别将3组细胞接种入24孔培养板,每孔0.5ml,贴壁24h后40 g•L-1多聚甲醛固定,分别进行NSE免疫组化鉴定,DAB显色,倒置显微镜下拍照记录,细胞浆呈棕黄色者为阳性细胞。

2 结 果

2.1 BMSCs 的培养扩增

初接种的细胞种类较多,大部分呈圆形。接种24h后可见部分大圆形单核细胞贴壁,骨髓中的造血干细胞不会贴壁,可在每次换液中逐渐清除掉。原代培养36～48h后贴壁的单核细胞开始增多,但仍保持圆形。72h后细胞开始增殖迅速并出现多种形态。大多数细胞呈梭形并带有2～3个长的突起,细胞核较大,扁圆形,可见1～2个核仁。少部分细胞呈不规则形,形态多样,胞体大,胞核为圆形或椭圆形,有多个核仁,胞浆可向不同方向伸出突起,细胞集落间相互融合成单层,排列具有一定方向性。细胞倍增时间约为7～10d,刚经传代的BMSCs 呈圆形,迅速贴壁、伸展,重新变为梭形细胞（图1A）。传代培养的细胞比原代细胞增殖速度加快,但也存在1～2d 的潜伏期,第3～6d是细胞快速增殖期,9d后速度减漫,进人平台期。反复换液和传代培养去除非贴壁细胞,至第3代的BMSCs形态基本单一，呈梭形或扁平形,增殖至细胞融合时,倒置相差显微镜下观察呈漩涡状排列（图1B）。

2．2BMSCs 的诱导分化

A组细胞经诱导3d后可见转化的细胞增殖分裂成小圆形,呈团簇状半悬浮状态。对这些细胞进行连续观察,发现其胞体逐渐增大,并有突起逐渐伸出、延长,诱导7d 后可见大量具有2个或多个突起的细胞,胞体呈大多角形或不规则形,类似于神经元和胶质细胞形态,折光性较强,细胞突起间相互连接成网状,可见细胞核和核仁（图1C）。B组和C组细胞诱导后未出现类似变化，仍为典型的成纤维细胞形态。

2.3BMSCs 的诱导分化后免疫细胞化学检测

A组诱导3d后NSE免疫阳性细胞有少量表达,诱导7d后NSE阳性细胞数增多,NSE阳性细胞占BMSCs 总数的比率为(14.74 ±3.50)%；B组和C组无NSE阳性细胞。

3讨论

近年来的研究表明，BMSCs可向神经类细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、网状细胞、脂肪细胞等方向分化[2-3] 。但由于BMSCs 在骨髓中的存在率仅为0.1%,其在自然状态下大多向成纤维细胞方向分化,向神经细胞方向分化的比例非常低[4] 。因此,必须在体外进行培养扩增,并寻找高效的诱导方案。本实验采用密度梯度离心法，利用BMSCs易黏附塑料的特性,经过换液和传代,分离BMSCs。同时通过不同的诱导条件,对BMSCs 进行诱导分化。研究发现,添加不同的诱导剂,可诱导出不同比例的神经样细胞。bFGF的作用广泛而复杂,能维持由EGF激发的NSCs的存活及增殖,有诱导NSCs向神经元分化的作用,并可维持神经元和神经胶质细胞的存活,诱导神经元合成神经特异性基因(SCG2100)产物和乙酰胆碱转移酶,并能促进交感神经和副交感神经的轴突生长,具有丝裂原样作用[5-6]。EGF是有丝分裂的促进因子,其作用没有种属特异性,对NSCs分裂有促进作用,可诱导NSCs向星形胶质细胞分化,促进神经元轴突的延长和维持神经元的存活[7]。RA是维生素A的衍生物,能够明显增加神经细胞的数量并呈剂量依赖效应,能调节对EGF有反应的NSCs分化,增加神经元细胞和星形胶质细胞的合成[8]。BMPs是转化生长因子超家族的一员，在骨的发育和结构维持方面发挥极其重要的作用。最新的研究显示，BMPs在一定因素下具有诱导干细胞向神经细胞分化的作用[9]。

本实验结果表明,从成年大鼠骨髓中分离得到的BMSCs,可在体外扩增得到大量分化潜能稳定的子代细胞,为下一步BMSCs 移植治疗奠定了基础。应用全骨髓贴壁筛选培养法,BMSCs于接种后1h即开始贴壁,72h完全贴壁,3～4d后进入对数增长期,14d左右即长满培养瓶壁。消化传代细胞接种后无增殖潜伏期,可于1周内再次长满瓶壁。传代后的细胞形态无明显变化且性质稳定。该方法简单高效,易于掌握和推广。bFGF、EGF和RA联合诱导3d后部分BMSCs 可转变为神经元样细胞,出现轴突和树突样结构,且多个神经元间可形成网络连接。诱导7d后鉴定结果显示该细胞有神经元标记物NSE表达。而应用BMP-7在此种诱条件下诱导BMSCs，形态上未见向NSCs分化的倾向，免疫组化结果显示未见神经元标记物NSE阳性细胞。对照组亦无阳性细胞出现。

