细胞生物学的研究方法范文第1篇

摘要从教学内容、教学过程和考核方式等方面介绍了研究生细胞分子生物学课程的教学开展与体会，为适应多研究方向的研究生培养要求、提高教学效果提供参考。

关键词研究生;细胞分子生物学;教学;内容;考核

扬州大学硕士研究生培养方案课程设置将细胞分子生物学作为生物学一级学科的学位课程，包含植物学、动物学、生理学、水生生物学、微生物学、遗传学、发育生物学、细胞生物学、生物化学与分子生物学、生物物理学、生态学等11个生物学二级学科。扬州大学是江苏省属重点综合性大学，目前设有27个学院，11个生物学二级学科分散在生物科学与技术学院、农学院、兽医学院、医学院，各二级学科的研究方向也较广泛，如何适应这种多学院、多学科和多研究方向的硕士研究生培养要求，提高教学效果，扬州大学不断进行尝试、改革，构建了适合各二级学科培养目标要求的细胞分子生物学教学体系，现将这门课程的教学内容、教学过程和考核方式介绍如下。

1细胞分子生物学的教学内容

细胞分子生物学是随着细胞生物学和分子生物学发展而兴起的一门较新的学科，是一门在分子水平上研究基因对细胞活动调控以及各种细胞结构的形成和功能执行的科学[1]。对生物学专业的研究生来讲，本科阶段都学过细胞生物学和分子生物学这2门课程，因此研究生所开设的细胞分子生物学课程体系应该和本科生的课程体系有所区别。由于传统的细胞分子生物学教材与细胞生物学和分子生物学在内容上有很多雷同，若采用这些教材，很容易使研究生对该门课程失去兴趣。扬州大学将该门课程的教学内容分为4个部分:细胞结构、细胞遗传、细胞代谢与调控、细胞发育，该校没有选择任何固定教材，仅仅指定少数最新出版的教材作为参考书，如韩贻仁主编的分子细胞生物学[2]、Gerald Karp主编的Cell and Molecular Biology:Concepts and Experi-ments等[3]。

2细胞分子生物学的教学过程

扬州大学细胞分子生物学的授课对象差异比较大，学生的来源和专业背景也不同，在教学过程中，笔者尝试使用开放式教师、开放式教学和开放式课堂的教学方法。

2.1开放式教师

以往的研究生课程都是由固定的教师一上到底，由于教师的精力有限，不可能对细胞生物学各个领域的前沿知识都熟悉。为了解决这一问题，扬州大学采用不固定教师上课的制度，跨学科跨学院请资深教师进行授课，确保学生能够了解该领域的基本知识与前沿动态。设置的4个部分教学内容中，每一部分由1~2位专业教师负责主讲，教师可结合自己的专业背景，根据不同教学模块，设置具体的教学内容，不拘泥于任何教科书进行授课。有些教师的研究方向是植物，对植物细胞分子生物学的研究进展和前沿动态比较熟悉，讲授植物细胞分子生物学可以做到深入浅出，而对动物细胞分子生物学的讲授效果会比较差，因此主讲教师可选择来自植物、动物、微生物、病毒等研究方向的老师。对于学生，有些是来源于农学院，其背景知识和兴趣侧重在植物方面，而有些来源于医学院或兽医学院，其背景知识和兴趣侧重在动物方面，这就要求选择具有不同学科背景的教师。开展开放式的教学方式，满足不同学生的要求。

2.2开放式教学

由于细胞生物学是生命科学的前沿学科之一，因此在把握现有教材和参考资料的基础上，教学过程中要结合实际将细胞生物学相关领域的新进展、新知识、新方法介绍给学生，拓宽学生知识的深度、广度，培养其对未来工作的适应能力。

