本文作者：戴程程汪秋宽任丹丹何云海作者单位：大连海洋大学辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室

南极磷虾是一种生活在南极洲水域的磷虾。它作为当今世界资源量最大的单物种生物之一，为南极多数生物提供食物，是南极食物链体系中最重要的生产者[1]。南极磷虾营养极其丰富，被誉为地球上最大的“海洋蛋白库”，具有很高的开发利用价值[2]。研究发现南极磷虾蛋白质含量适中，脂肪含量丰富，氨基酸种类齐全，必需氨基酸比例适宜，微量元素含量极高，并且绿色、安全，是人类理想的高级营养食物[3-5]。因磷虾体内富含可迅速自溶的蛋白酶，故本研究利用快速自溶技术，探索影响磷虾快速自溶因素，为研制富含游离氨基酸、蛋白肽的独特风味磷虾调味料奠定基础。

1材料与方法

1.1原料

南极磷虾由大连辽渔集团提供，采自南极海域。

1.2主要仪器与设备

组织捣碎机，磁力搅拌器，水浴锅，高速离心分离机，pH计，微量凯氏定氮装置。

1.3检测方法

1.3.1基本成分测定

水分：常压干燥法[6]；灰分：550℃干法灰化法[6]；粗蛋白：微量凯氏定氮法[6]；粗脂肪：索氏提取法[6]。

1.3.2水解液氨基酸态氮的质量浓度及水解度测定

氨基酸态氮的质量浓度：甲醛滴定法；水解液水解度：非蛋白氮，20%三氯乙酸处理自溶液，取上清液，用微量凯氏定氮法测定其含氮的质量分数，计算自溶液水解度，如下公式：（略）。以氨基酸态氮的质量浓度及自溶液的水解度为水解程度大小的指标。

2结果与讨论

2.1磷虾的基本营养成分

由表1可见，其粗蛋白质量分数比新对虾(13.2%)高[7]；其非蛋白氮的质量分数为579mg/100g，而非蛋白氮成分中，一般多含有游离氨基酸、低肽、核苷酸关联化合物质[8]，这对制作高级磷虾营养海鲜调味料提供了优越的条件。

2.2磷虾自溶水解的单因素确定

2.2.1自溶时间对磷虾自溶酶解的影响

在50℃恒温条件下将磷虾肉自溶酶解一定时间后，加热至沸灭活，测其氨基酸态氮的质量浓度，自溶时间分别为20、40、60、80、100、150、200、250、300min，自溶时间对磷虾自溶酶解的影响见图1。由图1所示，氨基酸态氮的质量浓度在150min以内一直为上升趋势，当自溶时间超过165min时，自溶酶解液中氨基酸态氮的质量浓度出现逐渐下降趋势。因此，165min确定为自溶酶解的最佳时间，其自溶酶解液中氨基酸态氮的质量浓度为4.74g/L。165min以后，氨基酸态氮的质量浓度又缓慢降低，几乎接近稳定。以上结论如图1所示。自溶时间对自溶酶解水解度的影响见图2。由图2可见自溶时间对自溶酶解液水解度的影响很小，水解度一直在20%~30%之间浮动，在自溶时间为165min时自溶液水解程度达到最高，为29.6%。在165min后，水解液水解度出现下降，然后随时间变化很小。因此，确定165min为最佳溶酶解时间。由图1和图2可见，自溶酶解时间为165min时，自溶酶解液中的氨基酸态氮的质量浓度最高，并且溶液的水解程度也最大，由此可见，165min为自溶酶解的最佳时间。孔美兰等[9]曾对罗非鱼下脚料自溶酶解条件进行研究，结果同样发现自溶酶解时间对自溶酶解液中氨基酸态氮的质量浓度影响较大。研究结果表明自溶酶解时间对水解度的影响较小，比较杨锡洪等[10]等对虾头自溶脱蛋白质法制备壳聚糖的研究结果，后者发现虾头中含有大量的蛋白水解酶，其中包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶A、羧肽酶B[11]等，种类丰富且比虾肉中的酶含量要高。