本研究结果显示，经过EGF、bFGF和RA的联合诱导,BMSCs在形态学上呈神经元样细胞形态,细胞突起增多,折光性增强,且分化的细胞表达神经元细胞的特异性标记NSE，说明EGF、bFGF和RA可联合诱导BMSCs分化为神经元样细胞。文献报道β-巯基乙醇的诱导作用快且强,但分化后细胞存活时间过于短暂,2h 即有细胞漂浮,6h大部分细胞溶解、死亡,实际应用价值并不大[10]。本研究诱导的神经元样细胞出现较迟,72h才有形态学改变,7d大部分细胞仍能存活并可表达神经元细胞的特异性标记,经多次换液和传代细胞仍较稳定,说明本研究采用的诱导分化系统不仅成功诱导分化出神经元样细胞,且分化细胞寿命远大于目前文献报道,多次传代后细胞形态和性质稳定,为今后开展NSCs 移植研究奠定了实验基础。而在此种诱导条件下用BMP-7诱导BMSCs未见有向神经细胞方向分化的倾向，考虑可能为诱导条件不适宜，尚需进一步摸索诱导条件，本课题组考虑能否用BMP-7基因转染等方法诱导BMSCs向NSCs方向分化，此尚需进一步研究。

目前,在体内或体外拟诱导NSCs特异地分化为特定表型的神经元尚有一定困难,随着对细胞因子在NSCs增殖分化过程中作用的进一步研究和与基因调控手段的结合,有望能精确地控制NSCs向功能神经细胞分化的比例,对NSCs移植治疗中枢神经系统疾病有重大意义。

[参考文献]

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[3]Prockop D J.Marrow stromal cells as stem cells for continual renewal of nonhematopoietic tissues and as potential vectors for gene therapy [J].J Cell Biochem,1998,30-31（Suppl):284-285.

[4]Jiang Y,Jahagirder B N,Reinhant R L,et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived frommarrow [J].Nature,2002,418(6893）:41-49.

[5]Sieber-Blum M,Zhang J M.Growth factor action in neural crest cell diversification [J].J Anat,1997,191(Pt 4）:493-499.

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[8]Li M,Pevny L,Lovell-Badge R,et al.Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection [J].Curr Biol,1998,8（17）:971-974.

[9]Phinney D G,Isakova I.Plasticity and therapeutic potential of mesenchymal stem cells in the nervous system [J].Curr Pharm Des,2005,11(10):1255-1265.

细胞分化范文第3篇

摘要：目的 探讨在体外培养条件下人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化。方法 用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含50mL/L FBS，1×ITS，4.7mg/L亚油酸，10-4mol/L 2磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养，并以FGF4(100μg/L)、HGF(20μg/L)进行诱导。分别于生长因子刺激前和刺激8、16d时留取细胞。通过RTPCR对ALB、AFP、GATA4等mRNA的表达水平进行检测；用免疫细胞化学染色检测ALB蛋白的表达，并收集培养液测定ALB的质量浓度。结果 流式细胞仪检测结果显示CD34+细胞的平均分离纯度>90%，达到分离要求。RTPCR检测到诱导后的CD34+细胞表达ALB、AFP、GATA4 mRNA。免疫细胞化学染色可见诱导16d的CD34+细胞出现ALB阳性表达细胞，ELISA检测表明诱导组8、16d培养液中的ALB质量浓度明显增高，与诱导前和未诱导组相比均有显著差异(P

关键词：脐血CD34+细胞；肝细胞；分化

ABSTRACT: Objective To investigate the differentiation of CD34+ cells derived from human umbilical cord blood into hepatocyte cells in an in vitro system supplemented with growth factors(GF). Methods CD34+ cells were isolated by magnetic cell sorting (MACS). The purity of acquired cells was determined by FACS analysis. Purified CD34+ cells were cultured in DMEM supplemented with 50mL/L FBS， 1×ITS， 10-4mol/L ascorbic acid 2phosphate， 4.7mg/L linoleic acid ， and a combination of FGF4(100μg/L) and HGF(20μg/L). Cultured cells were collected after 8d and 16d to determine the extent of the cell conversion by microscopic observation on the morphology， RTPCR on the transcription of ALB， AFP and GATA4 mRNA， immunocytochemistry on the expression of ALB and ELISA on the quantification of the ALB product in the medium. Results CD34+ cells accounted for more than 90% after MACS. ALB， AFP and GATA4 mRNA and albumin protein positive cells were found in cultured cells after 16d. The ALB product in culture medium was significantly increased after culturing with GF in comparison with control groups (P