在每一个教学模块中，教师可通过不同的教学方式讲解不同侧重点的专题。如细胞结构部分包括讲了2个专题，一个是细胞内膜系统:结构、功能、蛋白质分选和膜泡运输，另一个是细胞骨架与细胞运动。内膜系统一般是指内质网、高尔基体、细胞核、溶酶体和液泡(包括内体和分泌泡)5类细胞器膜的总称，而广义的内膜系统概念也包括线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、细胞核等细胞内所有细胞器膜的总称。在本科细胞生物学教学过程中，这些细胞器的形态结构、功能和发生是分别独立介绍。虽然这些细胞器具有各自独立的结构和功能[4]，但它们又是密切相关的，尤其是它们的膜结构是可以相互转换的，转换的机制则是通过蛋白质分选和膜泡运输来实现的。在讲授内膜系统时，可通过蛋白质合成这条线将这些相关内容串联起来讲述。由于核糖体在蛋白质合成上与内膜系统互为一体，因此将核糖体也加入进来，同时向上讲可以提及细胞核中核糖体大小亚基及mRNA的合成，向下还可讲述细胞膜上的蛋白功能，从而用蛋白质合成一条线将细胞的三大结构即细胞膜、细胞质和细胞核联系了起来。同时，也启迪研究生自己去找线索，找出一根主干，将尽可能多的内容串起来。又如细胞骨架对于维持细胞的形态结构及内部结构的有序性以及在细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和细胞分化分裂等一系列方面起重要作用，因此对细胞骨架的研究是近代生命科学中最活跃的研究领域之一，它的快速发展主要得益于大型分析仪器的应用和实验方法技术的改进。在这一部分内容的教学中，可重点向学生讲解细胞骨架的研究方法，包括每种方法的原理、基本过程和结果分析，以最新的国外权威期刊上发表的细胞骨架方面的论文为例，向学生介绍细胞骨架的研究是如何开展的。

2.3开放式课堂

研究生课堂和本科生课堂相比，讲授内容量非常大。笔者一般会在课后将课件提供给学生，使他们在课堂上不用花太多精力记笔记，而是将主要精力集中到听课上，跟着教师的引导考虑问题，这样使其思维保持很高的兴奋度，且感到疲劳。在严格遵守课堂纪律的前提下，在上课时要尽量调动学生的积极性，以开拓学生的思维，培养创造性。课后要让学生自己阅读指定或推荐的原始文献，或者让他们自己到网上查阅自己感兴趣的问题，以此可培养学生阅读文献、查找资料、进行科研的能力。

3细胞分子生物学的考核方式

作为生物学一级学科硕士研究生的学位课程，细胞分子生物学的考核以考试为主，考虑到研究生学习细胞分子生物学课的目的主要是为了提高学生利用学到的细胞生物学知识解决课题研究中的问题，实用性较强，因此笔者选用开卷考试的形式，所出的试题都是综合性的分析题，在考场内学生可以查阅任何参考资料，但参考资料中没有现成的答案，促使学生综合运用所学知识，通过仔细分析才能得出答案。这种考核方式一方面提高了学生独立思考问题和解决问题的能力，另一方面也使教师了解了学生对这门课程的掌握情况，检验教学质量，很大程度上促进了以后教学的开展。

4参考文献

[1] 王石平，金安江.分子细胞生物学研究性教学模式的改革实践与思考[J].华中农业大学学报:社会科学版，2008(2):134-137.

[2] 韩贻仁.分子细胞生物学[M].2版.北京:科学出版社，2001.

细胞生物学的研究方法范文第2篇

光镊( optical tweezers)又称为单光束梯度力光阱( single-beam optical gradient forcetrap)，是一种利用高度汇聚的激光束形成的三维梯度势阱来俘获、操纵微小粒子的技术[1]。其中，势阱是指一个包围着局部最小势能的区域，因形如陷阱而被称为势阱。光镊自 1986 年由美国科学家 Arthur Ashkin[2]发明以来，已被广泛应用于生物医学、物理、化学等领域，成为一项重要的研究工具。最初，基于光学显微镜的光镊系统满足了对生物系统同时进行操纵和观测的需要。随着研究的深入，生命科学要求能够进行单分子层次的研究，光镊配套的成像观测系统因此发展出了在秒级时间尺度上的位移测量精度为10－10m级的光镊以提高空间分辨率；为了避免光镊高强度聚焦激光束可能产生的热效应和光化学效应，近场光镊和飞秒脉冲光镊应运而生，克服了传统光镊的热效应问题，有利于保持生物分子的稳定性。为适应生物系统的复杂性，双光镊、三光镊、四光镊和全息光镊等系统的出现实现了多粒子操控。随着光镊的进一步发展，光镊将有可能走出实验室，进入制造业、临床诊断等主流产业中去。本文将综述光镊及拉曼光镊的基本原理和特点，及其在生物医学领域中的研究进展、现状和展望。

