细胞凋亡
细胞凋亡范文第1篇
关键词：Bcl-2；细胞凋亡
自从1972年Kerr提出细胞凋亡（appoptosis）的概念至今，人们对细胞凋亡现象进行了广泛、深入的研究。但是，凋亡的分子和生化机制迄今尚未彻底明了；而已形成的初步认识大多源于对Bcl-2基因家族的研究。已知，调亡进程可分为三个时相：诱导期，效应期和降解期。在诱导期，细胞接受各种信号从而引发各种不同的效应：进入效应期后，经过一些决定细胞命运（存活/死亡）的分子调控点，细胞进入不可逆的程序化死亡，这些调控分子包括一系列原癌基因和抑制癌基因的产生，其中Bcl-2家族起着决定性的作用；降解期则产生可见的凋亡现象[1]。
Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，并用近年来的一些研究已开始揭示这一作用的机制。目前已经发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类，一类是象Bcl-2一样具有抑制凋亡作用，如哺乳动物的Bcl-X1、Bcl-W、Mcl-1、A1、线虫Ced-9、牛痘病毒E1B119kD等，而另一类具有促进凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak、Bik/Nbk、Bid和Harakiri[2]。
最初在血液淋巴细胞中发现Bcl-2能抑制细胞死亡，随后陆续在其它一些细胞中也发现Bcl-2的这种作用。但近年来研究发现，除些之外尚存在Bcl-2不敏感的凋亡途径。本文拟就凋亡与Bcl-2的关系及其研究进展作一综述。
1 Bcl-2敏感的凋亡途径
Bcl-2可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡。Bcl-2的过度表达能增强所观察细胞对大多数细胞毒因素的抵抗性。这一发现使人们认识到凋亡的各种信号转导途径有一个共同的通路或交汇点，而该通路或交汇点受Bcl-2调节。实验表明，Bcl-2可增强细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性，抑制大多数化疗药物所引起的靶细胞凋亡，但其本身并不能抑制这些因素对细胞的损伤；同样地，它也不能促进DNA修复。p53蛋白是DNA损伤的一个分子传感器，已证实Bcl-2能抑制p53介导的凋亡，但不能抑制p53向核内转位或者p53介导的生长停滞，可能Bcl-2的作用是在DNA损伤后，阻止激活凋亡机制的信号到达其靶分子；在细胞毒性T细胞中，由颗粒酶B激活Caspases家族的一个或多个半胱氨酸蛋白酶所诱导的凋亡不依赖于Bcl-2，颗粒酶B可能仅作用于凋亡路径中Bcl-2调节位点的下游。以上结果表明在凋亡途径中Bcl-2的作用位点在信号分子和效应蛋白酶之间的位置[2]。
Bcl-2抑制细胞凋亡可能与其以下几种作用有关：
1.1 细胞催抗氧化作用[3] 以往研究表明，在去除生长因子所诱发的凋亡中，活性氧损伤（ROS）是促发细胞死亡的主要诱因：Bcl-2的过度表达可减少氧自由基产生和脂质过氧化物的形成。提示Cai等[4]的实验表明Bcl-2的抗氧化作用是间接的，即可能在于抑制超氧阴离子的产生而不是直接清除活性氧。细胞色素c（cytochrome c, Cyt c）作为呼吸链中重要的电子传递体，它从线粒体内膜上的释放会阻断电子向下游传递体，它从线粒体内膜上的释放会阻断电子向下游的传递，危及呼吸链的功能并导致超氧阴离子的加速产生；而Bcl-2可以抑制Cyt c的释放，从而抑制了超氧阴离子的产生。此外，Bcl-2还可以增加胞内的谷胱甘肽（GSH）等抗氧化剂，升高NAD+/NADH的比值，抑制和凋亡相联系的GSH降低，促进GSH进入核内，从而影响细胞的氧化还原状态。但也有证据表明，在没有自由基的情况下Bcl-2也能抑制凋亡。因此，Bcl-2的性质远非仅仅是一种抗氧化剂。
1.2 抑制钙离子跨膜流动 Lam等曾报道钙泵特异性抑制剂Thapsigargen（TG）诱导的WEH17.2等细胞的凋亡可被Bcl-2所抑制，其原因是Bcl-2抑制了Ca2+的跨膜流动，提 示Bcl-2可通过调节胞内钙离子浓度来调节凋亡。然而Wei等[5]在神经元细胞GT1-7中发现Bcl-2中发现Bcl-2可抑制由TG所诱导的凋亡，但并不能抑制TG诱导的胞内钙离子浓度升高；同时Jason等[6]在中国仓鼠卵巢细胞5AHSmyc中去除细胞内贮存Ca2+后发现过度表达的Bcl-2仍可抑制凋亡，提示Bcl-2对胞内Ca2+浓度的调节作用也只能是其抑制凋亡的机制之一。
1.3 离子通道蛋白和吸附/锚定蛋白 最近Reed[7]提出Bcl-2蛋白可能具有双重功能：离子通道蛋白和吸附/锚定蛋白，提出Bcl-2抑制凋亡的部分新机制。
1.3.1 离子通道蛋白 体外实验证实，Bcl-2、Bcl-X1和Bax能在线粒体上形成离子通道，提示它们可能参与调节一些与凋亡有关的细胞现象，如线粒体通透性改变（巨孔形成）和线粒体释放凋亡蛋白本科激活因子——Cyt c和凋亡诱导因子（AIF）。过度表达的Bcl-2能抑制线粒体通透性改变，并影响巨孔的形成，从而抑制凋亡。但也有实验发现即使线粒体通透性未改变，Cyt c等凋亡激蛋白也可以释放到胞液中从而诱发细胞凋亡，因此这种观点还有待进一步证实。
在所观察的细胞系及多种情况下，凋亡的发生都伴有Cyt c从线粒体释放，继而伴有Caspases激活，而活化的Caspases降解底物后，其蛋白降解产物又引起线粒体通透性改变，并最终导致凋亡发生[8]。Yang等[9]与Kluck等[10]发现Bcl-2可以通过抑制线粒体释放Cyt c来抑制凋亡，继而Rosse等[11]和Zhivotovsky等[12]用两种不同的方法证明了即使Cyt c已经释放入胞浆，Bcl-2仍能延迟细胞死亡，这是由于Bcl-2抑制了活化的Caspases对线粒体释放的上游和下游都有Bcl-2调节凋亡的作用点。
AIF作为一种线粒体来源的效应蛋白酶，在分离在胞核中能诱导凋亡，同时还能激发线粒体通透性改变，诱导线粒体释放Cyt c和Caspase-9，并在体外切割和激活其底物——半胱氨酸蛋白酶CPP32。体外研究发现，Bcl-2过度表达可能阻止AIF从分离的线粒体上释放，但它并能影响AIF的产生，同时也不能影响AIF促凋亡的功能[13]。
1.3.2 吸附/锚定蛋白 在正常情况下Bcl-2通过其C端疏水残基的伸展而锚定在细胞内膜上，作为吸附/锚定蛋白，可把胞液蛋白固定在膜边，或是引导胞液蛋白与别的膜蛋白相互作用。
Bcl-2可与Bcl-2家族的Bcl-2家族的Bcl-X1、Bcl-Xs、Bax、Bcl-2、Bad和Mc1-1形成同源的蛋白二聚体，而特定的蛋白二聚体则可作为在细胞死亡信号通路上的分子开关。例如，Bcl-2可与促凋亡Bax形成二聚体，如果Bax相对量高于Bcl-2，则Bax同二聚体的数量增多，从而促进细胞死亡；而如果Bcl-2相对量高于Bax，则促进形成Bcl-2/Bax异二聚体，并使Bcl-2同二聚体的量增多，从而抑制细胞死亡；而促凋亡分子和Bad和Bcl-Ss则竞争结合细胞死亡抑制分子如Bcl-X1或Bcl-2，由此替换了Bax并促进Bax同二聚体形成，诱导凋亡。
另外，Bcl-2还可与Bcl-2家族外的11种蛋白质结合，包括蛋白激酶Raf-1、蛋白磷酸酶Calcineurin、GTP酶、R-Ras和H-Ras、p53-BP2、朊蛋白Pr-1、Ced-4、BAG-1、Nip-1、Nip-2和Nip-3，并由此实现其抗凋亡作用。