KEY WORDS: cord blood CD34+ cell; hepatocytes; differentiation

骨髓、脐血中的干细胞能够分化为类肝细胞已经被众多实验研究所证实。随着研究的增多，人们已不满足于全骨髓或全脐血细胞的研究，而侧重于将这种能分化的细胞定位于某一亚群或某一类干细胞，旨在从根本上探讨这一分化的机制。目前已证实基质干细胞的众多亚群可分化为肝细胞，而造血干细胞的此类研究则相对较少。CD34+抗原是一种分子质量为110-120ku的高度糖基化的I型膜蛋白，主要存在于幼稚的造血干细胞和造血祖细胞质膜上以及少量内皮细胞表面。本实验拟采用体外培养的方法，探讨脐血CD34+造血干细胞转化为肝细胞的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料 抗人CD34免疫磁珠(德国Miltenyi公司)、CD34PE(美国库尔特公司)、淋巴细胞分离液(上海华精生物公司)、低糖型DMEM、FBS(GIBCO公司)、胰蛋白酶(AMRESCO公司)、HGF、FGF4(RD公司)、1×ITS、亚油酸、2磷酸抗坏血酸、青链霉素、台盼蓝(Sigma公司)。RNA提取试剂为MRCGENE公司的TRIZOL REAGENT；一步法RTPCR试剂盒为FINNZYMES产品，50bp marker为GENERULAR公司产品；人白蛋白(ALB)、人甲胎蛋白(AFP)、GATA4引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，ALB上游引物5′CTTTCAAAGCATGGGCAGTAG3′，下游引物5′GCAGCAGCACGACAGAGTAA3′；GATA4上游引物：ACCTGGGACTTGGAGGATAG，下游引物：GACAAGGACATCTTGGGAAA；AFP上游引物5′ TGAGCACTGTTGCAGAGGAG 3′，下游引物5′ CTGAGACAGCAAGCTGAGGA3′。抗体：抗人ALB单克隆抗体(RD公司)、广谱二抗试剂盒(ZYMED公司)、白蛋白ELISA检测试剂盒(ALPHA DIAGNOSTIC san Antonio U.S.A.)。

1.2 方法

1.2.1 CD34+细胞的制备与鉴定 健康足月孕妇，待胎儿娩出后自脐静脉无菌采血。先用淋巴细胞分离液初步分离单个核细胞，再用磁性细胞分选试剂盒分离出CD34+细胞。具体步骤为：①用密度梯度离心法分离出脐血MNCs后，用300μL PBS+5g/L BSA重悬；②依次加入100μL FcR受体阻断剂和抗CD34免疫磁珠，混匀后4℃孵育30min；③细胞洗涤后过滤网去除滤块，然后将细胞过MS+柱，并用柱塞打出柱上吸附的CD34+细胞。收集分选后的CD34+细胞，PBS洗后，以100μL PBS重悬，加入10μL CD34PE 4℃孵育10min后，流式细胞仪检测。

1.2.2 体外诱导 分离好的细胞以4×105/mL的密度接种于铺有鼠尾胶原的24孔板上，培养液为低糖型DMEM，含5%(体积分数)FBS，1×ITS，青霉素100U/mL，链霉素100μg/L，4.7μg/L亚油酸，10-4mol/L 2磷酸抗坏血酸，每孔加0.5mL，置于37℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养。于培养第2天加入FGF4、HGF，质量浓度分别为100μg/L、20μg/L，并设不加因子组作对照。每周换液2次，加入生长因子。

1.2.3 总RNA提取与RTPCR 收集诱导8、16d的细胞，按TRIZOL试剂说明书提取总RNA，获得的RNA采用紫外分光光度法检测定量。RTPCR反应总体积50μL，其中RNA为1μg，10×PCR buffer 5μL，10mmol/L dNTPs 1μL，50mmol/L MgCl2 1.5μL，5pmol/μL上下游引物各2μL，逆转录酶5U，Taq酶2U。一步法RTPCR反应条件：首先48℃ 45min进行逆转录；然后94℃ 2min预变性；94℃ 30s(变性)，58℃ 30s(退火)，72℃ 30s(延伸)，35个循环；最后72℃ 7min进行延伸。产物长度分别为ALB 411bp，GATA4 250bp，AFP 308bp，用12g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 ALB免疫细胞化学染色 于诱导第16天低速离心收集细胞，PBS洗2次，用500μL PBS重悬，制备细胞滴片。用40g/L多聚甲醛和1.5g/L苦味酸固定10min后，PBS冲洗；依次加入过氧化物酶阻断剂、非免疫血清反应10min，甩弃多余液体；加一抗室温孵育30min，PBS洗3次；加生物素标记二抗10min；过氧化物酶标记的链亲和素10min，冲洗；DAB显色，乙醇脱水，二甲苯透明，封片。镜下选取数个高倍视野进行细胞计数。

1.2.5 培养液中ALB质量浓度的测定 于诱导第8、16天用PBS冲洗培养的细胞后，换成无血清DMEM培养基，并加入0.15mol/L的NH4Cl，常规培养8h后收集细胞培养上清，用ELISA试剂盒检测培养上清中的ALB质量浓度。同时记录培养细胞数。检测灵敏度为1mg/L。

1.2.6 统计学处理 计量资料均以±s表示并进行均数t检验，以P

转贴于 　　2 结

果

2.1 诱导前FACS检测CD34+细胞纯度 采用Ficoll法分离脐血MNC，约可得到6×107-8×107/mL单个核细胞，在此基础上用MACS法分选脐血CD34+细胞，获得的细胞量为3×105-9×105/mL，经流式细胞仪检测有91%的分选细胞表达CD34+，表明分选纯度较高(图1)。