光镊的原理和特点

光镊原理简述

光镊是基于光的力学效应的一种新的物理工具。这里以透明电介质小球为模型来阐明光镊的基本原理。如图 1，当一束光穿过电介质小球时，将发生反射和折射，在这个过程中，光子与小球碰撞产生的动量变化将使小球受到散射力和梯度力。散射力 (Fs)正比于入射光强，方向沿光传播的方向；梯度力(Fg)正比于入射光强的梯度，方向沿光强的梯度方向。光镊是依靠光的梯度力形成的，当达到焦点附近的梯度力大于散射力时才能形成一个稳定的三维光学势阱来稳定地捕获生物粒子。这一稳定的三维光学势阱是由一束激光通过一个短焦距透镜汇聚来实现的。如图 2 所示，无论入射光从法线之上或者法线之下入射小球，小球所受到的合力均指向焦点(f)，从而使小球被稳定“钳夹”在焦点的位置。

光镊的特点

光镊的基本功能赋予了其在生物医学研究领域中的独特优势。1) 光镊可捕获和操控数十纳米到数十微米的微粒，而大多数生物微粒，诸如细胞、细胞器甚至生物大分子，都恰好在这一尺度范围内。因此，光镊可用于操控和研究生物微粒。2) 光镊以一种温和的、非机械接触的方式完成夹持和操纵物体，捕获力是施加在整个微粒上，而不是像机械捕获那样集中在很小的面积上，不会对捕获的生物微粒造成机械损伤和污染。3) 由于光的无形性和穿透性，光镊可以在保持细胞自然生活环境的情况下对其进行捕获与操纵，而且，光镊的所有机械部件离捕获对象的距离都远大于捕获对象的尺度(1000倍)，是遥控操作，几乎不干扰生物粒子周围环境和它的正常生命活动。4)光镊能产生皮牛顿量级的力，且在捕获焦点附近表现出虎克弹簧的性质，能满足单分子力学和单细胞研究的需求，是重要的传感探测工具。另外，光镊与拉曼光谱结合被称为拉曼光镊技术。拉曼光镊被广泛应用于生物医学研究中，因其具有微量检测、快速和高精度等优点，特别适合生物样品的化学成分分析[3]。单独使用拉曼光谱进行测量时需要将激光束聚焦到样品上，再探测光束焦点处样品激发的光谱信号。用拉曼光谱技术研究活细胞时，待测细胞需要固定在载玻片上，这样就改变了细胞周围的微环境，可能对细胞机能产生影响。光镊的引入避免了这种情况，因为它可以非接触地操纵活细胞。因此，拉曼光镊可以获得单个活细胞的拉曼光谱，提取单个活细胞的结构信息[4]。

光镊和拉曼光镊技术在生物医学领域中的研究进展

基于多种成像技术的发展，光镊已经从物理学领域中脱颖而出，演变为一项适用于生物医学研究的多功能工具，这是由于光镊可以从单细胞的研究中获得详细的信息。其中，多光镊应用于单细胞的分析拥有巨大潜力，利用其平行测量功能，可以为研究人员提供良好的分析数据，例如，多光镊用于细胞异质性的研究、生物力的测量用于单细胞机械性能的研究等。利用光镊对分子马达和单分子力的研究可以得到其他方法难以获得的研究结果。光镊应用于细胞信号传导和组织工程也有广阔的前景。另外，光镊与微流控系统结合时，可以精确地控制细胞的化学环境，因而可以实现对酸碱性、渗透压、药物和温度等环境因素的实时、动态研究。随着自动化及其它便于操作的光镊设备的发展和跨学科学术合作的日益频繁，光镊技术将成为生物医学领域中一种经常使用的研究工具。