2 Bcl-2不敏感的凋亡途径[14]
Bcl-2抑制凋亡的作用并不是万能的，例如在细胞毒T细胞杀伤作用中，特定的淋巴因子撤离以及某些TNF受体家族介导的凋亡途径中Bcl-2不能抑制凋亡，其原因右能是这些凋亡诱导剂作用于Bcl-2下游或是独立于Bcl-2的其它凋亡路径。最近Scaffidi等[15]发现，Jurkat等细胞（Ⅱ型细胞）中Bcl-2可抑制TNF受体家族中的CD95（Apo-1/Fas）信号通路介导的凋亡，而在SKW6.4等细胞（Ⅰ型细胞）中Bcl-2则不能抑制这种信号通路介导的凋亡。其结果表明，凋亡途径对Bcl-2敏感与否可能与细胞类型有关。进一步研究发现，这种差异取决于线粒体是否参与这种凋亡途径，在Ⅰ型 细胞中线粒体则未参与该凋亡途径。因此，Bcl-2可能只抑制依赖于线粒体的凋亡途径。
更进一步研究发现，来源于牛痘病毒的细胞因子应答修饰体A（crmA）是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）类分子，能抑制一些Caspases的功能。而来源于杆状病毒的P35蛋白也能抑制一些Caspases的功能，而且它比CrmA具有更广泛的Caspases抑制特性。在组织培养体系中或转基因鼠的T淋巴细胞中CrmA表达能抑制CD95（Fas/Apo-1）和p55TNF受体Ⅰ诱发的凋亡，但对另一些诸如生长因子撤除，DNA损伤等细胞毒因素引起的凋亡则无能为力，而这些由细胞毒因素引起的凋亡现象则可被Bcl-2及其同系物所抑制，但是Bcl-2又不能抑制由CD95（Fas/Apo-1）和TNF受体介导的凋亡。由细胞毒因素及TNF受体家族介导的凋亡都可有效地被p35所抑制，提示这些通路都依赖于Caspases的激活。上述结果表明，在细胞中不同的凋亡激活途径同时存在，其一是需要对CrmA敏感的Caspases参与但又不能被Bcl-2所抑制；而另一个则是Bcl-2可抑制的凋亡途径，其中Caspases对p35敏感，但对CrmA则不敏感。
3 结语
目前Bcl-2是凋亡分子机制研究的主要靶分子。随着对Bcl-2以及凋亡本身研究的日渐深入，Bcl-2是作用机制和凋亡的分子机制最终被阐明，从而提高对与凋亡有关的疾病的认识和诊治水平。
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11 Rosse T, Olivier R, Momey L, et al. Nature, 1998；391:496-499
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13 Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, et al. Nature, 1999；397:441-446
细胞凋亡范文第2篇
1 ROS和凋亡细胞的线粒体功能变化的关系
细胞游离系统(cell－freesystem)为认识细胞凋亡机制提供了良好的模型。该系统通过分离细胞核和细胞浆，制备去核细胞(cytoplast)和无浆细胞，可以独立分析细胞浆和细胞核在细胞凋亡中的作用。以此为基础的两大发现强力地揭示线粒体在细胞凋亡中的重要性：①细胞自发的受Bcl-2抑制的核固缩和DNA裂解依赖线粒体的存在；②caspase的活化依赖细胞色素C自线粒体释放。随后的研究显示各种因素诱导的细胞凋亡均出现线粒体功能紊乱，尤其是线粒体跨膜电位(ψm)的破坏。业已清楚，造成ψm下降的主要原因是线粒体膜通透性转运孔(MPT)的开放。MPT位于线粒体内、外膜之间，由一组蛋白复合体构成。许多因素可影响MPT的开关。其中，定位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转位蛋白(ANT)发挥重要作用。ANT分子的构象改变，尤其是其相邻巯基的氧化还原状态明显影响MPT的开关。当相邻巯基氧化为二硫键或类似于二硫键的交联复合物时，MPT开放。反之，MPT关闭〔1〕。因此，MPT的开放及ψm的破坏与细胞的氧化还原状态，如巯基氧化、细胞GSH缺少和ROS的堆积密切相关。Macho等〔2〕在研究胸腺细胞凋亡机制中发现，早期凋亡细胞胞内GSH下降和ROS含量轻度升高。后者进一步引起NADH和NADPH下降，产生大量超氧阴离子自由基。因此，在凋亡过程中，ROS既是促发和加速MPT开放重要效应分子，又是MPT开放的产物。这种正反馈机制使MPT开放具有自我放大效应和“全”或“无”的特点，使线粒体ψm的下降进入不可逆过程，细胞发生凋亡。
2 ROS和凋亡信号传导分子Ca2＋的关系
自从Kaiser等发现糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡与Ca2＋离子内流增加有关以来，越来越多的直接或间接证据表明胞浆Ca2＋浓度上升是细胞凋亡的一个重要事件。Ca2＋作为第二信使或死亡信号传导分子，通过参与某些和细胞凋亡相关的蛋白激酶和核酸酶的活化介导细胞凋亡。实际上，在细胞凋亡过程中胞内Ca2＋浓度上升和ROS的产生、堆积之间也存在密切联系，而且后者往往先于胞内Ca2＋浓度的上升。例如，Tan等〔3〕发现神经细胞系HT22凋亡过程中，ROS的大量产生先于胞内Ca2＋浓度的持续上升。进一步地，ROS的产生被FCCP(一种能够抑制线粒体呼吸链产生ROS的芳香族化合物)阻断后，胞内Ca2＋水平升高不明显。反之，当Ca2＋的内流被钴阻断时，胞内ROS的产生和堆积也受到抑制。因此，他们认为在凋亡早期贮存于内质网或线粒体的Ca2＋释放引起胞内Ca2＋水平轻度升高，并协同其它因素(如GSH的下降等)引发线粒体大量产生ROS，而ROS进一步促进胞内Ca2＋浓度持续升高。David〔4〕等发现抗氧化剂和MPT抑制剂能够抑制糖皮质激素诱导的胸腺细胞内Ca2＋水平的升高，进而抑制凋亡。他们认为凋亡中产生的ROS可能引起细胞内贮存Ca2＋的细胞器如内质网、线粒体膜和胞膜的破坏，导致胞内Ca2＋重分布和胞外Ca2＋的内流，从而引起细胞内持续的Ca2＋水平升高。总之，ROS的产生堆积和Ca2＋水平的升高都是细胞凋亡中的重要事件，且两者相互促进，在细胞凋亡中发挥重要作用。
3 ROS与调亡调控蛋白Bcl-2关系
Bcl-2基因所编码的蛋白质属于胞内膜整合蛋白。它对大多数因素诱导的细胞凋亡具有负性调节作用。Bcl-2家族则包括诱导凋亡和抑制凋亡两大亚家族。前者如Bax、Bcl-xs、Bik、Bak等，后者除Bcl-2外，还有Bcl-XL、Ced-9等。Bcl-2家族成员大多数由C端跨膜结构域(TM)和1－4个BH(Bcl-2Homology)结构域构成。近来在对Bcl-2作用机制研究中发现Bcl- 2抑制细胞凋亡作用可能涉及Bcl-2对凋亡过程中ROS产生的影响。Hochman〔5〕等发现敲除Bcl-2基因的小鼠神经细胞内氧化蛋白含量明显升高，而且对各种氧应激特别敏，表明失去Bcl-2导致细胞氧化损伤增加和抗氧化能力的下降。Kane〔6〕等发现表达Bcl-2的GT1－7神经细胞在去除GSH时，胞膜脂质过氧化等氧化损伤无明显增加，而且胞内ROS水平也无明显升高。Hochman等认为Bcl-2蛋白是一种ROS清除剂，能有效清除超氧阴离子等氧自由基，抑制过氧化物产生及ROS对细胞的损伤。同时，Bcl-2蛋白能够调节并维持细胞内抗氧化剂的活性，并根据Bcl-2蛋白主要位于细胞内ROS产生的部位，如线粒体膜，内质网膜，核膜等，推测Bcl-2蛋白能够调节细胞尤其是线粒体内ROS的产生。此外，Bcl-2蛋白可能阻断ROS对线粒体膜通诱性的影响及由于膜通透性下降引起的细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)等释放。但是，Satho等〔7〕发现在PC12细胞，Bcl-2并不能降低氧应激引起的ROS产生，但能阻止线粒体ψm的下降。Motyl等〔8〕报道TGF-β1诱导小鼠淋巴细胞性白血病细胞系L1210胞内Bcl-2水平下降和胞内ROS水平升高，且出现于TGF-β1加入后24～48小时，但在此之前胞内已有一次ROS含量的增加。显然，第一次ROS升高与Bcl-2下降无关。综上所述，Bcl-2作为凋亡负性调控基因，可能并不能抑制凋亡诱导因子引起的细胞内初次ROS的产生，但Bcl-2能够阻断第二次大量ROS的产生(主要是由线粒体功能改变引起的ROS产生)。
