细胞与分子生物学技术范文第1篇

一、《生物电子显微学技术》课程的教学内容与要求 

1.《生物电子显微学技术》课程的理论教学内容。《生物电子显微镜技术》理论课程20学时，教学内容包括：电子显微镜的发展与应用、透射电子显微镜原理与制样、扫描电子显微镜原理与制样、免疫电镜细胞化学技术、冷冻切片技术与冰冻蚀刻、酶电镜细胞化学技术、电镜放射自显影技术、生物大分子电镜超微细胞化学技术、电镜原位分子杂交技术。 

2.《生物电子显微学技术》课程的实验教学要求。在实验教学中要使学生掌握仪器的基本操作方法，生物样品超薄切片技术、半薄切片技术、负染技术、细胞化学定位技术、扫描电镜临界点干燥技术、离子溅射技术、细胞冰冻蚀刻技术等样品制备方法，使学生能够学会运用电子显微镜技术对动植物组织细胞超微结构和功能的研究方法和技术手段。 

二、生物电子显微镜技术在农学专业研究生教学中的应用 

1.免疫电镜细胞化学技术在农学专业研究生教学中的应用。免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，根据抗原抗体的高度特异性结合原理，用高电子密度的标记物（如：金、铁蛋白等）在超微结构水平上检测某些抗原性物质的定位、定性、半定量的一种方法[2]。目前免疫电镜技术主要包括酶免疫电镜技术、免疫铁蛋白技术和免疫胶体金技术，此外还有抗体杂交技术、凝集素电镜标记技术和铁蛋白-抗铁蛋白电镜复合物技术。可用于农业作物抗旱、抗旱品种选育，品种间生长发育组织学特性表征抗原的定位分析；动物疾病微生物学鉴定、诊断和致病机制研究；动物组织胚胎发育，干细胞诱导发育研究，动物肿瘤的组织学诊断；林果品种发育结构特征等领域的科研研究。 

2.冷冻切片技术与冰冻蚀刻在农学专业研究生教学中的应用。冷冻切片技术是利用液氮快速冷冻技术，在冷冻超薄切片机中进行冷冻切片。省去了传统的戊二醛/俄酸固定、乙醇脱水、丙酮置换等有机溶剂操作过程，避免了化学药剂的处理，样品结构、成分不发生变化，实现快速固定，快速制片、快速研究与诊断的能力，保持了细胞或组织的生物活性物质的原始状态。冷冻蚀刻技术是利用物理冷冻断裂方法对生物样品组织细胞进行断裂和复型相结合的制备透射电镜样品技术，用透视型电子显微镜观察细胞或细胞器的内、外表面微细的三维结构或膜内微细结构分析的方法[3]。可用于动植物新鲜组织细胞的超微结构、生物大分子和某些元素在组织内分布、免疫抗原电镜标记、细胞酶活性标记、电镜放射自显影等细胞的化学和细胞成分的定量定性分析。 

3.酶电镜细胞化学技术在农学专业研究生教学中的应用。电镜酶细胞化学技术是通过酶的特异性细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位技术。一般先将酶原位固定在细胞内，再使它与特定的底物起反应，底物的分解物经过捕捉反应沉着于发生分解的原位上，最后使沉着物变为在电镜下可以看到的物质。在整个处理过程中必须保存酶的活性不受破坏。目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、氧化还原酶和转移酶[4]。 

电镜酶细胞化学技术可应用于农作物棉花、小麦、玉米、水稻等作物的生长发育、品种选育、营养成分检测等方面研究；动物生长代谢机制、不同畜禽品种间组织细胞形态学和生理生化机制差异；牛、羊等畜产品贮藏方法和无公害研究；动物超微解剖学、动物生理功能机制、动物发病机制、动物病原微生物形态、动物免疫学机制、动物药物作用机理、药物成分和结构等方面研究工作。 

4.电镜放射自显影技术在农学专业研究生教学中的应用。放射自显影技术是利用放射性核素所产生的射线作用于感光乳胶的卤化银晶体而产生潜影，再经过显影定影处理，把感光的卤化银还原成黑色的银颗粒，即可根据这些银颗粒的部位和数量分析出标本中放射性示踪物的分布，以进行定位和定量分析[5]。可通过放射自显影技术定位功能，对组织样品的结构研究和目的成分检测进行分析，可应用于动物组织细胞的活性蛋白表达、活性物质的组织分布、检测物质的组织定位，以及肿瘤、免疫疾病、传染性疾病的特异性诊断；生物肥料物质的吸收及植株内的动态分布，抗旱、抗旱功能蛋白的组织内定位，组织内的原位杂交等功能研究。 