应用于血细胞和血液系统疾病的研究

血细胞

由于生物细胞的多样性和复杂性，在许多情况下，为了从研究中得到相关信息，需要对大量细胞进行研究。如果对细胞一个接一个地研究，研究过程会过分耗时。为了解决这一问题，多光镊被开发出来以实现对单细胞的平行研究。Ramser 等[5]开发了双光束光镊系统来研究红细胞，并使用不同波长的激光获得了红细胞的拉曼光谱，发现波长 514.5 nm 的激光激发出的光谱质量最好，且500～1650 cm－1范围内的光谱峰随时间发生了变化，这是由于这一区域的光谱对氧从血红素中解离的光解作用较为敏感所致。Cojoc 等[6]应用多光镊技术在多个位置成功捕获了红细胞，他们使用衍射分光镜将激光分裂为多光束，使用氩离子激光探测被捕获的红细胞。多光镊技术与单光镊相比有三个独特的优势：1) 允许细胞在三维空间内排布；2)允许细胞的侧向移动，激光可从不同位置激发拉曼光谱；3)入射在细胞上的激光强度分散，降低了光损伤的可能性。国内外有许多应用拉曼光镊对血细胞进行研究的报道。拉曼光镊基于光子的非弹性散射，通过获得入射光子与散射光子的能量差异，观察分子键的振动状态，从而获得丰富的分子结构信息。因此，拉曼光镊可以快速灵敏地分析红细胞，特别是分析血红蛋白的状态。Deng 等[7]使用拉曼光镊技术研究了酒精对红细胞的作用，他们记录了细胞与 20%酒精接触过程中的拉曼光谱随时间的变化情况，发现表示血红蛋白的光谱带强度随着红细胞与酒精接触时间的延长而下降。王桂文等[8]应用拉曼光镊技术俘获形态正常和发生形变的红细胞并获得其拉曼光谱，以平均光谱、主成分分析 (principal component analysis，PCA) 等方法分析不同形态红细胞的光谱差异与胞内血红蛋白的变化，以及这些差异和变化对光谱诊断分析的影响。结果发现，在正常的生理环境下，红细胞发生皱缩甚至形成棘形细胞，都不会影响光谱判别分析。最近，该实验组应用拉曼光镊结合气体循环供给装置，收集并分析了不同氧合状态的单个红细胞的拉曼光谱[9]，发现较强功率的激光照射会导致血红蛋白凝集特征峰(1248 cm－1和 1371 cm－1)升高。I1638/I1547比值是区分氧合态与去氧合态的良好标志，经较长时间保存的红细胞氧合能力增强，但去氧能力没有显著变化；α地中海贫血 HbH-CS患者的红细胞氧合能力比正常对照强，但其去氧能力较差。由此可见，拉曼光谱特别适合分析血红蛋白。这主要因为血红蛋白的活性中心由卟啉环组成，卟啉环可以吸收几个可见光区的波长，使用接近这些波长的激光照射红细胞，就会出现共振效应，测量集中在血红蛋白分子上，而不会受到其他细胞成分和环境的干扰。由于在全血中可以检查到许多血细胞缺陷，血液细胞的分选受到关注。Grover 等[10]使用两束相反方向的激光，在光捕获的基础上，通过图像处理系统区分红细胞、白细胞和血小板，并最终将分选好的各类细胞转运到微流系统的指定容器中。该分选方法快速、精准。这说明当分选对象在大小、形状上存在较大差异时，可以利用其在光场中所受作用力的不同对其进行分选。Paterson 等[11]利用 Bessel 光产生的环形对称光场将红细胞与淋巴细胞分开，正是由于两种细胞的受力不同，在光场中的行为也不同。在该研究中，研究者发现双凹形的红细胞在Bessel 光的外环上聚集后才到达 Bessel 光中心，而球形的淋巴细胞则直接到达 Bessel 光中心。最近，Yang 等[12]使用光镊技术来测量凝血细胞之间的力，通过观察血红细胞的活动，发现凝血共经历三个阶段；通过测量血红细胞间的相互作用力，发现肝素使血细胞之间的力变小并延长了凝血时间，而氨甲环酸使凝血过程跳过前两个阶段而直接进入最后阶段。由于光镊的力范围在飞牛至纳牛，正好涵盖了许多细胞内和细胞间的生命过程，所以，可以很好地应用于测量细胞间或细胞内分子之间的相互作用力。