4 ROS与FAS/FAS配体、TNFα及其它细胞毒性分子诱导凋亡的关系
FAS/APO-1(CD95)是一种Ⅰ型跨膜受体蛋白，由胞外结合区、跨膜区、及胞内区域构成，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)家庭。FAS通过与其拮抗剂和天然配体(FASL)相互结合，引起FADD，Caspases等一系列复合物、酶的链级活化，最终诱导细胞凋亡。近来研究发现，在FAS/FAS配体(FASL)诱导的细胞凋亡过程中，FAS和FASL交联能够引起细胞内ROS含量增加和细胞氧化还原状态的改变。Suzuki等〔9〕用化学荧光指示剂Chemluminescence(该指示剂能与包括O－2、OH·、单线氧等各种ROS反应)观察B淋巴瘤细胞株BJAB和Ramos以及T淋巴细胞性白血病细胞株Jurkat在FAS/FASL交联后胞内ROS含量变化，发现FAS/FASL交联引起细胞内迅速和特异性ROS的产生，而且这此细胞内ROS产生过程基本相同。ROS大都在FAS/FASL交联后20秒内产生，5分钟后达到高峰，然后缓慢下降，但ROS水平升高至少维持40分钟，而FAS引起的ROS增加可被DPⅠ(dipenylene iodonium chloride,NADPH氧化酶抑制剂)所抑制，提示FAS介导的ROS增加可能主要通过NADPH氧化酶系统产生。当FAS/FASL交联引起的胞内ROS产生被各种抗氧化剂(如GSH、NAC、疏基还原剂等)所阻断时，FAS介导的细胞凋亡也被抑制，如提高外周活化T细胞内GSH含量，能够降低T细胞对FAS介导凋亡的敏感性。有研究表明H2O2能够激活蛋白酪氨酸激酶(PTK)，而PTK的活化是FAS介导细胞凋亡必要步骤，可以推测，FAS/FASL交联后引起胞内产生的ROS激活PTK，然后在PTK作用下促发一系列凋亡链级反应。因此，ROS不仅是FAS/FASL交联后的产物，而且在FAS/FASL诱导的细胞凋亡中发挥了重要作用。
ROS在α-TNF诱导的细胞凋亡中也起着重要的介导作用。Gotoh等〔10〕发现α-TNF作用于“293”细胞，引起胞内凋亡信号调控激酶1(ASK1)的活化和细胞凋亡。ASK1的激活可被抗氧化剂所阻断，而过氧化氢可导致ASK1的活化。作者认为α-TNF诱导的凋亡中ASK1活化是通过ROS介导的。具体地，ROS可能通过促使ASK1形成二聚体而激活ASK1。但是，Sidoti〔11〕等认为α-TNF诱导Hala细胞凋亡至少存在二条独立的凋亡途径，其中一条途径需要ROS参与，而另一途径则无需ROS的介导。
细菌生物碱staurosporine能够诱导包括神经细胞在内的许多细胞发生凋亡。Kruman〔12〕等在研究staurosporine诱导PC12细胞凋亡机制中发现，staurosporine作用于细胞，首先引起胞内Ca2＋水平的上升和线粒体产生ROS增多和堆积，然后出现 胞膜脂质过氧化，线粒体ψm下降，以及细胞核凋亡特征性的改变，而Ca2＋的鏊合剂BAPTA和ROS清除剂尿酸均能抑制staurosporine诱导的细胞凋亡，提示胞内Ca2＋水平的上升和ROS的堆积是staurosporine诱导细胞凋亡所必须的。近来，Ahlemeyer〔13〕等发现雏鸡胚胎神经细胞经staurosporine处理后4小时，细胞内ROS水平增高4倍，60％细胞凋亡，而在加入10mmol全反式维甲酸(RA)后，同样经staurosporine处理，细胞内ROS增高幅度降至2倍，而凋亡细胞也降至38％，这可能是RA抑制胞内ROS产生和堆积有关。
最近，Rollet-Labelle〔14〕等发现黄嘌呤氧化酶(XO)和葡萄糖氧化酶(GO)作用于中性粒细胞，引起细胞内H2O2及OH。含量增加，加速细胞凋亡。这种效应可被OH。鏊合剂HBED所抑制，提示OH。可能是中性粒细胞凋亡的介导因子。此外，Lee等〔15〕发现KIT(一种酪氨酸激酶受体，属于血小板生长因子受体家族)通过阻止小鼠DP16Friend红白血病细胞株内ROS的产生而抑制p53诱导的凋亡。ROS诱导或介导的T细胞凋亡也参与HIV病毒感染患者的T淋巴细胞减少〔16〕。
5 ROS和药物诱导细胞凋亡的关系
随着对细胞凋亡机制研究深入，具有凋亡诱导作用的药物不断被发现。ROS在这些药物诱导的细胞凋亡中可能发挥了重要作用。首先，ROS在多种抗肿瘤药物诱导凋亡过程中起着介导和调节作用，例如，化疗药物去甲氧柔红霉素(doxorubicin)诱导白血病和神经母细胞瘤凋亡与肿瘤细胞内ROS的产生密切相关，而抗氧化剂(如谷胱甘肽等)阻断细胞内ROS的产生，并明显抑制去甲氧柔红霉素诱导的肿瘤细胞凋亡，相应地，对该药不敏感的肿瘤细胞有较高的胞内GSH水平，降低这些细胞内GSH含量可使胞内ROS大量产生并可恢复耐药肿瘤细胞对去甲氧柔红霉素的敏感性〔17〕。无独有偶，三氧化二砷(As2O3)诱导肿瘤细胞凋亡过程中，细胞内ROS的产生一旦被阻断则As2O3诱导的细胞凋亡也明显受抑，而且对As2O3敏感的肿瘤细胞内GSH含量明显低于对As2O3耐药的肿瘤细胞，说明ROS的产生可能是As2O3诱导肿瘤细胞凋亡所必须的〔18〕。此外，ROS的产生在一些抗肿瘤新药(如新合成的维甲类药物4?羟苯维甲胺、雌激素受体拮抗剂ZM1832780，阿霉素类衍生物和治疗前列腺癌新药BMD188)诱导凋亡发挥了重要作用，降低肿瘤细胞内拮抗ROS产生的抗氧化剂水平以促进胞内ROS的大量产生可能是提高这些药物诱导肿瘤细胞凋亡效率的有效方法之一〔19～22〕。近来研究发现非甾体类抗炎药(NSAIDS)能通过加速转化细胞的凋亡而有效抑制直肠癌进展，在对NSAIDS类药物(消炎痛、水杨酸)诱导HT?29细胞(人类直肠癌细胞株)凋亡机制中发现：NSAIDS类药物能增加HT?29细胞内过氧化物(ROS)含量，从而加速肿瘤细胞凋亡，并认为NSAIDS类药物改变肿瘤细胞内ROS代谢的能力与其抗肿瘤效应密切相关〔23〕。不仅抗肿瘤药物诱导凋亡与ROS有关，而且其它一些抗炎药物作用也与ROS相关，如近来发现Bucillamine(BUC)，一种治疗类风湿关节炎(RA)药物是通过促进RA患者关节腔滑液细胞的凋亡、抑制滑液细胞过度增殖从而治疗RA，而BUC的诱发滑液细胞凋亡作用依赖于其促进胞内ROS产生，一旦ROS产生被阻断，其促凋亡及治疗作用亦被终止〔24〕。
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细胞凋亡范文第3篇