图1 FACS检测结果（略）

2.2 ALB、GATA4和AFP mRNA的表达 RTPCR结果表明，诱导前的CD34+细胞不表达ALB、GATA4、AFP mRNA。诱导后随着培养时间的延长，ALB、GATA4 mRNA表达量增加，呈上升趋势；培养至第8天的CD34+细胞AFP mRNA表达量最高，至第16天表达量明显下降(图2)。图2 ALB、GATA4 、AFP mRNA RTPCR产物电泳图（略）

2.3 ALB蛋白表达 免疫细胞化学染色结果显示，CD34+细胞在诱导前ALB染色呈阴性反应，诱导后16d取出细胞，染色发现有阳性细胞出现，阳性细胞胞质紫红色，苏木素复染后细胞核蓝色(图3)。细胞阳性率达35%。图3 ALB免疫细胞化学染色结果（略）

2.4 培养液上清中白蛋白的质量浓度 ELISA检测结果发现，CD34+细胞单独培养组即未诱导组培养0、8、16d的ALB值无显著性差异，诱导组培养0、8、16d的ALB值差异明显，而且ALB的表达随着培养时间延长有逐渐升高的趋势。与同期单独培养组相比，除培养0d时无差异外，其余两个时间段的ALB产量均有显著差异(P

3 讨

论

成体干细胞的可塑性现象已被多个实验室报道。这一发现启发我们利用简便易得、来源丰富的某类干细胞通过体外诱导分化或直接移植的方法能够治疗诸如急性肝损伤的疾病。脐血采集方便、富含造血干/祖细胞，与骨髓中的干细胞相比，脐血干细胞更幼稚、免疫原性更弱，是继骨髓和外周血后的第三种造血干细胞来源。在我们的前期工作中，已通过与小鼠受损肝组织共培养方式、体外加生长因子诱导培养方式和肝损伤裸鼠体内移植方式探讨了脐血单个核细胞向肝细胞分化这一问题，初步证实了可塑性的存在。本次研究着重探讨脐血CD34+造血干细胞向肝细胞分化的可能性。目前，利用人骨髓CD34+造血干细胞分化为表达白蛋白的类肝细胞已得到体内动物实验的证实。方法为首先建立一个免疫缺陷鼠的急性肝损伤模型，然后将分离纯化的CD34+细胞通过尾静脉或门静脉输入急性损伤鼠体内，一段时间后通过FISH、免疫组化、分子生物学指标鉴定受体肝脏中的供体细胞的分化表达。这些研究进一步发现：压力诱导信号如SDF1、MMP9 和HGF的表达增加能够促使人CD34+细胞归巢于免疫缺陷鼠的肝脏。而Kollet和Kakinuma的研究证实：FGF、LIF、SCF、HGF、OSM等生长因子在肝前体细胞的增殖和分化中起着不同的作用，尤其是HGF、FGF4可以直接诱导分化的发生。据此本试验采用HGF、FGF4这两种因子促进脐血CD34+细胞的分化。AFP、ALB分别是幼稚、成熟肝细胞的特异性标志物。GATA4是肝脏分化过程中的转录因子之一，能够与ALB增强子结合并上调ALB表达。经MACS法分离出CD34+细胞后，在培养液中添加HGF和FGF4，当培养至第8天时，观察有少量体积增大、细胞核大而圆、胞浆丰富的细胞出现。培养第16天时此种细胞增多。分别于这两个时间点收集细胞，做RTPCR检测，发现随着培养时间的延长，ALB和GATA4 mRNA表达量逐渐增加，AFP mRNA表达量在培养第8天时最高，第16天下降。这与肝细胞的发生规律相符合。免疫组化和ELISA检测进一步证实了这一结果。 当然，仅仅根据上述结果就简单的得到脐血CD34+细胞具有向肝细胞分化的可塑性这一结论尚为之太早。确切地作出结论需要更加严谨的体外对比试验和动物体内实验来验证由这一分化方式得来的细胞的功能性。我们拟在此基础上进一步探讨脐血CD34+细胞的可塑性，并将体外培养环境下得到的白蛋白阳性细胞微囊化处理后直接移植到肝损伤模型中，以检测这一分化细胞的功能性。

采用体外培养的方法诱导人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化，初步探索了脐血造血干细胞向肝细胞定向分化的机制。随着对干细胞可塑性研究的不断深入，有望今后在临床治疗急、慢性肝功能衰竭和肝脏代谢性疾病中发挥作用。

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细胞分化范文第4篇

【关键词】 5氮胞苷 脂肪间充质干细胞 肌细胞

0引言

脂肪间充质干细胞(adipose tissuederived mesenchymal stem cells， AMSCs)是继骨髓间充质细胞后发现的又一具有广阔应用前景的成体干细胞. 自2001年以来，国内外多个研究小组从不同物种分离出AMSCs［1-2］，并相继证实它具有向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经细胞和内皮样细胞等多种细胞分化的能力［1-5］. AMSCs可作为多种组织工程的种子细胞，为研究细胞定向分化提供了一个新的工具，其定向分化成肌细胞在有关肌损伤的治疗上具有重要的现实意义. 我们采用含有10 μmol/L 5Aza的培养液体外诱导大鼠AMSCs分化成肌，以期为AMSCs的应用提供理论依据.