2.2.2自溶酶解温度对磷虾自溶的影响

将自溶酶解时间确定为165min，研究了温度对磷虾自溶酶解效果的影响，结果见图3和图4。由图3可见，不同自溶温度的自溶酶解液中游离氨基酸态氮的质量浓度不同，在55℃时，自溶酶解液中氨基酸态氮的质量浓度达到最大，约为4.26g/L。温度大于55℃后，氨基酸态氮的质量浓度随温度增加而降低，可见55℃为磷虾自溶酶的最适温度。由图4可见，在温度为55℃时，自溶酶解液水解度最大，达到32.91%。由此可以确定最适自溶酶解温度为55℃。不同自溶酶解温度对自溶酶解液游离氨基酸态氮的质量浓度影响明显，在低温阶段，随着温度的增加，氨基酸态氮的质量浓度逐渐增加，在温度为55℃时上升为4.26g/L，随后就呈下降趋势，可见55℃为磷虾自溶酶的最适温度。说明在低温阶段，随着温度的升高自溶酶的反应速度加快，因加热能使蛋白质变性，原本卷曲的蛋白质肽链因变性而伸展，其结构内部的肽键充分暴露，从而活性位点增多，这就更易于蛋白酶的作用。但温度过高时，部分自溶酶的结构开始松散无序，活性中心也随之逐渐丧失，酶活性降低，导致自溶水解效果减弱。这与司伟兰[12]等对鱿鱼内脏的自溶分析结果和王静[13]等人对海参多肽自溶工艺的研究趋势一致，在低温阶段，随着温度的增加，游离氨基酸态氮的质量浓度逐渐增加，并在55℃附近含量最高，之后随着温度的增加，氨基酸态氮的质量浓度下降。

2.2.3pH对磷虾自溶酶解的影响

将自溶温度定为55℃、自溶时间定为165min，设定自溶酶解液的pH值，研究pH值对磷虾自溶酶解的影响。其影响结果见图5和图6。由图5中可知，pH对磷虾自溶酶解的影响较大。当pH为7.0时，自溶液中的氨基酸态氮的质量浓度最高。说明中性条件利于磷虾自溶酶解，其氨基酸态氮的质量浓度为4.55g/L。由图6可见，pH对自溶液水解度的影响较大，当pH=7.0时，自溶酶解液水解度高达23.84%，说明pH为7.0时自溶酶解效果最佳。pH对磷虾自溶酶解的影响关系密切。说明在特定pH条件下磷虾肌肉中自溶酶被激活并与相应的机体组织生物大分子底物作用，使机体组织被溶解，生成各种较低分子质量的产物——肽和氨基酸[9]。而水解体系中pH值对自溶酶和底物的结构、解离状态及结合状态都会产生影响。这种结果与郑丽等[14]研究的pH值对扇贝加工废弃物自溶影响的结果类似。

2.2.4紫外线照射时间对磷虾自溶酶解的影响

用紫外线(光源功率30W，距样液高度设计为0.40m)分别照射磷虾自溶酶解液10、20、30、40、50min后，分别测定自溶酶解液中的游离氨基酸态氮的质量浓度，结果见图7和图8。图7表明，紫外线的照射时间对磷虾自溶酶解液中的氨基酸态氮的质量浓度的影响较小，随着紫外线照射时间的延长，自溶液中的氨基酸态氮的质量浓度逐渐增大。由图8可见，紫外线的照射时间对自溶酶解液的水解程度影响较大，它使整体自溶水解速度成大幅上升趋势，在照射50min内，随着照射时间的延长，自溶酶解液的水解度逐渐增加。本实验选择紫外线的照射时间为50min以内。紫外线的照射时间对磷虾自溶水解液中的氨基酸态氮的质量浓度的影响不大，随着紫外线照射时间的延长，自溶酶解水解中氨基酸态氮的质量浓度缓慢上升。考虑到紫外线照射时间过长，可能超过激活酶所需的计量，会导致酶结构的改变，使磷虾的蛋白质变性，并产生一些不良气味。因此，紫外线照射时间确定为50min。这一结果与亨氏仿对虾的情况类似[15]，紫外线照射时间限制为50min为最佳紫外线照射时间。但章超华等对斑节对虾快速自溶的影响结果却不同[15]，后者发现斑节对虾在紫外线照射超过30min时，自溶受到了抑制。这表明，紫外线对不同海洋生物的自溶效果影响是不同的。