5.生物大分子电镜超微细胞化学技术在农学专业研究生教学中的应用。生物大分子是构成生命的基础物质，包括蛋白质、核酸、碳氢化合物等。由于其低相对分子量的有机化合物经过聚合而成的多分子体系。生物大分子在各种生物活性和在生物新陈代谢中发挥重要作用[6]。通过电子显微镜技术可以观察生物大分子的理化特性及空间构像与功能研究；核酸分子的形状和长度、双链或单链的区分、根据长度计算核酸的分子量；进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合体、核酸蛋白质复合体等研究；基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面的研究。应用范围涉及到生物化学、细胞生物学、微生物、遗传发育、食品、药理、生理、医学、病理、植物、神经科学等的研究工作。

6.电镜原位分子杂交技术在农学专业研究生教学中的应用。原位杂交技术是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸（即探针）与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来[7，8]。自Gall和Pardue建立了原位杂交技术以来这一技术为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学、微生物学、病毒学、医学遗传学和遗传分析等领域研究提供了极其宝贵的资料，发挥了其他技术难以取代的作用，近年来这一技术的应用领域逐渐向电镜水平发展以提高检测的分辨率。 

细胞与分子生物学技术范文第2篇

该实验室积极从国内外引进优秀学术带头人和学术骨干，已经形成了具有创新活力、较强研究实力的全职团队，包括20位正副教授和正副研究员。他们大多具有博士学位和留学工作经历。另外，聘任姚新生院士、袁隆平院士、孔祥复院士、辛世文院士为双聘教授。

实验室针对人类对健康新的巨大需求和21世纪生命科学技术发展的优先方向和核心领域开展健康科学与技术研究，着眼于整体学科的建设和布局，强调与人类健康和疾病相关的多学科集成的综合性、创新性基础研究和应用基础研究，从而提供一个较全面地服务于健康产业的多方位综合性技术服务平台及自主创新的技术引擎。

蔡国平教授始终为实验室的主要研究方向掌舵护航，其研究方向主要包括：强调与人类健康和疾病相关的创新性基础研究及应用基础研究；药物和生物技术及技术产品的源头创新；多学科集成的营养与食品科学和技术研究；以抗体工程和基因治疗为重点的生物技术平台；面向新的医学模式的生物医学工程和技术平台；开拓以个体化的健康管理研究与教育。

2010年，实验室科研项目146项、总经费约2207万元，包括承担国家与政府项目127项，年服务企业（机构）12个，承担企业或社会项目7项。同期，共发表科技论文85篇，其中，SCI52篇、EI25篇。发明专利申请受理7项，专利授权4项，现已拥有发明专利15件。

多年从事健康科学与技术的教学与研究

作为清华大学深圳研究生院的生物学和海洋生物学博士生导师，蔡国平教授曾任生命学部主任、深圳市健康科学与技术国家重点实验室主任。目前还担任深圳市超级水稻研究重点实验室常务副主任、深圳国家生物产业基地深圳研究生院海洋生物技术中心主任、深圳市中药及天然药物研究中心-清华大学深圳研究生院生物技术与创新药物联合实验室副主任、清华深圳研究生院-深圳市北科生物技术有限公司干细胞研究联合实验室主任理事。深圳市科技专家委员会专家、广东“千百十工程”省级培养人才指导教师。中国健康管理学会理事、中国针灸学会经络分会理事、中国药理学报理事。先后在日本机能性肽研究所，香港科技大学，美国Tomas Jefferson大学医学院和Case Western Reserve大学医学院等为客座研究员。

已发表科研论文100余篇，SCI收录40多篇，参与编写著作4部、译著一部，申请和获得国家专利多项。还获得国家发明奖、北京科技进步奖、卫生部科技进步奖等奖项。

蔡国平教授致力于医学细胞分子生物学及健康科学与技术学术方向的研究，并在创新性基础研究和应用研发的统一，学科交叉融合与协作，探索学术与技术创新，形成了一定的学术特色。

主要研究领域与研究工作：

1. 细胞因子的研究：

(1)血管生长因子的研究

基于体外脐带静脉血管内皮细胞的研究数据，提出假说：血管内皮细胞的增殖生长要经历细胞存活、有丝分裂和细胞迁移三个关键步骤，揭示细胞存活因子Apo H、补体Bb，有丝分裂刺激因子 insulin、FGF、细胞迁移因子和血清因子等相关因子在血管内皮细胞的增殖生长的作用。