摘 要 生物体内各种组织细胞通过增殖与凋亡来维持数量的平衡。一旦这种平衡被打破就会导致一些疾病的产生，如癌症。细胞凋亡与癌症之间的关系为癌症的治疗提供了新思路。
抗癌药物的研究经历了一个漫长的发展过程，尽管已对许多抗肿瘤药物的细胞目标有了一定了解，但对于药物与肿瘤作用后如何导致细胞死亡的确切机制尚不清楚。近年来的研究发现细胞凋亡是各种抗癌药物引发细胞死亡的主要方式，从而使得细胞凋亡与癌症之间的关系及细胞凋亡在癌症治疗中的作用成为抗肿瘤研究的新焦点。
1 细胞凋亡
细胞死亡一般有两种方式，即细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死通常发生在一群接触的细胞中，是由各种非生理因素，如局部缺血等引起的难以控制的一种破坏现象。它通过干扰细胞能量代谢，引起细胞渗透压不平衡，细胞质肿胀，最终由溶酶体酶导致细胞结构的不可逆性破坏并诱发局部的炎症反应。细胞凋亡这一概念是1972年由Kerr和Wyllie等提出的。它是一种主动的、固有的程序化现象，故又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。
许多生理性、非生理性的因素都可以引起细胞凋亡，如射线、高温、毒素及各种抗癌药物等。而坏死实质上是由于细胞周
围环境产生严重的损伤性变化所诱发的，所以这两种过程在发生机制、形态学和生物化学等诸方面都不相同。
凋亡的细胞由于失去细胞间相互联系而与邻近细胞分离，随后细胞表面释放出信号分子被吞噬细胞识别，因此凋亡不损伤周围的细胞。凋亡一般伴有明显的形态学特征，以细胞核的变化为主，表现为核浓缩、细胞浆中细胞器密集、胞膜突出、体积缩小、DNA断裂及形成凋亡小体。
在生物体的每种细胞中，细胞数量的控制都是通过增殖与死亡之间的平衡来完成的，细胞增殖是受到高度调控的。但是直至最近人们才认识到细胞死亡的调控与细胞增殖的调控一样复杂，而且多细胞组织中不同细胞似乎都是通过活化一种内部编程的自杀程序而导致凋亡的［1］。尽管不同的细胞之间有共同的死亡机制，但各种细胞发生凋亡的诱导信号各不相同。各种不同细胞甚至同一细胞不同阶段对凋亡诱导的难易程度、速度也各不相同，如静止期的T细胞在X光照射后迅速凋亡，而活化后的T细胞则不同，与胸腺中蛋白质紧密结合的未成熟T细胞株对凋亡更为敏感［2］。
是什么导致了这些不同?越来越多的工作表明对凋亡的敏感性主要由Bcl-2、p53两种基因调控。p53基因位于17号染色体短臂上，长14～24 kb，编码一个由393个氨基酸组成的53 kD的蛋白质。p 53蛋白是细胞周期的“分子警察”，也是在DNA损伤后诱导凋亡的因子。p 53蛋白通过上调p 21蛋白来介导细胞周期停滞，p 21蛋白是各种细胞周期蛋白、CDK5(细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶)及细胞周期蛋白-CDK5复合物的抑制剂，细胞周期停滞可以为DNA修复赢得时间，另一方面，如果细胞内损伤已无法修复，则p 53蛋白促进细胞凋亡。Bcl-2基因发现于人类滤泡性淋巴瘤的14、18位染色体转换点，它可以阻断细胞的凋亡而不影响细胞增殖。它是Bcl-2家族中的一员，该家族中一些成员促进凋亡，如Bax基因；另一些则阻碍凋亡，如Bcl-2基因［3］。体内细胞凋亡与增殖的不平衡与许多疾病有关［4］。
2 肿瘤的产生
30万亿正常细胞是一个复杂和相互依赖的共同管理、相互调控对方的大环境。一个细胞只有当收到附近其它细胞的生长刺激信号时才会增殖，收到抑制信号时则停止生长。这种相互作用使每一种组织得以维持一定的大小和形状，以适应机体需要。
癌细胞则与之截然相反，它们对于正常控制增殖的信号不加理会，只遵循它们自己内在的增殖标准。它们甚至可以移动、入侵邻近组织。由于这种恶性肿瘤细胞组成的肿瘤会入侵越来越多的组织，所以当它们干扰了机体生存所需的器官和组织后就导致机体死亡。
癌细胞是如何产生的呢?许多原癌基因正常时的作用是把外界生长刺激信号传入细胞内。当一种原癌基因突变后影响一个重要的生长刺激信号时，就会使本该沉默的基因活化。有的原癌基因突变后会干扰细胞中的部分信号级联途径，如Ras蛋白，从而在没有受到外界生长刺激信号的情况下，体内基因也被激活。外界的抑制信号也由于信号级联途径受到干扰而无法传入胞内。此外，癌细胞的细胞周期也受到干扰。1/2肿瘤细胞中的p 53基因都缺失或丧失功能，使p 21蛋白失去了抑制细胞周期蛋白、CDK5以及两者复合物的能力，从而使细胞周期失去了限制。组织一般有两种控制增殖并避免癌症的方法：一个是当细胞内重要成分受损或控制系统失调时导致细胞凋亡；另一个系统是细胞增殖倍数的限制。
细胞是如何控制自身增殖倍数的呢?染色体末端的端粒充当了计数器，并在一定时期开始启动衰老和危机。当每次增殖后进入S期时端粒都会微微变短，当长度低于一定阈值它们就启动细胞进入衰老。若细胞仍未经历衰老，进一步的缩短将最终导致危机，即过分短的端粒会导致细胞中的染色体融合或断裂，给细胞造成致命性打击，从而限制细胞增殖能力。端粒酶在正常细胞中几乎不存在，而几乎所有的癌细胞都有该酶，该酶编码的端粒代替了每次细胞周期中被缩短的端粒片段，从而保持了端粒的长度以不受增殖限制。
癌细胞也有几种逃避凋亡的方式。大多数癌细胞p 53基因丢失或无功能，而有一些癌细胞中产生过多Bcl-2蛋白，这些都可以有效避免凋亡［5］。当癌细胞突破这最后两道防线时它们就获得了永生。这不仅使肿瘤可以无限制生长，而且给了原癌细胞或癌细胞以足够长的时间来进行突变以增加复制和扩散能力［2，6］。
3 细胞凋亡与癌症治疗
在最近的30～50年中，癌症治疗主要依赖于各种细胞毒放疗和化疗，这些措施对许多血液恶性肿瘤和一些实体瘤，特别是对生殖细胞和一些儿童的恶性肿瘤有一定的治疗作用。但恶性肿瘤对这些措施有一定抗性，使用大剂量化疗会使抗性反应有一定好转但不会有所突破，而且正常组织和细胞也受到这些细胞毒的杀伤。
长期以来，人们认为肿瘤治疗是选择性地以快速分裂的细胞为靶细胞，但在临床上这种解释并不令人满意。因为可治疗的癌症有时生长缓慢而有抗药性的癌症中也可能快速分裂。更多的事实表明，治疗可能是在肿瘤细胞中诱导凋亡，而各种细胞凋亡的阈值不同造成了对治疗的反应不同［7］。
放疗的基础理论是体外的剂量依赖性模型与临床反应相关，DNA修复在放疗敏感性中扮演重要角色。从而人们推论敏感细胞与抗性细胞相比可能是修复能力差些。但近来的发现与这个观点相矛盾，如p 53基因损伤的肿瘤细胞对放疗有抗性，但是DNA的修复能力却很差。这与预计的结果不符合，暗示放疗可能并不是通过破坏DNA而是直接杀死肿瘤细胞的。凋亡提供了一个令人信服的解释——肿瘤并非死于DNA损伤而是诱发了凋亡程序，DNA损伤在凋亡诱导中也许十分重要，但是不可能直接杀死细胞，因此凋亡可能是放疗诱导的肿瘤死亡的机制［4］。
在研究表臼亚乙苷(拓扑异构酶Ⅱ抑制剂)和其它化疗药物时发现表臼亚乙苷诱导核内DNA断裂，这意味着它可能是通过凋亡来导致细胞死亡。从那以后，诱导凋亡的化疗药物的范围不断扩大，支持凋亡在化疗活性中的作用的事实不断积累。现已知通过凋亡的化疗药物有表臼亚乙苷、5-氟尿嘧啶、顺铂、长春新碱等。
这些化疗药物在许多细胞株的组织培养物中都可诱发凋亡，包括正常的胸腺细胞、淋巴瘤细胞、卵巢癌上皮细胞、白血病细胞、腺瘤细胞等。凋亡的产生可以用形态学观察，琼脂糖凝胶电泳，流式细胞仪来检测DNA含量或用其它标准来判定。
已有研究表明化疗药物在体内同样诱导细胞凋亡。例如在体内用视黄酸处理后T淋巴细胞凋亡；体内对食道癌细胞放疗和化疗(5-氟尿嘧啶、顺铂，博来霉素)处理后诱导细胞凋亡。
