摘要：目的：研究唑来膦酸（Zoledronateacid）和异戊烯焦磷酸（IPP）体外扩增前列腺癌患者外周血中γδT细胞的效率。方法：密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞（PBMCs），分别加入5．0μmol／LZol或10．0μg／mlIPP联合1000IU／ml的rhIL－2于含10％自体血浆的AIM－V培养体系培养，观察并收集细胞，采用流式细胞仪检测刺激后CD3＋Vγ9＋的γδT细胞数量和比例，并计算其扩增效率。结果：经14天扩增培养后，两种磷酸抗原均能在体外扩增前列腺癌患者外周血中的γδT细胞，Zol组的γδT细胞在淋巴细胞中最高含量达64．7％，IPP组最高达55．9％，且扩增培养至第9天的γδT细胞对肿瘤细胞有一定的杀伤活性，但Zol组的扩增效率以及细胞的杀伤活性均明显强于IPP组（P＜0．05）。结论：Zol具有与IPP体外扩增外周血中γδT细胞的能力，Zol刺激法可能成为体外扩增前列腺癌患者外周血中γδT细胞更为经济安全的选择。

关键词：前列腺癌；γδT细胞；唑来膦酸；异戊烯焦磷酸

γδT细胞是其T细胞受体（Tcellreceptor，TCR）由γ链和δ链构成的一类具有独特生物学特征的T淋巴细胞亚群［1，2］，它能迅速识别外源性病原体和内源性应激诱导的配体并启动适应性免疫应答，故γδT细胞被视为人体免疫防御和免疫监视的第一道重要防线［3］。γδT细胞兼具T辅助细胞（Th）和细胞毒T细胞的双重细胞效应，当其发挥作用后，可通过自身抗原递呈细胞（APC）样效应或通过所分泌的细胞因子效应进一步诱导或促进特异性T细胞应答［4－6］。因而γδT细胞被认为可能是介于获得性免疫与天然免疫之间的特殊免疫细胞类型，具有抗原特异性识别功能而无MHC限制，并在机体抗感染和自身免疫疾病及抗肿瘤等过程中起重要作用［3，7］。但γδT细胞在人外周血中的含量仅0．5％～10％左右，因此如何有效扩增肿瘤患者外周血中γδT细胞是其应用于临床治疗的先决条件。磷酸抗原体外特异性扩增健康人外周血中的γδT细胞能力已经得到反复证实，其中报道比较多的是异戊烯焦磷酸（IPP）对γδT细胞的扩增方法［8，9］，IPP体外刺激扩增效率的确有效，但其价格较昂贵，且对细胞毒性较大，不利于临床推广应用，近期有文献报道将骨质疏松的治疗药物唑来磷酸（Zoledronateacid，Zol）用于体外扩增γδT细胞也取得了良好的效果［10，11］。为了建立一种经济有效、安全简便体外扩增γδT细胞的方法，本实验对比研究两种磷酸抗原Zol和IPP在体外对前列腺癌患者外周血中的γδT细胞特异性的扩增能力和方法。

1材料与方法

1．1标本来源本试验所采用前列腺癌患者外周血来自深圳市人民医院。

1．2主要仪器与试剂AIM－VCTSTM培养基购自Gibco公司（GrandIsland，NY，USA），重组人白细胞介素2（rhIL－2）购自双鹭药业；淋巴细胞分离液购自NycomedPharma公司（NycomedPharmaAS，Oslo，Norway），唑来磷酸注射液购自诺华公司，IPP购自Sigma公司，FITC标记的抗Vγ9（Vγ9－FITC）、PE标记的CD4（CD4－PE）、PerCP标记的CD3（CD3－PerCP）、APC－H7标记的CD8（CD8－APC－H7）单克隆抗体均购自BD／Pharmingen公司，流式细胞分析仪为FACSCantoⅡ（美国BD），分析软件为BDCellQuest。

1．3方法

1．3．1细胞培养抽取前列腺癌患者的静脉外周血至含有肝素钠的离心管中，离心获得血清和全血细胞，将全血细胞经密度梯度离心获得单个核细胞（PBMC）。收集的PBMC重悬于含10％自体灭活血浆的AIM－VCTSTM培养基，调整细胞密度（1～2）×106／ml左右，加入不同浓度的Zol和IPP，每组3个重复，并加入rhIL－2至终浓度1000IU／ml，最后转移入培养瓶内于37℃，5％CO2和饱和湿度的培养箱进行培养。1．3．2γδT细胞表型分析取加不同浓度的磷酸抗原因子诱导的γδT细胞，1000r／min离心5min后用1×PBS洗1次，在1500r／min下离心5min，调整细胞数大约（5～10）×105每管每100μl，加Vγ9－FITC，CD4－PE，CD3－PerCP，CD8－APC－H7各2μl，吹匀，避光孵育20min，PBS洗1次，最后以PBS400μl重悬，上机检测。检测磷酸抗原诱导前后γδT细胞的比例，流式细胞仪检测结果使用BDCellQuest软件进行分析。

1．3．3γδT细胞杀伤活性检测以CellCountingKit－8测定γδT细胞杀伤活性，以前列腺癌DU145细胞作为靶细胞，按效靶细胞比5∶1、10∶1、20∶1的比例加入培养至第9天的γδT细胞，37℃、5％CO2的培养箱中过夜，加入20μl／孔的CCK－8在37℃、5％CO2的培养箱内孵育3h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度（A）值。杀伤率（％）＝1－［（实验组OD值－单独的效应细胞组OD值）］／单独的靶细胞组OD值×100％。

