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探究病毒的原核表达

发布时间:2013/11/11 10:47:53   阅读:

1材料与方法

实验材料基因工程菌pRSET-N-BL21、PRRSV由动物医学院传染病组馈赠;兔抗PRRSV高免血清由本实验室通过灭活的全病毒免疫后制备保存;伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(HCV)、猪细小病毒(PPV)由本实验室保存;DMEM、HAT及HT为美国GIBCO公司产品;PEG-1500及MouseMonoclonalAntibodyIsotypingKit为Roche公司产品;新生牛血清购自杭州四季青公司;SP2/0骨髓瘤细胞由江苏农科院畜牧兽医研究所馈赠;Balb/c小鼠、清洁级小鼠购自重庆医科大学。PRRSV核衣壳蛋白的诱导表达、纯化和鉴定将基因工程菌pRSET-N-BL21自然融化后接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)的2×YT琼脂平板上,37℃恒温孵育18h。于2×YT琼脂平板上挑取单菌落,接种到5ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的2×YT液体培养基中,37℃振荡过夜。然后按1∶100的接种量进行二次活化,200r/min,37℃摇床振荡培养,菌体密度生长至对数期后。将各培养管按IPTG浓度梯度(1mmol/L、0.5mmol/L)和温度梯度(37℃、30℃、20℃)诱导4h,所有管每隔1h取样一次(每次0.5ml),将样品进行SDS-PAGE电泳分析确定最佳诱导条件。按优化的最佳条件重新诱导表达,并于最佳时间取样40ml经超声破碎后,分别取破碎后上清与沉淀,利用SDS-PAGE检测表达蛋白的相对分子质量,表达形式,并利用Westernblot鉴定目的蛋白。随后对该工程菌按最佳条件进行扩大培养,采用His-Ni2+亲和层析纯化重组N蛋白,纯化产物用SDS-PAGE电泳鉴定。分泌抗高致病性PRRSVN蛋白单抗杂交瘤细胞株的建立将纯化的PRRSVN蛋白,常规法免疫、细胞融合制备单克隆抗体杂交瘤细胞株。阳性杂交瘤细胞的稳定性试验杂交瘤细胞继代培养6个月以上,定时用ELISA间接法测定培养上清抗体效价.分别复苏冻存1个月,2个月,4个月,8个月和12个月的阳性杂交瘤细胞,用ELISA间接法测定细胞培养上清及细胞诱生小鼠腹水的抗体效价。单抗的亚型鉴定按试剂盒说明书操作。杂交瘤细胞染色体分析取对数生长期的杂交瘤细胞,经秋水仙碱、0.075mol/LKCl溶液处理,固定制片后染色,油镜下观察染色体并记数。单抗特异性鉴定将表达的PRRSVN蛋白以4μg/ml包被,以4G10单抗腹水及其它病毒,如伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(HCV)、猪细小病毒(PPV)的特异性多抗为一抗,用间接ELISA法检测单抗特异性。

2结果

按该条件重新诱导N蛋白的表达并通过超声破菌,经结晶紫染色发现破菌比较彻底。将细菌裂解液离心后分别收集上清和沉淀重悬液,行SDS-PAGE分析,结果发现,上清液中N蛋白的含量明显高于沉淀中含量,说明在该条件下N蛋白主要以可溶性形式存在,包涵体中含量较少。将诱导表达产物用兔抗PRRSV高免血清进行Westernblot分析,结果显示阳性,表明重组N蛋白成功表达。重组N蛋白经过IPTG诱导表达后,通过His-Ni2+亲和层析纯化带有6His的融合蛋白,经SDS-PAGE分析表明,获得的重组蛋白纯度较高,但含有部分杂蛋白,也可能有少量的二聚体的形成抗高致病性PRRSVN蛋白单抗杂交瘤细胞株的建立本实验一次融合共分装384孔,融合成功312孔,融合率达81.3%,ELISA初检阳性率达17.3%;选择阳性值较高的20个孔亚克隆,经过2次亚克隆,不断反复筛选得到了2株较稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,命名为4G10及2F9。融合后的杂交瘤细胞如图3,细胞融合的筛选结果如表1所示。单抗的生物特性鉴定阳性杂交瘤细胞稳定性试验4G10和2F9细胞株继代培养6个月以上,其培养上清ELISA效价仍保持在1∶1024~1∶2048,分别冻存1、2、4、6个月后复苏,其诱生腹水的Mabs效价仍保持在1∶25600~1∶51200之间杂交瘤细胞染色体分析对4G10和2F9细胞株杂交瘤细胞分裂相染色体形态进行观察,可见到端着丝点和中间着丝点,染色体数目介于100~110条之间,具有杂交瘤细胞染色体特征。单抗特异性鉴定将PRV、HCV、PPV特异性抗体和4G10小鼠腹水进行梯度稀释,分别与重组N蛋白包被的酶标板进行反应,重复3次,结果表明:重组N蛋白与4G10单抗反应较强烈,而与其它病毒抗体不反应,说明所得到的单抗具有较好的特异性。

作者:吴胜昔邵烈刚单位:重庆理工大学

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