化疗诱发细胞凋亡的机制与凋亡调节密切相关。例如，许多化疗药物(如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)都是通过活化ICE或相关蛋白酶而引发最终的凋亡执行阶段。Bcl-2基因的过度表达也可以对抗一些化疗药物(如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、地塞米松、喜树碱、放线菌素 D)引起的细胞凋亡。Bax基因的少量表达也与癌症对联合化疗不良的反应及癌扩散有关。其它的凋亡调节剂也显出与化疗诱导的细胞死亡相作用。如破坏p 53基因可以保护乳腺细胞免遭顺铂诱导的凋亡；Epstein-Barr病毒蛋白BHRF 1(与Bcl-2在结构和功能上都类似)可以使细胞不受表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和顺铂诱导的凋亡；Safingol(一种蛋白激酶C抑制剂)可以增加丝裂霉素C杀伤肠癌细胞的能力。
由于凋亡的诱发及调节机制十分复杂，所以各种肿瘤药物诱发细胞凋亡的机制也不尽相同。博来霉素(BLD)引起细胞凋亡机制与进入胞浆中的BLD数目有关。当数千个BLD进入胞浆后，细胞周期停滞在G2/M期，同时伴有细胞肿胀，核多形性改变并逐渐死亡；而当数百万个BLD分子进入胞浆后，细胞很快凋亡并伴有特征性DNA降解［8］。紫杉醇对同步在G0/G1期和G1/G2期的细胞均可在20 h内诱发凋亡。它是通过使Bcl-2表达下降且磷酸化灭活并同时激活Bax基因而诱发凋亡的，p 53基因在其中并无影响。阿霉素是通过升高二脂酰甘油的水平导致PKC激活，PKC可通过拓扑异构酶Ⅱ的磷酸化而直接作用DNA，导致DNA损伤和细胞凋亡［9］。阿糖胞苷(Ara-c)通过下降c-myc,Bcl-2基因表达而导致细胞凋亡，小剂量的Arg-c是S期特异性药物，而中大剂量则不限于S期［10］。顺铂在低剂量时使细胞生长停滞于G2期而不凋亡，高剂理时则诱发凋亡［8］。VP-16主要是引起聚(ADP-核糖)多聚酶活性提高，而该酶可直接激活钙/镁性依赖核酸内切酶，并且不被蛋白合成抑制剂所抑制［11］。
4 细胞凋亡与抗药性
放疗与化疗对癌症都有显著疗效，主要的障碍是许多肿瘤细胞对各种治疗都有抗性，所以细胞的抗药性成为研究的焦点。对凋亡的抗性成是抗药性的主要机制之一，许多其它抗药性机制已在体外肿瘤细胞中得到证实，包括药物代谢水平升高、药物积累改变、药物靶目标扩增、修复受损目标、多药抗性与MDR编码的p-糖蛋白、多药抗性蛋白、p450活性增加、多种药物靶目标——拓扑异构酶Ⅱ突变等。对凋亡的抗性是抗药性中新发现的机制，可以解释相当一部分治疗失败的原因［12，13］。
实际上不存在绝对的对抗化疗和放疗诱发的凋亡，只是相对于正常组织细胞的难易程度而已。许多肿瘤细胞都比正常细胞的抗凋亡能力强，故几乎不存在可以选择性杀伤肿瘤细胞而不杀伤正常宿主细胞的治疗方法［14，15］。
尽管我们对凋亡的产生及调控已有了初步的认识，但如何把它们应用于临床实践仍是一个大问题。但我们相信，随着基础研究的进一步深入，将为肿瘤治疗的成功或失败提供科学依据，并可为发掘新的抗癌药物拓宽研究领域。
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细胞凋亡范文第4篇
Role of DR5 in TRAIL induced apoptosis of Jurkat cells
【Abstract】 AIM: To study the role of DR5 in TRAIL apoptotic signal transduction in Jurkat cells. METHODS: cDNA containing fulllength extracellular domain of human DR5 was cloned into pGAPZα. Recombinant Pichia pastoris clone generated via homologous recombination secreted high levels of sDR5. BALB/c mice were immunized with sDR5 in CFA to prepare antiDR5 mAb. The binding of antiDR5 mAb was measured for surface expression of TRAIL receptor by flow cytometric analysis. Jurkat cells were tested for their susceptibility to apoptosis induced by TRAIL with TRAIL apoptosis kit so as to study the correlation between DR5 expression level and TRAIL sensitivity. The level of DR5 expression on Jurkat cell line was examined by flow cytometry. The rates of TRAILinduced apoptosis and antiDR5 mAb blocking on Jurkat cells were tested by flow cytometry with TRAIL apoptosis kit. RESULTS: The killing role of TRAIL was blocked in Jurkat cells pretreated with antiDR5 mAb. The average percentage of blocking was 90.49%. CONCLUSION: AntiDR5 mAb can specifically bind to DR5 and DR5 is expressed at high levels on Jurkat cells. DR5 plays a very key role in TRAIL induced apoptosis in Jurkat cells. DR5 expression is important for the induction of apoptosis by TRAIL.
【Keywords】 Jurkat cells; TRAIL; apoptosis; DR5; antibodies， monoclonal
【摘要】 目的： 探讨DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中的作用. 方法： 用含人全长DR5细胞外全长结构域重组DR5免疫BALB/c小鼠，制备抗DR5 mAb. 将96孔U型细胞培养板加1×105/孔Jurkat细胞和5 mg/L抗DR5 mAb，采用TRAIL试剂盒检测细胞凋亡率. 结果： 抗DR5 mAb与Jurkat细胞表面的DR5作用后，TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎被抗DR5 mAb完全阻断，阻断率高达90.49%. 结论： DR5在TRAL诱导的Jurkat细胞凋亡中起关键作用.