1．4统计学处理统计学处理用GraphPadPrism6统计软件包对数据进行分析，数据以珋x±s表示，组间比较采用t－test，检验分析P＜0．05代表差异有统计学意义。

2结果

2．1Zol／IPP刺激γδT细胞的增殖效率比较经磷酸抗原联合rhIL－2刺激前列腺癌患者外周血PBMCs第三天开始可见细胞成集落生长，与IPP相比，经Zol刺激扩增γδT细胞生长状态较好，且集落多，大（图1）。细胞培养至第5天开始γδT细胞增殖成对数生长，利用不同磷酸抗原刺激γδT细胞扩增培养至14天后，用流式细胞术测定其γδT细胞的增殖情况（图2），结果显示在培养的前五天，二者刺激扩增的γδT细胞增殖效果相当，但在培养至第5天后，Zol刺激γδT细胞的增殖效率明显高于IPP组，且在第九天时γδT细胞含量最高，Zol组最高达64．7％，IPP组最高达55．9％（P＜0．05）。

2．2Zol／IPP刺激γδT细胞的杀伤活性比较以前列腺癌Du145细胞作为靶细胞，取培养至第9天的γδT细胞为效应细胞，按效靶比为5∶1，10∶1，20∶1混合，比较Zol和IPP刺激培养的γδT细胞对前列腺癌Du145细胞株杀伤活性（图3）。如图所示，在同一效靶比下，Zol组刺激扩增得到的γδT细胞对前列腺癌细胞的杀伤能力明显强于IPP组，在效靶比20∶1下，Zol组γδT细胞对前列腺癌细胞的杀伤率达到45．9％，IPP组γδT细胞对前列腺癌细胞的杀伤率为33．5％（P＜0．05）。图3Zol／IPP刺激扩增的γδT细胞对DU145细胞毒活性检测（P＜0．05）Fig．3CytotoxiceffectsofγδTcellsstimulatedbyZol／IPPtoDU145tumorcells（P＜0．05）

2．3Zol／IPP对γδT细胞增殖效应的动态观察为了更充分地了解Zol／IPP扩增γδT细胞的动态进程，从第5天开始到第14天，每2天收集培养的细胞，测定其增殖情况并计算增殖倍数（图4）。如图所示，Zol／IPP联合rhIL－2增殖倍数的峰值均出现在第11天，在培养的前9天中，对于两种不同磷酸化合物而言，IPP的刺激效应相对缓慢些，增殖倍数无统计学差异（P＞0．05），但在第9天后，Zol刺激的γδT细胞增殖倍数明显较IPP组大（P＜0．05）。

3讨论

γδT细胞是体内固有免疫的重要T细胞群之一，它能迅速识别TCR信号和模式识别受体信号并做出应答，并有研究发现其具有适应性免疫和部分免疫记忆的特点，因而目前认为γδT细胞是固有免疫与适应性免疫的桥梁，其相关研究倍受关注［1］。γδT细胞能够直接识别肿瘤应激抗原、磷酸化合物以及热休克蛋白的同源分子，其中磷酸化合物具有特异性扩增活化γδT细胞的能力已经得到反复证实［12－14］，如本研究所采用的Zol和IPP都属于此类物质。Zol的化学成分为氨已基咪唑类双磷酸，为双膦酸类药物，具有抑制破骨细胞，抑制骨吸收之功效，临床上被广泛用于治疗绝经后妇女的骨质疏松症和Paget＇s病，也被用于恶性肿瘤病人骨转移和高钙血症的治疗。近年的临床研究表明，相对于其他患者，接受过Zol治疗的肿瘤患者的生存率及肿瘤杀伤率都得到一定提升，其肿瘤患者体内的γδT细胞的数量有较为明显的上升［15－16］。目前已有研究者采用Zol代替IPP进行γδT细胞的体外扩增［11］。

为了进一步验证唑来磷酸对γδT细胞的扩增效率，本文研究比较了Zol和IPP两类磷酸抗原对前列腺癌患者外周血中γδT细胞的特异扩增能力，筛选确定其最佳的增殖条件，建立稳定的体外特异性扩增前列腺癌患者外周血中γδT细胞方法，为日后γδT细胞的在肿瘤免疫治疗应用中打下基础。图4Zol／IPP刺激前列腺癌患者外周血中γδT细胞增殖倍数Fig．4AmplificationfoldsofγδTcellsstimulatedbyZol／IPPonprostatecancerpatient本研究重点对Zol联合rhIL－2刺激前列腺癌患者外周血中的γδT细胞培养法进行了研究，并与IPP联合rhIL－2刺激培养法进行了比较，研究结果显示，Zol和IPP均能在体外有效的扩增前列腺癌患者外周血中的γδT细胞，两者对γδT细胞的趋势是一致的，均在刺激的第11天达到其扩增高峰，且扩增培养至第9天的γδT细胞对肿瘤细胞都有一定的杀伤活性。但从整个培养体系来看，Zol作为磷酸抗原刺激γδT细胞时，其扩增效率以及扩增倍数都明显较IPP好，且对肿瘤细胞的杀伤活性亦较IPP组强。综上所述，不管是采用Zol还是IPP作磷酸抗原时，都能在体外有效扩增前列腺癌患者外周血中γδT细胞。但Zol相对于IPP来说价格低廉，毒性小，而且Zol作为一种注射液应用的用药，比IPP更为安全的优势，故我们认为，在体外磷酸化合物Zol作为γδT细胞的扩增刺激剂，特别是对以γδT细胞为基础的肿瘤免疫治疗方面，其应用前景可能更为广阔。

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作者：郭吉楠1，房杰群1，袁也晴1，杨江根1，邹畅2，赵盼2，肖克峰1