1材料和方法

1.1材料DMEM培养基（Gibco），I型胶原酶（Sigma），胰蛋白酶（Gibco），胎牛血清（杭州四季青），Tripure Isolation Reagent（Roche Switzerland）， RTPCR 一步法试剂盒及DNAMarker(100~2000 bp)（TaKaRa Japan），鼠抗人CD14， CD34， CD44， CD105， CD106， S100和HLRDR mAb（北京中杉金桥生物技术有限公司），小鼠抗大鼠Desmin mAb，小鼠抗大鼠αSarcometric Actin mAb，SABC试剂盒及DAB显色剂（武汉博士德），20日龄雄性SD大鼠购于第四军医大学实验动物中心.

1.2方法

1.2.1大鼠AMSCs的分离培养根据本实验室建立的方法［6］，将大鼠断颈处死，并充分浸泡于750 mL/L乙醇中消毒10 min，取出，无菌条件下取脂肪垫，用含高浓度抗生素(青霉素3×105 U/L和链霉素3×105 U/L)的无血清培养基溶液清洗三次，将脂肪组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，加入5 g/L I型胶原酶，置于恒温水浴振荡器中37℃振荡消化50 min，取出，加入与胶原酶等体积的含血清培养基中和消化，将组织悬液依次通过160目和600目筛网过滤，收集滤液，1300 r/min离心5 min，弃上清，加入红细胞裂解液重悬细胞，室温静置10 min， 1300 r/min离心5 min，弃上清，加入无血清培养基重悬细胞，1500 r/min离心5 min，弃上清，向离心管内沉淀中加入含100 mL/L FBS的DMEM培养基，5×104/cm2密度接种. 37℃ 50 mL / L CO2培养箱中培养，24 h后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每隔48 h换液1次. 待细胞增殖至皿底面90%融合，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶3比例传代.

1.2.2大鼠AMSCs鉴定选择生长良好的第五代细胞，用40 mL/L甲醛固定30 min，参照SABC试剂盒和DAB染色剂说明进行抗CD34， CD44， CD105， CD106和HLADR免疫细胞化学染色. 倒置显微镜观察并照相.

1.2.35Aza（10 μmol/L）诱导AMSCs成肌分化向DMEM完全培养基中加入5Aza至终浓度为10 μmol/L并使之完全溶解，配制成诱导培养基. 取传至第四代AMSCs，向培养皿内加入诱导培养基，24 h后去除诱导培养基，1×PBS洗涤2遍后更换DMEM完全培养基继续培养，每2 d换液1次.

1.2.4RTPCR检测MyoG的表达RTPCR分别检测未诱导及诱导后12， 15， 24， 48和72 h MyoG的表达. RNA提取和逆转录反应常规进行. RTPCR用两步法试剂盒，按操作程序进行，PCR反应条件为：94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，共33循环，最后72℃延伸10 min. MyoG上游引物：5′ CTACAGGCCTTGCTCAGCTC 3′，下游引物：5′ ACGATGGACGTAAGGGAGTG 3′，引物扩增片段为221 bp；βactin上游引物：5′ACTGCCGCATCCTCTTCCTC3′，下游引物：5′CTCCTGCTTGCTGATCCACATC3′，引物扩增片段为399 bp，由上海生物工程公司合成. 1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定 RTPCR 扩增产物.

1.2.5免疫细胞化学染色取诱导培养第7， 10， 14， 28日的细胞，以未加5Aza诱导的大鼠AMSCs做为对照组，参照SABC试剂盒和DAB染色剂说明进行抗Desmin和αSarcometric Actin免疫细胞化学染色. 倒置显微镜观察并照相.

2结果

2.1AMSCs的分离培养原代培养的细胞大鼠AMSCs 24 h内基本贴壁完全，贴壁细胞呈成纤维细胞样形态，为短梭形或三角形，少量为多角形，第3~5日生长速度明显加快，部分细胞呈集落样生长，至7~8 d细胞生长基本达到80%~90%融合. 传代细胞1~2 h即开始贴壁，12 h贴壁完全，细胞形态主要以梭形为主，生长速度较原代细胞快，5 d左右即可达到完全融合，细胞群生长具有一定方向性（图1A）. 经5Aza诱导后，细胞的形态开始发生变化：一些细胞由短梭形变为长梭形. 2 wk后，部分临近细胞相互融合，形成类似肌管样结构（图1B）.

2.2AMSCs 鉴定大鼠AMSCs能够表达间充质干细胞的表面标志CD44和CD105，而不表达造血干细胞的标志CD34和CD106，也不表达成纤维细胞表面标志HLADR(图2).

2.3RTPCR 扩增产物电泳AMSCs经10 μmol/L 5Aza诱导后15 h MyoG开始表达（图3）.

M: marker DL 2000; 1~5: 12， 15， 18， 24， 72 h; 6: 未经诱导的对照组.