血液系统疾病

血液系统疾病主要表现在血细胞的异质性，由于拉曼光镊可以获得详细的生物细胞分子的结构信息，因此，可用于对细胞异质性的研究。Chan等[13]利用拉曼光镊技术获得了正常和癌变白细胞的拉曼光谱，发现癌变的白细胞 DNA 光谱带强度比正常白细胞低。Chan等[14]还通过捕获白血病病人的活体白血病细胞获得了可复制性的拉曼光谱，并应用 PCA 方法将正常和癌变白细胞的拉曼光谱进行了区分。由主元线性鉴别分析法 (principlecomponent linear discriminant analysis，PC-LDA) 进行监督分类，敏感度可达到 95%。因为使用了真实的临床病例，提高了这项研究的应用价值。Jess 等[15]应用双光镊并结合拉曼光谱和微流控芯片，获得了单个 HI60 人类早幼粒白血病细胞的拉曼光谱。微流控芯片的应用显著加快了细胞的拉曼光谱检测进程。De Luca等[16]采用拉曼光镊技术，在单细胞水平上研究了β-地中海贫血红细胞的携氧能力和细胞膜脆性，发现地中海贫血红细胞的携氧能力下降，且其对于氧分压更为敏感；测量到的膜剪切系数显示地中海贫血红细胞膜脆性增加了40%，证实主要影响血红蛋白合成的基因缺陷对于红细胞的机械性能也存在强烈的影响。王桂文等[17]应用拉曼光镊技术收集了一例重型α地中海贫血患者单个红细胞的拉曼光谱。结果发现，重型 α 地中海贫血患者红细胞的拉曼光谱信号显著低于正常对照，并检测到一定比例的有核红细胞；正常对照的红细胞拉曼光谱均一，而重型α地中海贫血患者的细胞形态和拉曼光谱均显示出多样性；中等大小、形态接近正常的一类红细胞，其细胞间光谱差异最大；可观察到部分外表形态正常的红细胞，但其血红蛋白可能发生了血红素凝集和蛋白质变性。该实验组[18]还将 PCA和反向传播 BP 网络预测模型相结合，进行了地中海贫血红细胞类型的判别。PCA 结果显示，正常对照与中间型α地中海贫血细胞(HbH-CS)基本可以区分，但正常对照与重型β地中海贫血细胞及 HbH-CS 与重型 β 地中海贫血细胞间的差异不明显。将归一化处理的前5个主成分进行 BP 网络训练及预测，结果发现，正常对照与 HbH-CS 间的预测正确率高达97.90%，正常对照与重型β地中海贫血细胞及 HbH-CS 与重型 β 地中海贫血细胞间的预测正确率分别为 90.72%和 86.28%。综上所述，通过将光镊与拉曼光谱和微流控芯片相结合，可用于检测血细胞中血红蛋白的生理状态，并对血细胞进行分选，具有很大的临床应用潜力。应用该方法，可以获得异质红细胞与正常红细胞的拉曼光谱，通过PCA 等数据分析手段实现对异质红细胞的鉴别和分选。另外，多光镊的应用明显扩大了对血细胞的研究范围，提高了研究效率。

