本文作者：张利王硕刘宝祥姚继兵董亮赵长新作者单位：大连工业大学生物工程学院

酿酒酵母是与人类关系最广泛的酵母，传统上用于制作面包和馒头等食品，工业上，主要应用于发酵谷类酿造酒类[1]。酿酒酵母的老化问题直接影响发酵的效率和产物，但目前没有明确的方法来鉴定酵母的老化程度，因此，研究酿酒酵母酶老化过程中活力的变化趋势，对于现代化工业生产有着极其深远的意义。酵母细胞内含有多种酶，如：蛋白酶、蔗糖酶、核酸酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、乳糖酶、脂肪酶等[2-4]。本实验通过蛋白酶、蔗糖酶、脂肪酶和核酸酶进行测定分析，最终确定酵母老化过程收稿日期：2011-11-28*通讯作者作者简介：张利(1986—)，男，辽宁宽甸人，硕士研究生，研究方向为发酵工程。中酶活力的变化趋势，为酵母老化的鉴定奠定理论基础。

1材料与方法

1.1试剂和设备

氢氧化钠、福林试剂、酪蛋白、三氯乙酸、碳酸钠、3,5-二硝基水杨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、醋酸钠、邻硝基苯酚(ONP)。B-22M高速冷冻离心机：ThermoIEC；超声波细胞破碎仪：宁波新芝科器研究所；恒温水浴锅：上海比朗仪器有限公司；紫外分光光度计：上海洪福仪器仪表有限公司；PHS-3C型精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；微量天平：上海方瑞仪器厂；恒温培养振荡器：上海智城分析有限公司。

1.2菌种

酿酒酵母FCC2144：大连工业大学菌种保藏所提供。

1.3实验方法

1.3.1培养条件及代数的定义

本实验将从菌种保藏中心斜面上接下的菌种定义为第1代菌种。采用L-B培养基进行液体培养，24h转接1次，并且定义为1代。将种子液接于发酵培养基中于29.5℃、180r/min摇床培养60h。

1.3.2粗酶液的制备

将发酵液于4℃、10000r/min离心15min，收集菌体，并用去离子水洗涤菌体沉淀3次，将菌体放入冷冻干燥机中进行干燥处理。然后称取干燥后的菌体按5%(w/v)的比例溶于pH8.8的磷酸缓冲液中，菌悬液在冰浴中进行超声波破碎，超声波条件为：工作3s，间歇5s，功率550W，温度4℃，全程时间10min。将细胞破碎液于4℃、10000r/min离心15min，收集上清液，上清液即为粗酶液。

1.3.3乳糖酶活力测定方法

乳糖酶又称β-D乳糖苷酶，能催化邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)水解生成邻硝基苯酚(ONP)，ONP在中性和碱性范围呈黄色，在420nm处有最大吸收峰。取3个15×100的试管，分别加入pH7.0的磷酸缓冲液2.8mL，37.5℃恒温水浴5min，加入100μL浓度为4mg/mL的ONPG溶液和100μL粗酶液，37.5℃恒温反应5min，于420nm处比色取平均值[5]。乳糖酶活力定义：在37.5℃下，1mL乳糖酶每分钟催化ONPG水解生成1μmol邻硝基酚(ONP)定义为1个酶活力单位。

1.3.4蛋白酶活力测定方法

采用国标法测定蛋白酶活力。取3个15×100的试管，加入粗酶液1mL，置于40℃水浴中预热5min，然后在各试管中加入经同样预热的酪蛋白1mL，精确反应10min，时间到后马上再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以终止反应。继续放置在水浴锅中保温20min，时间到后立即4000r/min离心10min取上清液。然后另取3个试管，分别加入上清液1mL，再加入0.4mol碳酸钠5mL、已稀释的福林试剂1mL，摇匀后置于40℃水浴锅中保温20min后在660nm出测定吸光值[6-7]。参比实验操作方法同上，唯在加入酪蛋白前先加入0.4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。样品的平均光密度-参比的平均光密度=净OD值蛋白酶活力定义：在40℃下，每分钟蛋白酶水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为1个活力单位。