图35Aza诱导后MyoG的表达

2.4免疫细胞化学染色取诱导后第7， 10， 14， 28日的细胞分别进行Desmin和αSarcometric Actin免疫组化染色，结果显示：10 μmol/L 5Aza诱导后10 d，部份AMSCs细胞开始表达 Desmin，至14 d阳性程度明显增强（图4 ）. 诱导后14 d，部份AMSCs细胞αsarcomeric actin呈阳性，随时间延长阳性增强，至28 d呈强阳性（图5）. 阴性对照为未诱导的大鼠AMSCs.

3讨论

脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞具有相似的生物学特性，都可作为组织工程细胞，但是骨髓的抽取往往给患者造成痛苦，且来源有限（在骨髓中其仅占有核细胞的1×10-4~1×10-3 ［7］）；而AMSCs具有易于大量获得（每250~500 mL脂肪中含有超过1×109个成体干细胞［8］），对供区的损伤小，体外增殖能力强等优点，是干细胞生物工程研究种子细胞的理想来源.

Zuk等采用酶消化法从大鼠脂肪组织中分离获得PLA （processed lipoaspirate）细胞群，我们对其方法略加改进，获得的AMSCs经多次传代后细胞形态均一，增殖速度较快，纯度较高. 研究证实，脊椎动物 DNA 的胞嘧啶残基甲基化与基因表达的调控有关［9］，在生物发育期，组织特异性基因可通过选择性的去甲基化而转化形成特异的细胞表达类型［10］.

转贴于 5Aza被广泛用于诱导基因表达和细胞分化，它通过掺入DNA阻止在新复制的DNA中的胞嘧啶发生甲基化，使原本处于转录失活阶段的相关基因得以激活和表达，但它对培养细胞和动物体本身也有很高的毒性作用，因此，我们根据国内外现有的多个相关实验结论和自身的实验条件摸索，选择10 μmol/L 5Aza 对AMSCs进行成肌诱导，实验中发现：AMSCs经成肌诱导培养后，倒置显微镜下观察其形状由短梭形或三角形转变为长梭形，细胞形态趋于均一. 随着培养时间的延长，部分相邻细胞开始融合，形成类似肌管样的细胞，而对照组细胞均未发现上述形态变化. 上述结果与国外一些学者研究AMSCs成肌分化的结果相一致［4］. 由此，可以从形态学上初步判断，经5Aza诱导的AMSCs已经向成肌方向分化. RTPCR检测结果显示成肌诱导后15 h AMSCs开始表达 MyoG，该基因的表达表明AMSCs已经向肌细胞分化. 免疫细胞化学染色结果显示： 10~28 d表达特异抗原Desmin和αsarcomeric actin，2 wk后有类似肌管样结构出现，与相关研究报道也相符［11］，提示AMSCs中的成肌相关基因被激活，使AMSCs向成肌方向分化.

种子细胞的来源是制约组织工程广泛应用的关键问题之一，AMSCs来源广泛，对供区损伤小，并且在体外易于培养，增殖速度快，是组织工程种子细胞的理想来源. 进一步探索干细胞分化成肌的条件及其分化机制， 必将为应用于临床治疗肌组织损伤等奠定基础.

参考文献

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细胞分化范文第5篇

[关键词] 胚胎干细胞；拟胚体；造血分化

[中图分类号] R329 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）06（a）-0009-05

Techniques optimizations of Spin-embroid body approach for hematopoietic differentiation of human pluripotent stem cell

XU Jiancheng DUAN Yongjuan SUN Yi YANG Yang HU Xiao

State Key Laboratory of Experimental Hematology， Institute of Hematology Blood Diseases Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences， Tianjin 300020， China

[Abstract] Objective To optimize hematopoietic differentiation of human pluripotent stem cells via spin-embryoid body （Spin-EB）. Methods AggreWellTM800 and V-96 well culture plate were used to form Spin-EB， which was successively induced to hematopoietic differentiation in culture medium contained BMP-4， VEGF and bFGF. Flow cytometry was used to analyze the proportion of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells under the two different culture conditions. The higher test was seleted to verify its colony forming ability and erythroid differentiation ability via colony forming unit assay and erythroid differentiation culture system. Results The flow cytometry results showed that the proportion of CD34+ hematopoieic stem/progenitor cells from AggreWellTM800 test was 22.6%， while the V-96 well test divided into three tests according to the number of ESC， the corresponding proportion were： 3000 cells/well was 10.8%， 6000 cells/well was 1.28%， 9000 cells/well was 1.23%. The morphology of the colony forming unit from CD34+ cells originated from embryonic stem cell （ESC） was as similar as the umbilical cord blood CD34+ cells. Simultaneously， CD34+ cells originated from ESC could differentiate into CD71+CD235a+ erythrocytes in erythroid differentiati-on culture system. Conclusion The forming ability of EB and the hematopoietic differentiation efficiency of CD34+ cells is related to the number of ESC seeded in V-96 well culture plate， among which the 3000 cells/well test is relatively prestigeous. Furthermore， compared with the three tests of V-96 well， EB from AggreWellTM800 test has a better EB forming ability and higher hematopoietic differentiation efficiency of CD34+ cells.