(2)自身免疫病如抗磷脂综合症相关因子

载脂蛋白H在抗磷脂抗体综合症中作用的细胞与分子机理，发现载脂蛋白H自身抗体一类自身抗体的多重结合特性（特异抗原、磷脂、Fc、凝血酶等）及机体正常抗体作为中和自身抗体的生理缓冲池作用。探讨这种相互作用的生理病理意义。

(3) 促溶栓因子研究

在纤溶系统作用机制创新研究中，发现一类新的促纤溶物质（简称FPA）能使血纤维蛋白溶酶－tPA纤溶系统的纤溶活性提高十多倍之高，并且对凝血与纤溶系统的平衡有双向调节作用。研究FPA与靶分子作用的结构分子生物学机理，为研究开发新型促溶(血)栓药物提供新的研究思路。

(4) 巨噬细胞来源的纤维化疾病相关因子（ISBLP58）的基因克隆和功能研究。

2.血管生长和干细胞分化的研究，开展周血与骨髓基质干细胞向内皮细胞、成骨细胞和成脂细胞分化的机理研究。

3. 膜和细胞生物物理学研究：

1）电磁场对细胞的作用

2）细胞凋亡分子机制

细胞凋亡的能力学过程及调节机制细胞凋亡的能力学及胶原抗羟自由基诱导的细胞凋亡的热力学分析；端粒酶的表达和活化与Bcl-2的表达之间的负相关性及两者间的内在联系与细胞凋亡；细胞凋亡的分子进化。

4.细胞外基质的研究：

1）胶原蛋白、蛋白多糖等细胞外基质的生物化学、生物物理学、分子与细胞

生物学及分子免疫学研究。

2）基质干细胞分化相关疾病（肺纤维化与肝硬化、骨质疏松症、疼痛等）的生理病理机理研究。

3) 提出经络功能集成体（function-grity）的概念，提出细胞外基质在经络功能集成体中作为重要的载体，形成物质、能量与信息流的储存、传输和调节与缓冲的介质连续体, 构成一个机体自检、自稳网络系统和功能集成体并与脑的高级意识和自稳系统协调一致。其机制首先是细胞外基质构成细胞间巨大的生理缓冲池，且胶原纤维等细胞外基质能直接地、长距离地传输电子与能量（包括电磁、机械力和热等能量形式），更重要的是细胞外基质通过与神经、血管的联系，在不同的躯体部位之间，躯体与内脏之间和不同脏器之间的信息传递和汇聚中起重要的传导介质作用，即所谓“行气血，通阴阳，以荣于身也”。同时，它们又可以与细胞内的功能集成体相连接和相互作用，从而在细胞层面上发挥其调节功能。

5．代谢性疾病的细胞分子学研究，着重开展糖尿病、高血脂症和血管硬化及血栓等的细胞分子学研究。

6．创新药物和保健品的研究开发，主要针对代谢性疾病、干细胞分化相关疾病和细胞外基质相关疾病等的化学药物、生物技术药物的研究开发。

7．海洋生物学与海洋生物技术的研究，有针对性地进行海洋生物功能基因等海洋生物学基础研究，开展海洋资源、海洋生物活性物质的研究，开展海洋生态环境保护与海洋药物等研发相关的生物技术研究。

科研成果还体现在多项科技发明专利

《硫代磷酰化氨基酸及其甲酯在制备缓解慢性疼痛药物中的应用》，通过实验发现硫代磷酰化谷氨酸和硫代磷酰化谷氨酸甲酯不仅对CCⅠ模型大鼠损伤神经的异位自发放电的放电频率具有显著的抑制作用，还能降低CCⅠ模型大鼠损伤侧足的热痛刺激敏感程度并可阻碍其进一步的发展。显示硫代磷酰化氨基酸及其甲酯可大大缓解神经性慢性疼痛症状，以硫代磷酰化氨基酸或硫代磷酰化氨基酸甲酯为活性成分，可制备用于缓解慢性疼痛（特别是神经性慢性疼痛）的药物。

《薤白提取物及其制备方法与应用》，从该植物提取物分离到有效活性分子，显示该化合物具有改善骨骼肌的能量代谢，加强胰岛素敏感性，减少腹部脂肪，降低血糖，促进脂代谢等作用，可用于目前日益增加的代谢综合征的防治或2型糖尿病的早期预防。