【关键词】 Jurkat细胞；TRAIL；细胞凋亡；DR5；抗体，单克隆
0引言
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand， TRAIL）是近几年新发现的TNF 超家族成员，TRAIL与其受体结合可以诱导大多数肿瘤细胞凋亡而对大多数正常细胞无影响. 已经发现，TRAIL有5种受体，即2种死亡受体（DR4， DR5）、2种诱骗受体（DcR1， DcR2）及可溶性受体OPG(osteoprotegerin). 其中只有DR4［1］和或DR5有胞内死亡结构域，诱导细胞凋亡. DR4和DR5在诱导细胞凋亡方面具有相同的作用，但哪一种受体在TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡方面更为重要仍不清楚. 发展和应用TRAIL 不同受体的特异性抗体是分析这两种不同受体所参与的死亡途径的关键. 我们用特异性抗DR5 mAb阻断DR5的功能，并应用流式细胞仪检测TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡情况，以探讨DR5在TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡中的作用.
1材料和方法
1.1材料
含有人DR5细胞外结构域全长cDNA的毕赤酵母表达载体菌株由美国宾夕法尼亚大学医学院病理医学实验室陈有海教授馈赠. Jurkat细胞为本室保存细胞株传代培养于含2.0 mmol/L L谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠、10.0 mmol/L HEPES， 1.0 mmol/L丙酮酸钠、100.0 mL/L FBS， 1×105 U/L 青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基. DMEM/HAT和DMEM/HT选择培养基（Sigma公司）. TRAIL凋亡检测试剂盒（Upstate biotech）. FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）.
1.2方法
1.2.1抗DR5 mAb制备及特异性鉴定
1.2.1.1抗DR5 mAb制备参照文献［2］制备抗DR5 mAb. 抗DR5 mAb类型经ELISA法测定mAb的类型分别为IgG1(YM 366， YM 369)和IgM (YM 362， YM 363， YM 367 )，两者均可与sDR5结合，经流式细胞仪分析发现仅IgG能与Jurkat 细胞表面的DR5结合.
1.2.1.2流式细胞仪分析mAb与胞膜DR5结合取生长状态良好的Jurkat细胞，用含 50 g/L BSA 的PBS洗涤3次，计数细胞，取1×105细胞与杂交瘤细胞培养上清100 μL混合，冰浴反应30 min. 预冷PBS洗涤细胞3次，然后每孔加1 μL FITC标记的山羊抗小鼠IgG或IgM（Jackson Immuno Research），冰浴30 min. 预冷PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪进行分析（FACScan， Becton Dickinson）.
1.2.1.3sDR5对mAb膜结合的阻断作用将10 μL sDR5 (178 mg/L)与100 μL杂交瘤培养上清室温反应30 min，然后与1×105 Jurkat细胞混合，冰浴反应30 min. 预冷PBS洗涤细胞3次，然后每孔加1 μL FITC标记的山羊抗小鼠IgG，冰浴30 min. 预冷PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪进行分析.
1.2.2细胞表面DR5表达水平检测将生长状态良好的Jurkat细胞用含50 g/L BSA PBS洗涤3次，计数细胞，取密度为1×108/L的细胞100 μL，加抗DR5 mAb 1 μg，冰浴反应30 min. 预冷PBS洗涤细胞3次，加PBS 100 μL和FITC标记的羊抗小鼠IgG 1 μL 混合，置冰浴30 min. PBS洗涤3次后用流式细胞仪进行分析.
1.2.3TRAIL诱导细胞凋亡率的检测TRAIL凋亡检测试剂盒检测Jurkat细胞凋亡率，50 μL培养基加至96孔U型细胞培养板，第1孔加50 μL TRAIL，终浓度为100 μg/L，并做倍比稀释. 每孔加50 μL小鼠抗TRAIL mAb IgG1至终浓度为1.5 mg/L，加待测细胞悬液100 μL，细胞终浓度为1×109/L. 37℃， 50 mL/L CO2培养12 h， PBS洗涤3次，每管加PBS 100 μL， PI 10 μL，流式细胞仪检测细胞凋亡率.
1.2.4DR5 mAb对TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡的阻断效应将96孔U型细胞培养板加1×105/孔Jurkat 细胞及5 mg/L抗DR5 mAb，室温反应30 min，按1.2.3方法检测TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡率.
2结果
2.1DR5 mAb与胞膜表面DR5结合特异性检测
2.1.1DR5 mAb与胞膜表面DR5结合率经ELISA分析融合出的5株杂交瘤细胞所有产生的抗DR5 mAb 均能与sDR5结合，mAb类型影响与胞膜受体的结合，只有抗DR5 IgG 类抗体(YM 366， YM 369)能够结合至Jurkat细胞表面（Fig 1）. IgM 类抗体(YM 362， YM 363， YM 367)无法与细胞膜结合. 6A5是不产生DR5 mAb杂交瘤培养上清.
2.1.2sDR5对mAb阻断作用在无sDR5条件下YM 366 mAb的ELISA A450 nm值为1.76，用2.5， 5.0， 7.5， 10.0 μg sDR5中和抗DR5 mAb， A450 nm值分别为1.25， 0.25， 0.22， 0.15，随着sDR5浓度的增加对YM 366的中和作用增强，在高剂量时可以完全阻断mAb的作用，说明YM 366与DR5特异性结合.
2.1.3sDR5对DR5 mAb膜结合阻断结果sDR5能够完全阻断DR5与Jurkat细胞膜的结合（Fig 2）. 说明抗DR5 mAb与细胞膜DR5的结合是特异性的. 实心曲线代表mAb与DR的结合，空心曲线代表sDR5的阻断作用.
2.2DR5在Jurkat细胞表面表达DR5在Jurkat 细胞表面的表达率为94.83%，证明DR5 在Jurkat 细胞表面的高水平表达（Fig 3）.
2.3TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡及抗DR5 mAb的阻断作用TRAIL及抗TRAIL mAb联合应用能够诱导其敏感细胞株Jurkat细胞的凋亡，并呈现明显的剂量相关性. TRAIL浓度在50~100 μg/L时对Jurkat细胞的凋亡率达90%以上. 预先用抗DR5 mAb与Jurkat细胞表面的DR5作用后，TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎完全被mAb所阻断，其平均阻断率达90.49%（Fig 4）.
3讨论
目前，TRAIL与TRAIL受体抗肿瘤的信号传递过程及调节以及正常细胞对TRAIL抗性机制尚未完全清楚［3］. TRAIL能够与两种不同的膜结合受体DR4， DR5、两种诱骗受体DcR1， DcR2及可溶性受体OPG相结合［1］. DR4和DR5均含有传导TRAIL凋亡信号所需要的胞内死亡结构域(death domain， DD)，与TRAIL结合可以引起细胞凋亡，DcR1和DcR2的膜外区有两个与DR4 和DR5高度同源的富含半胱氨酸的伪重复序列，能够与TRAIL结合，但DcR1没有胞内DD，DcR2的胞内区则仅有一段不完整的DD，因此二者都不能传递TRAIL的死亡信号［4，5］.