[Key words] Embryonic stem cells； Spin-EB； Hematopoietic differentiation

造血干细胞移植是治疗许多血液系统疾病的最有效的方法，但由于造血干细胞来源有限，在临床治疗应用中受到了极大的限制[1-3]。利用多能干细胞体外诱导造血分化获得造血干细胞是解决这一难题的方法之一[4-5]。胚胎干细胞（ESC）是指从早期未分化的胚胎内细胞团中获得的一类多能干细胞。在体外培养过程中，具有无限增殖、自我更新和多向分化等特性。在体外能够分化为除胎盘以外的几乎全部成体组织细胞类型[6-8]，因而成为研究从多能干细胞获得包括造血干细胞在内的组织细胞的重要工具[9-10]。

在诱导多能干细胞分化的多种技术之中，利用拟胚体形成（embryoid body，EB）是一类重要的方法[11-12]。与传统的基质细胞共培养诱导分化相比[13-14]，EB形成诱导分化具有多种优势。包括易于扩大培养规模，可明确培养基成分易于培养的标准化，采用单细胞离心聚团形成的EB[单细胞聚团拟胚体（Spin-EB）]还具有可控细胞数目并进行外源基因导入等操作的优势，逐渐成为这一方法的技术主导。在实际应用中，这一技术受多种因素的影响，包括EB形成的培养介质，细胞因子组合及EB形成细胞数量及分化时间等。因此，本研究旨在比较商业化的AggreWellTM800培养板及普通V-96孔培养皿，以及不同的细胞数量对于多能干细胞形成的EB效率及进一步造血分化效率的影响，优化多能干细胞造血分化条件，为实现规模化标准化获得优质的造血干祖细胞提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

H1ES和IPS细胞系由中科院广州生命健康研究所潘光锦实验室惠赠。mTeSR1培养基、Dispase消化液、Accutase消化液、AggreWellTM800培养板、H4435、H4436（Stem Cell公司），StemlineⅡ培养基（Sigma公司），双抗（Gibco公司），ROCK抑制剂（Y27632）（R&D公司），骨形成蛋白-4（BMP4）、血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维生长因子（bFGF）（Peprotech公司），流式抗体鼠抗人CD34-APC、鼠抗人CD71-PE、鼠抗人CD235a-APC（eBiosciences公司），V-96孔板和低吸附24孔板（康宁公司）。倒置显微镜（Nikon TS100）（日本尼康公司），流式细胞分析所用的仪器为CantoⅡ（美国BD公司），台式离心机（centrifuge5810R）（Eppendorf公司）。

1.2 AggreWellTM800中拟胚体的形成

将P60至81代用mTeSR1无基质细胞培养的H1ESC集落用Accutase消化液消化为单细胞，计数，按每个AggreWellTM800培养板孔中加入1×106个细胞，加入EB形成培养基，EB形成培养基为加入50 ng/mL的BMP4、VEGF和Y27632的StemlineⅡ。按产品使用操作手册，将AggreWellTM800培养板低速离心700 r/min，5 min，放入20%CO2，5%O2低氧培养箱中培养。48 h后将形成的EB转移至低吸附24孔板中进行形态观察，EB计数和诱导造血分化。

1.3 V-96孔板中拟胚体的形成

ESC的培养及细胞处理同上。细胞计数后，重悬于EB形成培养基，分三组在V-96孔板中加入细胞。第1组每个孔中加入3000个细胞，第2组每个孔中加入6000个细胞，第3组每个孔加入9000个细胞，低速离心700 r/min，5 min，放入20%CO2，5%O2低氧培养箱中培养。48 h后将形成的EB转移至低吸附24孔板中进行形态观察，EB计数和诱导造血分化。

1.4 Spin-EB的造血分化诱导

将两种培养介质形成的Spin-EB重悬于造血分化培养基，加入低吸附24孔板中。造血分化培养基为加入50 ng/mL的BMP4和VEGF，20 ng/mL的bFGF的StemlineⅡ。放入20%CO2，5%O2低氧培养箱中培养。连续培养5 d，并于第3天补充新鲜造血分化培养基。

1.5 造血分化Spin-EB CD34+检测

将上述条件形成的Spin-EB经造血分化培养后收集，加入胰蛋白酶消化为单细胞。将适量单个细胞悬浮溶于100 μL PBS中，加入鼠抗人单克隆抗体：anti-CD34-APC。室温避光孵育15 min，2 mL PBS洗1次，400 μL PBS重悬细胞，BD CantoⅡ流式细胞仪检测CD34+细胞的比例，用FlowJo 7.6软件分析流式检测结果。

1.6 集落形成实验

将造血分化诱导后的EB消化为单个细胞，计数2×104～5×104个接种于H4435培养基中，培养14 d，观察造血集落形态。

1.7 红系分化实验

将造血分化诱导后的EB消化为单个细胞，取3×105个细胞进行红系诱导分化。具体培养方法参见文献[15-17]。

2 结果

2.1 两种培养方式下形成的Spin-EB数量与形态比较

将在AggreWellTM800及V-96孔板上形成的EB分别收集后计数并在光学显微镜下进行形态观察。AggreWellTM800培养板每一培养孔中有300个EB形成小室，形成的EB效率>90%，且形成的EB大小均匀，形态较为均一（图1A）。在V-96孔板中按照每孔加入3000、6000、9000个细胞（V-3000、V-6000、V-9000），EB大小受加入的细胞数影响，且大小和形态上不均匀，EB形成效率分别为63%，31%和89%（图1B～E）。