《肝宁在抗肝纤维化中的新用途》专利发明显示，肝宁能显著改善小鼠实验性肝纤维化程度。显示肝宁可能成为一种有很好前景的抗肝纤维化新药。

细胞与分子生物学技术范文第3篇

【关键词】 机关 门诊部 知识服务

近年来，基因组学、蛋白质组学等分子生物学技术的不断创新和生物信息学的广泛应用，为生命科学研究向深度和广度发展，人类对于疾病认识在细胞和分子水平的不断深入，诊断已经不只停留在症状的望闻问切和器官组织病理的检查，基于细胞和分子水平(蛋白、核酸、多肽、其他标志物)的诊断技术持续升级，从抗原抗体反应到DNA、RNA的复制、转录与翻译，从肉眼显色到荧光显微观察，从单样本检测到生物芯片的批量处理，使得人类对于疾病的认识越来越深刻。个性化医疗服务正在加速发展，新兴市场在不断开发。机关门诊部人员需认清医疗改革大局，更新和拓宽新知识，提升服务质量。本文就生物诊断及其未来的发展趋势进行探讨。

1 生物诊断

1.1 生物诊断的定义与内涵 是指为了明确诊断疾病或检测相关信息，在体外使用生物试剂、诊断对照物、试剂盒、相关装置以及系统生物诊断产品的技术。其内涵包括分子诊断技术、细胞诊断技术。

1.2 生物诊断的发展 是从20世纪50年代的化学实验阶段，发展到20世纪的基因芯片诊断阶段，从检测病原体、疾病蛋白发展到检测相关疾病基因，检验的准确性、灵敏度越来越高，并且开发了适用于医院、防疫站、血库、体检、海关检验、法医学等各种场合，方便易用快捷的生物诊断产品。

1.3 生物诊断产品 生物诊断(体外诊断)产品可分为临床化学、血液学、微生物学、免疫学及其他等领域。由于血糖、血脂以及其他指标的监测及普查的需求，临床化学诊断试剂在生物诊断市场占首要地位，占37%。其次是免疫学检验试剂，由于其可检测范围广，包括免疫疾病、血液疾病、肿瘤及心脏病标志物、激素、传染疾病、血清蛋白、血药浓度(治疗性药物监测)、禁用药物、甲状腺素等，费用低，因而也占据了市场的重要位置，达26%，并且其增长率居所有检验类别首位，达8.8%，高于传统的医学生化检验。

1.4 生物诊断用途 主要应用于医院、血库及检验中心、非处方药(OTC)等。目前，医院及检验中心是最主要的消费场所，约占市场的70%～80%。由于小型诊断仪器以及OTC的普及，在生物诊断产品产业发展较成熟地区，例如美国和欧洲，医用检验试剂份额在逐渐下降。随着技术的发展和健康知识的普及，虽然目前OTC用检验试剂的市场份额不足10%，但将有较高的市场增长率。

1.5 分子诊断技术 分子诊断包括9类技术：扩增技术(基因和信号)、印迹技术、电泳技术、基因芯片技术、探针技术、限制性内切酶技术、限制性内切酶多态性(RELP)分析、RNA干扰(RNAi)分析、单核苷酸多态性(SNP)分析和软件。此外，还有核酸序列分析等，都为疾病诊断提供了更多的辅助信息。以核酸为基础的探针产品，基本都用于检测传染性疾病，如沙眼衣原体、淋球菌和结核分支杆菌;其余为电泳和印迹技术产品，主要是用于亲子和法医学检查鉴定。

1.6 细胞诊断技术 细胞诊断是基于细胞的诊断技术，主要应用于肿瘤、血液学、组织病理学与细胞学、微生物学与病毒学、血液产品的安全、组织移植等多领域的临床检测诊断。细胞诊断在医学检验、活检研究领域的应用已经长达60年，经典的如血液细胞计数和细胞成分和分析。20世纪90年代，该领域技术发生了根本性的变化。

现阶段的细胞诊断高度多样化，基于多个学科(血液学、组织学、细胞学、微生物学和组织移植医学与技术)，包括血细胞计数、流式细胞仪、显微镜及分子诊断等。通过细胞诊断与分子诊断的融合，实现基因检测、细胞分析与疾病诊断、疾病治疗管理的交融。

2 生物诊断领域的发展趋势

全球生物诊断技术处于快速发展时期，其趋势是：定性向定量转化;单项检测向多项组合同步检测演变;手工操作转向半自动及全自动化操作;要求检测试剂特异、快速、准确;诊断试剂向配套、备用试剂和配套服务方向发展。配套的效益，源于改进服务方便用户。现在国外市场上，几乎都已有成套试纸条、配套溶液、预填充色谱柱、预涂薄板、各种参比标准以及专用工具和使用方便的小仪器。诊断试剂的研究集中在分子生物学方法及基因芯片的研发上。全球诊断试剂市场2008年度可以达到391亿美元。主要市场集中于美、欧、日等发达国家和地区，市场占有率高达85%。