虽然DR4和DR5在4℃与TRAIL具有相似的结合力，但在37℃ DR5与TRAIL的亲和力最强［6］. 最近发现因各种因素如IFN及许多化疗药物增加细胞对TRAIL凋亡的敏感性也是通过提高DR5的表达实现 ［7-9］，上述结果说明， DR5在TRAIL诱导细胞凋亡方面十分重要，但并不能完全排除DR4的作用， 区别DR4和DR5在介导TRAIL凋亡中的作用及功能比重，对了解TRAIL的抗肿瘤机制、调控及TRAIL的临床应用均十分必要. 在过去的报道中，对DR5的研究主要采用mRNA水平的检测，而mRNA的表达不能完全反映蛋白质的表达水平，对DR5细胞质和细胞膜表达情况也缺乏了解，只有表达于胞膜的DR5才能介导TRAIL凋亡功能. 为了探讨DR5表达与细胞对TRAIL敏感性的关系及进一步探讨TRAIL的功能，我们通过基因工程技术获得DR5高表达工程菌，用sDR5免疫BLAB/c小鼠，融合、筛选出5株抗DR5杂交瘤细胞. 制备2种能与sDR5和胞膜DR5结合并具有封闭TRAIL凋亡的mAb. 用ELISA方法检测发现，抗DR5 IgM和IgG类mAb均可以与sDR5结合，但用流式细胞仪分析发现仅IgG类mAb 能与细胞膜表面的DR5结合. 为确认抗体的特异性，采用ELISA和流式细胞分析发现，sDR5可以阻断抗DR5 mAb与包被到ELISA反应板上的sDR5及Jurkat细胞结合，说明制备的 mAb是DR5特异性，而且IgG类mAb是与胞膜表面DR5表位相结合. 为检测不同浓度sDR5对抗DR5mAb结合Jurkat细胞的抑制效应，我们将YM 366与sDR5混合30 min，然后检测其结合受体的比率. 最低浓度的sDR5仍能抑制YM 366结合Jurkat细胞DR5. 在筛选出的2株 （YM 366和YM 369）mAb 中YM 366的结合能力强. 竞争实验发现YM 366可以有效地与TRAIL竞争性地与DR5结合，从而阻断TRAIL的凋亡作用，说明YM 366能够识别TRAIL与DR5结合的表位. 用YM 366分析发现DR5在Jurkat细胞表面表达为94.83%. 虽然有关TRAIL每一种受体生物学功能及结合时所产生的信号仍不十分清楚，但在此研制的DR5 mAb为受体的研究提供一种十分有价值的工具.
因此，我们制备出能够与DR5特异性结合的mAb，并在TRAIL敏感细胞株Jurkat表面直接检测到DR5的高水平表达. 我们采用TRAIL与抗TRAIL mAb交联诱导Jurkat细胞的凋亡，并呈现明显的剂量相关性，TRAIL浓度在50~100 μg/L 时对Jurkat细胞的杀伤率达90%以上. 预先用抗DR5 mAb与Jurkat作用后，TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎完全被mAb所阻断，其平均阻断率达90.49%. 结果说明，DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中起着十分关键的作用，并占有绝对的功能比. 由于增加TRAIL的浓度并不能提高Jurkat细胞的凋亡率，说明在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡方面DR4没有发挥作用. 结果也表明，该mAb是一种有效的DR5阻断抗体，能够和DR5特异性结合，对研究TRAIL的作用机制及调控将会十分有价值.
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细胞凋亡范文第5篇
[关键词] 椎间盘退变； 髓核细胞； 细胞培养；白细胞介素-1β；凋亡
[中图分类号] R681.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2011）07（c）-020-05
IL-1 β induce apoptosis of human nucleus pulposus cells
WANG Xinguang1, YE Wei2, GUO Hanming1, KANG Ming1, CHEN Qiulan3, DU Kaili2, HUANG Dongsheng2*
1.Department of Orthopedics, Huizhou Municipal Central Hospital, Guangdong Province, Huizhou 516001, China; 2.Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangdong Province, Guangzhou 510120,China; 3.Department of Ultrosound B, Huizhou Municipal Central Hospital, Guangdong Province, Huizhou 516001, China
[Abstract] Objective: To explore the culture of human normal nucleus pulposus cells and evaluate the effect of IL-1β on the apoptosis of human nucleus pulposus cells. Methods: Human normal nucleus pulposus tissue were separated from the idiopathic scoliosis patients, and the nucleus pulposus cells were isolated with sequential trypsin and collagenase, the expression of glycosaminoglycan, proteoglycan and collagen Ⅱ were detected by the toluidine blue, safranin O and immunohistochemistry of collagen Ⅱ. Then stimulated with 20 μg/L and 200 μg/L human recombinated IL-1β for 24 hours, the apoptosis rate was detected. Results: The human nucleus pulposus cells could be isolated by trypsin and collagenase and cultured by Dulbecco′sModified Eagle Medium and Ham′s F-12 medium. The expression of glycosaminoglycan, proteoglycan and collagen Ⅱ could be detected in human nucleus pulposus cells. The apoptosis rate in IL-1β 20 μg/L group(8.46%) and IL-1β 200 μg/L group (19%) was 2.95 times and 6.63 times of the control group (2.86%) respectively (P
[Key words] Intervertebral disc degeneration; Nucleus pulpusus cell; Cell culturing; Interleukin-1β; Apoptosis
退变的椎间盘可以检测到大量炎性因子的表达[1]，体外实验也证实炎症因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）可以诱导椎间盘细胞炎症反应的正反馈[2]。同时，在退变椎间盘中细胞数量急剧减少[3]，一些实验证实了细胞凋亡是造成细胞数量减少的主要原因[4]。但是，炎症因子跟椎间盘细胞凋亡之间的关系尚没有明确的关系。
本研究利用酶消化分离单层培养方法培养人正常的椎间盘髓核细胞， 采用不同浓度IL-1β刺激髓核细胞，检测细胞凋亡情况。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
DMEM/F-12，Gibco；通用型胶原酶，Sigma；兔抗鼠Ⅱ型胶原多克隆抗体，Chemicon；胰蛋白酶，Gibco；多聚赖氨酸，Sigma；DMSO，Sigma；胎牛血清，Hyclone；倒置显微镜，Leica；重组人IL-1β，Cytolab/Peprotech；Propidium iodide，Bender MedSystems；Annexin V-FITC，Bender MedSystems；流式细胞仪，EpicsAltra Beckman Coulter。
1.2 椎间盘细胞的分离和培养