1.3.5α-淀粉酶活力测定

通过3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量来反映α-淀粉酶的活力。取1mL酶液于15×100的试管中，70℃放置15min，迅速冷却后40℃预热15min后，加入含量为1%的可溶性淀粉(40℃预热)2mL，摇匀，40℃反应5min，加入0.4mol/L氢氧化钠4mL，摇匀，取1mL反应液加1mLDNS，沸水浴显色5min，迅速冷却，蒸馏水定容至10mL，520nm下测定OD值[8-9]。参比：1mL酶液，70℃放置15min迅速冷却后，40℃预热15min，加入0.4mol/L氢氧化钠溶液，摇匀，加入1%可溶性淀粉2mL(40℃预热)，其余同上。空白：1mL蒸馏水+1mLDNS，其余同上。酶活力定义：在上述条件下，每分钟由底物催化生产1μg还原糖的酶量定义为1个酶活力单位。

1.3.6核酸酶活力测定方法

核酸降解后，降解产物的吸光值会增加，即所谓的增色效应，通过OD260值的改变来鉴定核酸酶的活力大小。参照Yasuda等[10]方法，在4mL反应体系中加入1mL酵母胞内核酸酶提取液，与3mL底物迅速混匀，在3min内迅速测定混合液OD260值的变化。底物液的配制：2mg放线菌DNA，60mL去离子水，0.1mol/L的醋酸钠缓冲液10mL，混匀。酶活力定义：25℃下，每分钟降解放线菌DNA的产物使260nm处吸光值变化0.01所需要的酶量定义为1个活力单位。

2结果与讨论

2.1酵母生长曲线

本实验对酵母进行老化培养，分别对第1代、第5代、第10代、第15代酵母的发酵液进行每3h取1次样品，在600nm出测定光密度(OD值)，结果见图1。由图1可知，酿酒酵母在8h进入对数生长期，24h进入稳定期，不同代数之间有轻微的差异性，即随着代数的升高，酵母进入对数生长期和稳定生长期的时间提前了，但酵母在稳定生长期的菌浓度随着代数的增加而减小。

2.2酿酒酵母老化过程中乳糖酶活力的变化

本实验对酶液进行3次平行测定，取平均值所得结果见表1。以邻硝基苯酚的浓度为横坐标、OD值(420nm)为纵坐标，得邻硝基苯酚标准曲线如图2所示。根据酶活力定义及邻硝基苯酚标准曲线计算结果如图3所示。由图3可知，酵母乳糖酶活力在酵母老化过程中降低，从第1代的4.286降低到15代的1.261，大约降低70%。酵母乳糖酶活力的减弱说明酵母细胞在老化过程中对乳糖的利用能力在逐渐下降。

2.3酿酒酵母老化过程中蛋白酶活力的变化

本实验对酶液进行3次平行测定，所得结果见表2。根据酶活力定义及酪氨酸标准曲线计算结果如图5所示。由图5可知，酵母蛋白酶活力在酵母老化过程中逐渐增加，从第1代的50.25升高到15代的82.16，大约升高65%。蛋白酶活力的明显增加，加速催化水解酵母细胞膜和细胞壁上的蛋白质，使细胞失去稳定的结构和活性，这与细胞衰老的理论相吻合。

2.4酿酒酵母老化过程中α-淀粉酶活力的变化

本实验对酶液进行3次平行测定，取平均值所得结果见表3。根据α-淀粉酶活力定义及葡萄糖标准曲线计算结果见图7所示。由图7可知，在酿酒酵母老化过程中，α-淀粉酶的活力在逐渐下降，从第1代的3.362下降到第15代的1.100，α-淀粉酶活力的降低，说明酵母细胞老化过程中，对于淀粉的分解和利用率在逐渐下降。

2.5酿酒酵母老化过程中核酸酶活力的变化

通过3min内A260值的变化来鉴定核酸酶的作用，所得结果如表4。根据核酸酶活力定义及酶活力计算公式得：酶活力=△OD260(3min)/(3×0.001)由图8可知：在酵母老化过程中，酵母核酸酶的活力在逐渐下降，从第1代的31.4降低到第15代的7.8，大约降低75%。

3结论

经过多次实验证明：在酵母老化过程中，蛋白酶的活力逐渐升高，乳糖酶、α-淀粉酶、核酸酶的活力逐渐降低。目前国内尚未见有报道关于酵母老化与酶活力变化关系的研究，本实验通过酵母代数为载体针对酵母老化过程中酶活力的变化做了细致的研究，为酵母老化程度的鉴定提供有力依据。