经过多年的演变，一系列技术发展促进了分子诊断的完善。随着人类对自身基因结构更深入的了解，将研究出更多的诊断方法和试剂。基因芯片技术的发展，给早期癌症、基因型缺陷病的诊断带来了便利。

3 启示

全球经济的蓬勃发展使得人类对于疾病预防和快速诊断的要求越来越高，医学生物技术发展为新的诊断试剂提供了动力，生命科学研究的许多成果都未被及时应用到临床。高通量技术的发展和新型仪器设备的使用，使检测可以更加方便、快速、准确。在这种背景下，应借助一系列生命科学研究的新知识，以提高机关门诊疾病诊断、治疗和预防的能力。

细胞与分子生物学技术范文第4篇

一、细胞因子与疾病

正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体严格的调控，在病理状态下、细胞因子会出现异常性表达，表现为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因受体的水平增加等。

（一）细胞因子及其受体的缺陷

包括先天性缺陷和继发性缺陷两种病理情况，例如先天性的性联重症联合免疫缺陷病人（XSCID），表现为体液免疫和细胞免疫的双重缺陷，出生后必须在无菌罩中生活，往往在幼儿期因感染而夭折。现已发现这种患者的IL-2受体γ链缺陷，由此导致IL-2、IL-4和IL-7的功能障碍，使免疫功能严重受损。细胞因子的继发性缺陷往往发生在感染、肿瘤等疾病以后，如人类免疫缺陷病毒（HIV）感染并破坏TH后，可导致TH细胞产生的各种细胞因子缺陷，免疫功能全面下降，从而表现出获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的一系列症状。

（二）细胞因子表达过高

在炎症、自身免疫病、变态反应、休克等疾病时，某些细胞因子的表达量可成百上千倍地增加，例如为风湿关节炎的滑膜液中可发现IL-1、IL-6、IL-8水平明显高于正常人，而这些细胞因子均可促进炎症过程，使病情加重。细胞因子的抑制剂有可能这为类症性细胞因子水平升高的疾病。

（三）可溶性细胞因子受体水平升高

细胞膜表面的细胞因子受体可脱落下来，成为可溶性细胞因子受体，存在于体液和血清中，在某些疾病条件下，可出现可溶性细胞因子受体的水平升高。这类分子可能结合细胞因子，使其不再与膜表面的细胞因子受体结合，因而封闭了细胞因子的功能。

二、细胞因子与治疗

，利用基因工程技术生产的重组细胞因子做为生物应答调节剂（BRM）治疗肿瘤、造血障碍、感染等已收到良好的疗效，成为新一代的药物。重组细胞因子做为药物具有很多优越之处。例如细胞因子为人体自身成分，可调节机体的生理过程和提高免疫功能，很低剂量即可发挥作用，因而疗效显著，副作用小，是一种全新的生物制剂，已成为某些疑难病症不可缺少的治疗手段。目前已批准生产的细胞因子药物包括干扰素α、β、γ，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在进行临床试验的包括IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-β等（表4-3、4-4。）这些细胞因子的主要适应症包括肿瘤、感染（如肝炎、AIDS）、造血功能障碍、创伤、炎症等。表4-3已批准生产的细胞因子多肽药物（略）表4-4已批准临床试验的细胞因子多肽药物（略）

细胞因子疗法（cytokinetherapy）基本上可分为两种，即细胞因子补充和添加疗法及细胞因子阻断和拮抗疗法。

（一）细胞因子补充和添加疗法

通过各种途径使患者体内细胞因子水平增加，充分发挥细胞因子的生物学作用，从而抗御和治疗疾病。目前已有多种细胞因子（多为基因重组产品）试用于临床治疗，经大量临床资料验证，以下几种细胞因子的临床适应症比较明确，临床疗效比较肯定。

1．IFN不同型别的IFN各有其独特的性质和生物学活性，其临床应用适应症和疗效有所不同。IFN-α主要用于治疗病毒性感染和肿瘤。IFN-α对于病毒性肝炎（主要是慢性活动性肝炎）、疱疹性角膜炎、带状疱疹、慢性宫颈炎等有较好疗效。IFN-α对于血液系统恶性疾病如毛细胞白血病（有效率达80%以上）等疗效较显著，但对实体肿瘤的疗效较差。虽然IFN-γ的免疫调节作用强于IFN-α，但其治疗肿瘤的效果弱于IFN-α，目前有人应用IFN-γ治疗类风湿关节炎、慢性肉芽肿取得了一定疗效。