2.2.5无机离子浓度对磷虾自溶效果的影响

Na+和Ca2+对自溶酶解效果的影响由图9和图10所示。由图9和图10可见，Na+和Ca2+对快速自溶水解的影响相类似，Ca2+作用后的自溶酶解液中氨基酸态氮的质量浓度高于Na+作用后自溶酶解中氨基酸态氮的质量浓度，并在Ca2+达到0.28mol/L时，水解液中的氨基酸态氮的质量浓度最大，为3.38g/L。图10是Na+和Ca2+对溶液水解度的影响，2种离子对自溶酶解液影响趋势类似，表明了Ca2+对自溶液水解度的影响较Na+的影响显著。在Ca2+为0.28mol/L时，水解液的水解度最大，为13.87%。综上所述结果表明，自溶时间与磷虾自溶水解反应密切相关，在自溶165min时，自溶酶解液达到最佳；磷虾的自溶酶解受温度影响较小，55℃为南极磷虾快速自溶酶最佳作用温度；pH对磷虾自溶酶解影响显著，pH为7.0时，可显著加速磷虾的自溶水解；在紫外线照射时间为50min时，对自溶反应起到促进作用；Ca2+对南极磷虾自溶酶具有激活作用，加速自溶酶解，当其浓度为0.28mol/L时达到较佳的自溶酶解效果。Ca2+对自溶酶的激活促进作用较Na+强，可能是因为Ca2+可以控制细胞的渗透性，调节细胞的酸碱平衡，同时对淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种水解酶的活性起着十分重要的稳定、活化作用。当Ca2+达到0.28mol/L时，水解液中的氨基酸态氮的质量浓度可达到最大值3.38g/L。这些钙会以溶解态的形式存于液体中，对人体吸收有利。因此，磷虾自溶液中的钙可以被人体吸收。

2.3磷虾自溶条件的正交优化

在单因素实验的基础上，以时间、温度、pH、紫外线照射时间、无机离子浓度5因素为影响因子设计了正交试验L16(54)，综合优化磷虾的自溶酶解工艺，自溶优化条件。其结果如表2、表3与表4所示。由表2可见，正交实验的最佳自溶酶解工艺A4B2C3D1E4，即反应时间180min，温度50℃，pH为7.0，紫外线照射时间20min，Ca2+浓度为0.28mol/L，此时自溶酶解液中的氨基酸态氮含量为0.788g/L，水解度为35.07%。由表3可见，以水解度为指标的极差分析结果表明，自溶酶解时间是影响水解度得率第一影响因素，pH值是次要因素，反应温度和无机离子浓度对水解影响较小，紫外线的照射时间对自溶酶解液的影响最小。以水解度为指标的极差分析结果的最佳正交组合为A4B2C3D1E4。即最佳工艺条件为反应时间180min，温度50℃，pH为7.0，紫外线照射时间20min，Ca2+浓度为0.28mol/L。由表4可见，以氨基酸态氮的质量浓度为指标的极差分析结果表明，自溶酶解时间也是影响氨基酸态氮的质量浓度的第一影响因素，pH值同样为次要因素，Ca2+浓度为第三影响因素，反应温度与紫外线的照射时间对自溶酶解液的影响最小。最佳正交组合同样为A4B2C3D1E4，与以水解度为指标的极差分析结果一致。为此研究对最佳组合进行了自溶酶解实验，研究结果表明在该最佳实验组合条件下自溶酶解液中氨基酸态氮的质量浓度为0.875g/L，水解度为36.18%。

本文对南极磷虾自溶酶解工艺研究结果表明，在单因素试验中，自溶酶解时间为165min时，溶液中氨基酸态氮的质量浓度达到最高，即4.74g/L，此时自溶酶解液中的水解度为29.60%；当最适温度为55℃时，氨基酸态氮的质量浓度最高，为4.26g/L，水解度为32.91%；当pH为7.0时，自溶酶解液中的氨基酸态氮的质量浓度达到最高值4.55g/L，水解度为23.83%；Na+和Ca2+对快速自溶水解的影响相类似，但Ca2+对自溶酶解液的激活促进作用较Na+作用大。单因素试验后，正交实验L16(54)确定了南极磷虾的最佳自溶酶解条件。正交实验结果表明，当自溶时间为180min，温度为50℃，pH为7.0，紫外线照射时间为20min，Ca2+离子浓度为0.28mol/L时，水解液中氨基酸态氮的质量浓度最大，为0.875g/L，其自溶酶解液的水解度为36.18%。