光镊和拉曼光镊技术应用于微生物和感染性疾病的研究

微生物

大肠埃希菌

由于通过拉曼光谱可获得被分析物的分子指纹，因此，拉曼光镊也可被应用于对单个微生物细胞组分的研究。Xie和 Li[19]使用波长为 785 nm 的激光获得了大肠埃希菌的拉曼光谱，用此方法获得的光谱具有较好的信噪比(signal noise ratio，SNR)和较小的背景干扰。他们发现，大肠埃希菌在 60℃以上培养时，代表核酸的光谱带强度显著下降。该实验组进一步的研究[20]还发现，使用拉曼光镊能够区分不同培养条件下平台期的细菌。生物对激光的反应取决于激光的波长和强度。与可见光相比，近红外激光能够降低光损伤。Neuman 等[21]研究了波长为 790～1064 nm 的激光对大肠杆菌的近红外光效应，发现光损伤最小的激光波长为830 nm 和 970 nm，而光损伤最大的激光波长为 870 nm 和930 nm。Rasmussen 等[22]研究光镊捕获对大肠杆菌的生理损伤，通过测量胞膜内外pH 梯度来确定细菌的生理状态，发现，波长 1064 nm、功率 6 mV 的激光捕获大肠杆菌 60 min，其细胞膜内外的pH 梯度无显著下降，而用同样波长、功率 18 mV 的激光捕获仅几分钟，大肠杆菌细胞膜内外的pH 梯度就明显下降；他们还发现，振荡条件下培养的大肠埃希菌比非振荡条件下培养的受到的生理损伤小。Mirsaidov 等[23]对大肠杆菌的生存力进行了研究，与之前的研究结果不同，研究人员发现光损伤与近红外激光波长(840～930 nm)的关系微弱，但与激光强度呈线性相关，大肠杆菌的致死光能量为 5 J。Moritz等[24]通过拉曼光镊技术结合 PCA 方法，在单细胞水平上研究了大肠埃希菌对抗生素的反应，发现，培养 4 h，无抗生素组在 729 和 1245 cm－1出现谱峰，而在 1660 cm－1没有谱峰；1 vol%青链霉素组和 5 vol%青链霉素组在 1660 cm－1出现谱峰，但是在729 和1245 cm－1没有谱峰。头孢菌素组的光谱在 729 和 1245 cm－1与青链霉素组相似，反应了抗生素存在下细菌胞内腺嘌呤的生理变化。但是，头孢菌素组的光谱在 1660 cm－1没有谱峰，这可能与青链霉素引起70S 核糖体单体在细胞内的聚集有关。可见，通过对获得的拉曼光谱进行数据处理分析，可得知细胞内外生物大分子的变化情况，因此，拉曼光镊可用于研究环境因素对微生物的作用及其机制。

酵母菌

Xie等[25]通过拉曼光镊技术获取酵母菌的拉曼光谱，再通过与已知正常和死亡酵母菌的拉曼光谱进行比较来筛选正常酵母菌。由于伊红只能使死亡的酵母细胞着色，因此通过拉曼光镊技术分选出的酵母细胞可以通过伊红染色的方法复查。应用此方法对 6 个酵母细胞进行筛选的精确度为 100%。说明可以利用拉曼光镊对酵母菌进行筛选。然而该研究只用了6个细胞，该方法的可靠性需要更大的样本量来加以验证。Creely等[26]通过波长 785 nm 的激光获取酵母菌的光谱，研究该波长的激光对酵母菌的损伤，发现酵母菌被 785 nm 的激光捕获 2 h 未出现细胞损伤，未在拉曼光谱中观察到蛋白质构型的改变，说明 785 nm 的激光对酵母菌的光损伤很小。Eriksson等[27]将光镊与微流控芯片相结合，研究酵母细胞氧化应激的信号路径。其中，绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)与信号路径中的蛋白相结合，可通过荧光显微镜观察细胞的反应。他们发现，转录因子 Yap1p 是在抵抗氧化应激中起主要作用的调节因子。当细胞受到氧化应激时，Yap1p-GFP 进入细胞核，而在正常情况下，Yap1p-GFP 应回到细胞胞质中。该实验组还以同样的方式研究了不同葡萄糖浓度下的 Snf1 路径。Tao 等[28]应用拉曼光镊技术探测粘红酵母细胞内的胡萝卜素、核酸及其他重要生物分子。他们发现，胡萝卜素和脂质的合成在对数期末才出现显著增加，在平台期之后总量达到最大；核酸在早期的合成增加，随着酵母菌生长逐渐平稳，核酸合成反而逐渐下降。这些实验说明拉曼光镊系统作为一种快速、便捷、可靠的方法，可以用于胡萝卜素合成过程的菌体内研究。一般来说，生物对激光的反应取决于激光的波长和强度。通过改变捕获激光的光学性质，可以实现不同的研究目的。就非损害的光学捕获而言，应该使用近红外激光。但是，由于不同的生物分子和细胞对激光的反应不同，光镊用于捕获微生物时，应该探索特定波长和强度的激光对该生物的影响。将拉曼光谱与光镊相结合，能够获得细胞内各组分和细胞外分子的详细信息，可用于鉴别不同微生物，检测其生活状态及生命过程。另外，荧光显微镜和特定荧光团的使用能够帮助检测到细胞内某些特定物质的生命活动。