2．IL-2目前多将IL-2与LAD/TIL合用治疗实体肿瘤，对肾细胞癌、黑色素瘤、非何杰金淋巴瘤、结肠直肠癌有较显著的疗效，应用IL-2（或与IFN合用）治疗感染疾病亦取得了一定疗效。

3．TNf由于其全身应用副作用严重且疗效差，目前多倾向将其局部应用如瘤灶内注射治疗某些肿瘤和直肠癌，其确切疗效尚待进一步评价。

4．CSF目前主要应用GM-CSF和G-CSF治疗各种粒细胞低下患者。例如与化疗药物合用治疗肿瘤可以降低化疗后粒细胞减少程度，使粒细胞的数量和功能能尽快回升并能提高机体对化疗药物的耐受剂量，从而提高治疗肿瘤的效果。对再生障碍性贫血和AIDS亦有肯定疗效。用于骨髓移植后可使中性粒细胞尽快恢复，降低感染率。此外，应用EPO治疗肾性贫血取得了非常显著的疗效。

（二）细胞因子阻断和拮抗疗法

其基本原理是抑制细胞因子的产生和阻断细胞因子与其相应受体的结合及受体后信号传导过程，使细胞因子的病理性作用难以发挥。该疗法适用于自身免疫性病、移植排序反应、感染性休克等的。例如抗TNF单克隆抗体可以减轻甚至阻断感染性休克的发生，IL-1受体拮抗剂对于炎症、自身免疫性疾病等具有较好的治疗效果。

三、细胞因子的检测

细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标，因而具有重要的实验室价值，同时还可能在临床上有诸多实用价值、包括许多疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测等。但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困维。细胞因子的主要检测包括：

（一）依赖性细胞株

一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些依赖细胞株检测相应的细胞因子。这种方法敏感性高，特异性也不错，但可异的是并非所有细胞因都能找到相应的细胞株，因而限制了它的。

（二）功能检测

利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样的方法敏感性高，但特异性不够，容易受一些扰因素的。

（三）免疫测定

利用抗原抗体反应的原理，制备出抗细胞因子的单克隆抗体或多克隆抗体，可进行细胞因子的免疫检测。这种方法的优点是特异性强、操作简便，缺点是灵敏度不够，且不能代表活性测定的结果。从目前的国际趋势来看，已研制出了高灵敏度、特异性高、高度配套的细胞检测试剂盒，其应用范围正在扩大，有良好的发展前景。

（四）功能测定与抗体抑制

为解决功能定特异性不够，免疫测定灵敏度不够的，可将两种方法结合起来，利用各自的长处，有可能得到较为可靠的结果。在这一方法中，所用的抗细胞因子抗体必须是具有中和活性的抗体。

（五）分子杂交技术

利用分子生物学技术，制备出细胞因子的基因探针，可通过分子杂交技术检测细胞内细胞因子mRNA的表达，这是一种高度敏感和高度特异的检测技术，目前在实验室研究中使用较广，其缺点是操作较为繁琐，测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。

细胞与分子生物学技术范文第5篇

关键词：流式细胞术；临床医学；应用

近年来，随着单克隆抗体的应用及流式细胞术的快速发展，流式细胞术（FCM）已成为许多疾病诊断和分性的重要依据。流式细胞术是20世纪70年展起来的一项高新技术，它作为一门生物检测技术集计算机技术、测量技术、激光技术、流体动力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，是对快速直线运动状态中的细胞、生物颗粒或液体中的大分子物质进行多参数的、快速的定量分析和分选的一种技术［1］。1973年美国BD公司推出全国第一台流式细胞仪，通过对流动液体中排列成单列细胞或颗粒进行逐个检测得到该细胞或颗粒的光散射和荧光指标，分析它们的体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学性质，还能对所需要的细胞进行分选等。具有检测速度快、测量指标多、采集数量大，对所需的细胞或生物颗粒进行分析或分选等特点［2］，其在生物学、临床医学、遗传免疫学、肿瘤学等众多研究领域得到广泛应用。