2.2 Spin-EB诱导造血分化后CD34+细胞的比例

将上述两种培养介质中形成的Spin-EB转入低吸附24孔板，并加入诱导造血分化的细胞因子组合，诱导分化培养5 d后，光学显微镜下观察分化EB的形态特征并收集EB消化为单细胞后流式分析CD34+细胞比例。结果显示，AggreWellTM800培养板中形成的Spin-EB中诱导造血分化后EB呈分化良好的三维囊状空泡，CD34+细胞的比例为22.6%（图2A）；V-96孔板形成的Spin-EB中，除3000个细胞/孔的EB中有部分分化良好的三维囊状空泡形态，6000、9000细胞/孔的EB均呈现为分化不良的实心结构。CD34+分析，3000个细胞/孔为10.8%、6000个细胞/孔为1.28%、9000个细胞/孔为1.23%（图2B～D）。

2.3 Spin-EB来源CD34+造血集落形成和红系分化能力

为证明上述Spin-EB来源的CD34+细胞具有造血分化能力，将造血分化诱导第5天的EB消化为单细胞后分别加入造血集落形成半固体培养基，以及红细胞分化诱导培养基。图3A所示，以脐带血UCB-CD34+造血集落作为对照，Spin-EB来源的CD34+细胞所形成的BFU-E，CFU-G和CFU-G三种集落的形态与UCB形成的此三种集落相似；红系诱导分化培养10 d后收集细胞经流式细胞仪分析发现，细胞培养中有26%的细胞表达红细胞标志抗原CD71和CD235a，说明Spin-EB来源的CD34+具有形成造血集落和向红系分化的能力。见图3。

3 讨论

ESC能够无限增殖和多向分化的能力多年来一直都是生物医学研究的重点，其中ESC在体外诱导分化为成熟类型细胞更是重中之重。通过诱导其向造血细胞分化，是有效解决临床治疗中造血干细胞短缺的有效方法之一。通过研究其向特定细胞分化的过程可以帮助建立疾病模型，用于研究疾病的发病机制，可以帮助开发治疗方案，也可以研究生物体在发育过程中基因的表达调控等复杂的生理过程[18-20]。EB的形成是ESC进行体外诱导分化的关键步骤之一，悬滴法和基质细胞共培养法是形成EB的常规方法，但这两种方法都十分不利于进行外源基因转染等分子生物学方面的操作，难以进行分子水平上的研究。本研究采用将ESC消化为单细胞进行EB培养的方法，此培养方法不仅培养基成分明确，而且能准确地掌握细胞数，同时也方便进行分子生物学方面的操作。

AggreWellTM800培养板是StemCell公司生产的可用于单细胞法培养EB的培养板，本研究中采用的是AggreWellTM800型，每个培养孔有300个小孔。在每个孔中加入1×106个ESC时，每个小孔中大约有3000个细胞；V-96孔板是一种普通的可用于酶联免疫研究的培养板，其与AggreWell培养板相比具有相似的空间形态，因此在用V-96孔板进行EB培养时，从每孔3000个细胞为起始，同时设置6000和9000个细胞组。从形态上看AggreWellTM800培养板中形成的EB，经过在低吸附24孔板中再培养5 d后，不仅数量多而且发育更为成熟，经过同样的培养，V-96孔板中3000个细胞形成的EB在大小上与AggreWellTM800培养板中形成的EB最为相似，但是没有形成明显的囊状EB，9000个细胞形成的EB虽然形成率较高，但是分化效率较低。流式细胞仪分析结果显示，AggreWellTM800培养板形成的EB CD34+细胞的比例达到了22.6%，V-96孔板中3000个细胞组形成的EB CD34+细胞的比例是V-96孔板中形成的EB中最高的，比例为10.8%。根据流式结果选择AggreWellTM800培养板中形成的EB进行造血集落形成和红系诱导分化实验，其BFU-E，CFU-G和CFU-GM三种集落的形态与对照组UCB形成的集落形态相似；经红系诱导分化，有26.1%的细胞表达红细胞标志抗原CD71和CD235a。同时，在AggreWellTM800培养板中用IPS细胞进行试验，经过相同的培养时间，IPS形成的EB CD34+细胞阳性率为38.2%。

综上所述，利用商品化的AggreWellTM800培养板可以较高效率地形成EB并诱导造血分化，但是AggreWellTM800培养板的缺点在于价格比较昂贵，不利于进行大规模实验，相比之下V-96孔板虽然在EB形成效率和分化上不及AggreWellTM800培养板组，但是V-96孔板价格十分便宜，尤其适合大规模实验，因此V-96孔板中形成EB的体系也十分值得进一步优化。

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