1.2.1 原代椎间盘髓核细胞的分离和培养[5-6]标本来自特发性脊柱侧弯患者（图1），男女各2例，年龄13～15岁，L2/L3 2例，L3/L4 2例，前路手术时取出椎间盘组织后送往实验室，在超净台上，椎间盘组织用冰PBS溶液漂洗3次，分离出中央的胶冻样髓核组织，并将其剪成直径约1 mm的组织颗粒，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5%CO2 的培养箱中培养8 h，离心PBS漂洗后加入4倍于组织块体积的0.25%胰蛋白酶，37℃振荡下髓核组织消化20 min，离心去除胰酶，PBS漂洗2次后加入2倍于组织块体积的通用型胶原酶，并加入同样体积的含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃振荡培养6 h，收集上清至另一离心管，离心后去除上清液加入8 ml DMEM/F12培养基吹打均匀，180 g离心1 min去除杂质，将上清液移至另一离心管离心去除上清，分别再加入10 ml培养基吹打均匀后转移到25 cm2 培养瓶中在37℃、5%CO2 的培养箱中培养。细胞贴壁后定时，按时用倒置显微镜观察、拍照。
1.2.2 细胞计数、活力测定将一小滴细胞悬液滴在血球计数板上，然后按下式计算出每毫升细胞悬液的细胞数。（四大格中细胞数/4）×10 000=细胞数/ml。将细胞悬液和0.5%台盼蓝液按1∶1体积比混合后，2 min后计数100~200个细胞。活细胞圆形透明，死细胞被染成蓝色，用活细胞计数细胞中的百分比表示细胞活力。
1.2.3 细胞传代原代细胞铺满培养瓶80%~90%时，进行传代，吸出瓶内旧培养液。用PBS液洗涤细胞2遍后向瓶内加入1 ml 0.25%胰酶（0.02%EDTA），室温下消化，镜下观察细胞变圆时加入含10%胎牛血清的DEM/F12培养基终止反应。用吸管顺一个方向轻轻吹打瓶底细胞，细胞脱落后，吹打成均匀混悬液。 将细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，将细胞吹匀，以细胞密度3×105/ml接种六孔板制备细胞爬片或传至25 cm2培养瓶中继续培养。
1.3 椎间盘细胞的染色
将第一代细胞制成细胞爬片，待细胞达到80%~90%融合时，将细胞爬片取出，4%多聚甲醛固定20 min，进行HE、甲苯胺兰、番红-O、Ⅱ型胶原染色。
1.4 实验分组
原代椎间盘髓核细胞融合达85%～90%时以3×105细胞/孔传代于六孔板中。细胞培养在10%FBS培养基中，37℃、5% CO2培养箱中。当六孔板中细胞融合达80%以上时，培养基更换为1%FBS培养基，培养温度不变， CO2浓度不变。
实验组分为3组，第一组空白对照组：1%FBS培养基培养8 h后单纯更换为1%FBS培养基。第二组IL-1β（20 μg/L）组：1%FBS培养基培养8 h后更换为1%FBS培养基并加入IL-1β（20 μg/L）。第三组IL-1β（200 μg/L）组：1%FBS培养基培养8 h后更换为1%FBS培养基并加入IL-1β（200 μg/L）。
以上3组在培养箱培养24 h后倒置显微镜观察细胞凋亡，Annexin V-FITC/Propidium iodide双染检测凋亡。
1.5 流式细胞术判断细胞凋亡
贴壁细胞用的胰酶（不含EDTA）消化收集； PBS 洗涤细胞2次（离心1000 r/min，5 min）收集（1～5）×105细胞；稀释Binding Buffer（1∶4）； 每管加入Binding Buffer 195 μl，5 μl Annexin V-FITC 混匀后，再加入10 μl Propidium Iodide，混匀； 避光、室温反应5 min； EpicsAltra流式细胞仪分析。
结果判断：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，Annexin V对PS有高度的亲和性；凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染，在细胞凋亡早期PI不会着染，正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；右下象限为凋亡细胞，为（FITC+/PI-）[7]。所有实验至少重复3次。
1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，采用单因素方差分析（One Way ANOVA）。
2 结果
2.1 椎间盘髓核细胞单层培养以及形态观察
用胶原酶消化的原代细胞为圆形，胞浆多，核明亮而清楚，也可见少数尚未完全消化的几个成团抱在一起的细胞团（图2）。原代髓核细胞贴壁后并逐渐变为梭形。1周左右，细胞间开始有突起相连接，细胞保持单层生长，经过15～20 d融合，连接成片（图3）。第一代细胞经过台盼蓝染色后活性细胞约为95%。
2.2 髓核细胞的鉴定
第一代髓核细胞HE 染色显示细胞呈圆形或椭圆形，核为圆形，位于胞浆中央，呈蓝色，胞浆呈粉红色（图4）。甲苯胺兰染色胞浆染成淡蓝色（图5），番红-O 染色被染成红色（图6）。Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、苏木素复染后核呈蓝色，胞浆为棕黄色（图7），细胞阳性率为98%。分别说明细胞能分泌糖胺多糖、蛋白多糖以及分泌合成Ⅱ型胶原。
2.3 凋亡的评估
3组第一代细胞培养的第24小时，由Annexin V-FITC/propidium iodide双染，FCM分析细胞凋亡。细胞凋亡率由公式计算得出（细胞凋亡率＝凋亡细胞数/细胞总数×100%）。流式细胞术结果如图，右下象限表示细胞早期凋亡率（图8），细胞凋亡率评估，结果由SPSS 13.0输出，各组实验组凋亡率与空白对照组凋亡率比较标准化后结果和单因素方差分析结果见表1，与空白对照组（2.86%）比较， IL-1β 20 μg/L组（8.46%）以及 IL-1β 200 μg/L组（19%）中椎间盘细胞凋亡率显著升高，分别为空白对照组的2.95倍（P
3 讨论
下腰痛是目前最常见的疾病之一，约80%的人一生中会有腰痛的经历[8]。虽然下腰痛病因未明，但是腰椎间盘退变是主要原因[9]。而目前对椎间盘退变性疾病的治疗手段主要是保守治疗（包括运用甾体类和非甾体类止痛药、理疗、牵引等）和手术治疗（包括单纯的椎间盘髓核摘除、腰椎融合以及椎间盘置换等）。但是这些治疗都不是针对退变的原因，不能从根本上治愈椎间盘退变，只能改善椎间盘退变所引起的症状，而且有些手术治疗甚至会加重腰椎不稳以及临近节段的失代偿。髓核细胞在维持正常椎间盘内环境稳定以及在修复椎间盘退行性变过程中发挥着重要作用，越来越多的研究将椎间盘髓核细胞作为组织工程学研究的重点[10]。
人椎间盘有独特的结构，其内没有血管供应能量及氧气，其营养以及物质代谢依靠周围组织液渗透交换进行，其内的细胞处于低氧、酸性、高应力的环境，这样特殊的体内微环境加上椎间盘组织中细胞的低密度，使椎间盘细胞的体外培养比较困难[11]。椎间盘组织包括3个截然不同的区域，髓核富含Ⅱ型胶原、蛋白多糖和水，此外，还有少量其他胶原纤维。因此本实验采用胰蛋白酶以及通用型的胶原酶序贯消化，保证了消化的完全性。目前文献所报道的椎间盘髓核细胞培养所用培养基大部分是DMEM/F-12[12]，本实验使用DMEM/F-12培养基培养人正常髓核交界细胞获得成功。采用HAM F212 培养基加10% 胎牛血清特别适用于单细胞培养， 在5%CO2培养箱内， 每2～3 天换液1 次， 可使细胞在培养液中生长良好。
髓核细胞本质上是类软骨细胞[13]，目前尚无特异性的标志物进行鉴定[14]，主要是通过形态学观察，以及根据髓核细胞能分泌蛋白多糖、番红-O、糖胺多糖以及Ⅱ型胶原的特点，检测其的表达来鉴别[15]。本实验正常人椎间盘组织是在手术中由手术技术娴熟的教授从脊柱侧弯患者中完整取出椎间盘组织，然后在超净台分离髓核组织，由于人椎间盘组织较大，能保证取材部位的正确，本研究严格从椎间盘髓核区域取材，切除标本中的软骨终板和纤维环，反复的PBS 冲洗尽量去除表面存在的成纤维细胞和血细胞。通过番红-O对蛋白多糖、甲苯胺兰对糖胺多糖染色，对Ⅱ型胶原进行免疫组化鉴定，证实本实验通过上述方法所培养髓核细胞具有软骨细胞的表征。
在退变的椎间盘中，可以检测到大量炎症因子的存在[16]，提示炎症因子可能在椎间盘退变中发挥着重要的作用。在体外实验中，IL-1β能够诱导椎间盘细胞产生内源性IL-1β，有证据支持在退变椎间盘中存在IL-1β的正反馈环能够上调一些炎症介质[2]。此外，IL-1还可以诱导多种基质降解酶表达[5-6]，降低椎间盘细胞合成蛋白多糖、 collagen Ⅱ、 collagen Ⅰ，并能够诱导产生IL-6、 cyclooxygenase-2（COX-2）、 stromolysin-1 及 prostaglandin E2[17]。关于IL-1β与椎间盘细胞凋亡的研究，通过IL-1β预刺激大鼠椎间盘内层纤维环与交界处细胞，增加了Fasl诱导的细胞凋亡[18]。此外，IL-1β还能增加无血清培养所诱导的大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡[19]。本实验结果显示IL-1β可以诱导人正常椎间盘髓核细胞凋亡，而且加大IL-1β的浓度，其凋亡也会明显增加。虽然没有证据表明在人退变椎间盘中IL-1β的浓度会达到200 μg/L，但是体外实验跟活体实验是不同的，而且低浓度的炎症因子的长期作用跟高浓度短期作用是否一致还需进一步的研究。
本实验是第一次在人正常椎间盘髓核细胞体外实验上证实了炎症因子可以诱导髓核细胞的凋亡，对于揭示人椎间盘退变的病理生理过程有重要意义。
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