1流式细胞仪的结构及工作原理

1．1流式细胞仪的结构

主要由五部分组成：（1）流动室及液流驱动系统；（2）激光光源及光束形成系统；（3）光学系统；（4）信号检测与储存、显示、分析系统；（5）细胞分选系统。

1．2流式细胞仪的工作原理

将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的硫酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能够包绕样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包绕下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为光源，经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光，这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收，光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号，这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模／数转换器将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，计算机系统将这些数字信号收集、储存，以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来，可以用不同的标记物进行双参数、三参数甚至多参数的分析［3，4］。

2流式细胞仪的技术指标

包括：（1）分析速度：很高可以达到5000个／s左右，大型的流式细胞仪的分析速度可达10000个／s；（2）荧光检测灵敏度：单个细胞上的荧光分子＜600个，或两个细胞之间的荧光差＞5％就能区分；（3）前向角散射光检测灵敏度：一般的可以检测到的最小颗粒直径在0．2～0．5μm；（4）分辨率（CV）：一般流式细胞仪能够达到＜2．0％；（5）分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞100个／s，分选细胞纯度可达99％［5］。

3流式细胞术在临床中的应用

3．1在血液学中的应用

流式细胞术通过对外周血细胞和骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析对各种血液病如白血病、淋巴瘤等血液系统疾病的分型、诊断、治疗及预后判断均有重要作用。血细胞在白细胞系、红细胞系、巨核细胞系、血小板及非造血细胞均有不同的分化抗原表达，分布在细胞质、细胞膜中。血液肿瘤细胞的特征是丧失了正常细胞的系类专一性和分化阶段的规律性，运用流式细胞术将具有系列特异性并涵盖不同分化阶段的单克隆体作为分子探针来检测血液肿瘤细胞的内外抗原，可以反映其本质上与正常造血细胞的差异［6］。流式细胞术采用各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，借助于各种荧光染料（异硫氰基荧光素FITC，藻红蛋白PE等）测定一个细胞的多种参数，以正确判断出该细胞的属性。流式细胞术还可以应用在白血病免疫分型方面，目前国内外均主张采用FCMCD45／SSC双参数散点图设计方法进行白血病免疫分析。采用此法可将骨髓细胞清晰地分成淋巴细胞、单核细胞、成熟粒细胞、幼稚细胞和有核红细胞群，这样可以排除正常细胞对免疫分型的干扰，从而提高免疫分析的准确性，而且测量细胞一般在1～5万个细胞，快速特异、准确性好，并且能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程细胞基因及抗原标志发生变化的信息。而这种细胞的变化是常规FAB法所不能分辨的。这种分型对于治疗方案的正确选择与预后有着重要的意义同时也提供了可靠的依据［7］。近年研究发现，在临床血液病检测和诊断中诊断准确率高达90％以上，与普通检测法相比准确率提高达20％［8］。流式细胞术可以通过某些荧光染料与红细胞中的RNA结合，定量地测定网织红细胞中的RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比，从而准确地反映骨髓造血功能。有作者报道FCM方法比目测法结果精确度更高［9］。此外FCM还可以测出网织红细胞的成熟度，对红细胞增值能力的判断很有意义，为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤患者放化疗对骨髓的抑制状况等提供依据。

3．2在肿瘤学中的应用

流式细胞术在肿瘤学中的应用主要是对肿瘤细胞DNA含量进行测定，包括癌前病变及早期癌变的检出，辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。不仅如此，还可以根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化评估疗效，了解细胞动力学的变化。临床医生可根据各细胞周期各时相的分布情况，结合化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳治疗方案，再依照DNA直方图直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化，及时调整治疗方案，选取有效药物以使对肿瘤细胞达到最大的杀伤效果［10］。

3．3在免疫学中的应用

利用抗原抗体特异性反应的原理将流式细胞仪与单克隆抗体结合，对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，广泛应用于临床，对人体细胞免疫功能的评估具有重要的意义。流式细胞术可进行T、B和NK淋巴细胞水平的分析，还可以进行淋巴细胞亚群的分析，区分不同的淋巴细胞亚群，计算其相互间的比例，进而了解淋巴细胞的分化功能。更重要的是，通过研究大多数疾病的特异性淋巴细胞亚群，对一些疾病如免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能的重建具有重要的指导意义。例如CD4是辅淋巴细胞，它是迟发性超敏反应的启动者，是促使B淋巴细胞产生抗体的辅细胞，也是抑制性T细胞的诱导细胞，而CD8是抑制性T细胞，是细胞毒性T细胞介导反应的效应细胞，是抑制B细胞产生抗体的抑制性细胞［11］。在许多免疫性疾病中，淋巴细胞亚群的增多与减少对疾病的发展具有重要的作用。如在先天性发育不良综合征中FCM分析显示外周血CD3TCD4＋和CD8＋T细胞均减少，在残余T细胞中T细胞受体（TCR）αβ分子表达减少，γδ分子表达正常，CD4＋／CD8＋T细胞比例升高，随着受累者年龄的增加CD8＋细胞数增多，而有些患者T细胞数量增加，最终可达正常［12］。流式细胞术还可以进行HLA群体分析，在强直性脊柱炎患者中用流式细胞术检测HLA－B27抗原阳性率高达92．6％，而且可以排除交叉反应，提高检测的灵敏度和准确性［13］。

3．4在中医药研究方面的应用

流式细胞术可用于单味中药有效成分的作用效果测定分析。如研究复方苦参方剂对大肠癌LoVo细胞体外增值凋亡的影响中，分析DNA含量及细胞周期，结果显示Lo－Vo细胞可检测亚G1峰，凋亡率于对照组相对比例增高，细胞周期分析发现S期阻滞现象，表明复方苦参方剂具有一定的抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用［14］。在慢性阻塞性肺疾病的肺气虚证、肺阴虚证患者中CD4＋、CD4＋／CD8＋均降低，CD8＋升高，说明肺气虚证与肺阴虚证患者均存在细胞免疫功能低下［15］。

3．5在细菌学中的应用

流式细胞术具有快速、灵敏、精确并能进行多参数分析的特点，可广泛应用于细菌的诊断和药敏实验，是研究细菌异质性、细菌抗生素后效应、多种病原菌混合感染等的有效方法。常用的为流式细胞术药敏试验：检测不同细菌时，根据药物对细菌的作用机理选择合适的荧光染料，通过细菌总体平均荧光强度束反映抗生素对细菌的抗菌活性，3h左右即可得出检测结果，尤其适用于急需药敏报告的重症感染病菌的检测。

3．6在血小板疾病诊断中的作用

血小板是止血机制中一个重要因素，其表面含有多种糖蛋白及各种受体，这些受体与相应的配体相结合后，血小板被激活，并发生形态变化，血小板聚集和颗粒释放等一系列反应。利用流式细胞术检测血小板标志物在许多血小板相关疾病的诊断上具有重要的临床价值［16］。如GPⅠb／Ⅸ复合物先天缺陷导致巨大血小板综合征；GPⅡb／Ⅲa复合物先天缺陷导致血小板无力症［17］。在免疫性血小板减少性紫癜的患者中，FCM可以测定患者血液中的PAIgG、PAIgM、PAIgA，荧光阳性百分率的诊断效率为45．8％，平均荧光强度的诊断效率为72．5％，两项指标联合的诊断效率为74．2％［18］；因此FCM检测血小板抗体可用于免疫性血小板减少性紫癜的诊断及治疗监测。用FCM内参定位法定量分析血小板微粒在血栓性疾病和血栓前状态的发生发展中的作用，有利于血栓性疾病的诊断和治疗。

3．7在相关疾病检测中的应用

质量检测是诊断男性不育症的重要手段，由于检测数低及主观因素的影响，常规的检查只能反映的形态特征和有限的功能，不能为生育能力提供准确评估的依据，用FCM检查可把定性的描述变成定量的研究，提高了实验结果的准确性，可对进行高通量、多参数分析，得到不同时期的细胞数据及形态指标，对临床诊断发生障碍的性质、原因和程度提高了客观依据，可对少、弱和无症的判断、治疗及疗效的观察作出正确的评价，为客观评价男性生育能力提供了有力的依据。用FCM检测生精细胞凋亡情况是迅速、准确、客观、可靠地评估功能和男性生育力的新方法［19］。

3．8在器官移植中的作用

可用流式细胞术判断供者与受者之间的配型是否合适。检测受者血清中抗供者的抗HLA抗体，如果受者血清中存在针对供者的循环抗体，就会同供者的淋巴细胞结合，在加入荧光素的二抗来显示这种结合，就可在移植前后发现高风险抗体，以判断供者与受者之间是否合适。移植后的免疫表型监测也很重要，移植后的CD4／CD8比值低下的患者排斥反应发生较多，受者血清中产生抗供体细胞抗体预后较差，应及时监测以便进行抗排斥的预防和治疗［4］。综上所述，流式细胞术是一种在医学基础、临床及科学研究中具有广泛应用前景的细胞分析技术。它具有分辨率高、分辨细胞数量大、参数多、准确性高、速度快等优点。随着流式细胞分析技术与方法的迅速发展，流式细胞术在临床的应用范围也不断拓展，并将成为推动临床医学发展的重要手段。

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