感染性疾病

Mohanty 等[29]基于红细胞在光镊夹持下的旋转运动提出了疟疾的高效诊断方法。当健康红细胞与高渗缓冲液接触时，红细胞变为半月形并在光镊捕获下旋转，而疟疾感染的红细胞不旋转，受感染个体中健康的红细胞低速旋转。该特征可被用于筛查血样。通过该方法在 30 s 内可分析完成 20 个红细胞。最近，Saraogi 等[30]通过用光镊测量受到疟原虫感染的单个红细胞的布朗运动来研究红细胞物理性质的改变。光镊捕获力是该实验的一个重要参数，因为光镊捕获力与激光强度、被捕获对象的物理性质有关。测量布朗运动的功率谱是确定光镊捕获力的方法，该实验就采用测量功率谱的办法来确定光镊的捕获力，进而了解被捕获红细胞的物理性质。研究发现，正常红细胞与被感染红细胞的功率谱出现具有统计学意义的角频率不同。由于感染引起红细胞物理性质的改变，从而使角频率发生变化，但是角频率的变化与感染各个阶段的关系不大。实验中发现仅有不到 10%的红细胞受到寄生虫感染，但是，从感染病人血液中提取的未受疟原虫侵染的细胞，角频率也存在明显的增加，这说明了旁观效应的存在。由于疟原虫可以引起血红细胞性质的变化，因此，通过光镊对受感染红细胞的运动、物理性质等数据进行测量，可为诊断疟疾提供帮助，有望成为疟疾的辅助诊断工具。目前，在口腔医学领域中应用光镊或者拉曼光镊技术进行的研究不多。梁裕芳等[31]应用拉曼光镊技术比较分析了口腔毛滴虫和阴道毛滴虫的拉曼吸收峰，并寻找具有分类学鉴别价值的特征拉曼峰。通过光镊随机俘获单个大小一致、有活力的虫体并记录其拉曼光谱，收集数据并做PCA分析。通过实验发现，不同来源的虫体在 937 cm－1、1002 cm－1和1446 cm－1谱峰的强度和谱型有差异，因此，根据 1002 cm－1谱峰的信号强度，并结合937 cm－1和1002 cm－1峰强度比值(I937/I1002)及1002 cm－1和1446 cm－1峰强度比值(I1002/I1446)，可以作为区分阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的量化指标。可见，拉曼光镊技术可以用于鉴别两种毛滴虫。

光镊和拉曼光镊技术应用于肿瘤疾病和抗癌药物的研究

肿瘤疾病

乳腺癌

由于癌细胞在生物分子构成上发生了显著变化，癌细胞的大小、物理性质等也会发生相应的改变。Guck 等[32]使用以光镊为基础设计的“光担架”研究乳腺癌细胞，发现乳腺癌细胞比正常乳腺细胞更容易发生形变。更强的形变能力被认为与恶性肿瘤细胞需要形变后进入循环系统而发生远处转移有关。这一方法可以用于微流细胞筛选，并根据细胞膜变形能力进行诊断。

前列腺癌

由于前列腺特异性抗原检测的高假阳性率，临床上迫切要求提高诊断前列腺癌的准确性。由于拉曼光谱中包含了大量的化学物质结构信息，拉曼光镊被广泛应用于肿瘤细胞与正常细胞的鉴别。Harvey 等[33]应用拉曼光镊技术结合 PCA，区分前列腺癌细胞 (PC-3) 和膀胱细胞系(MGH-U1)，发现 MGH-U1 比 PC-3 含有更多的核酸和蛋白质。这项研究显示拉曼光谱包含大量化学物质的结构信息，例如，氨基化合物Ⅰ和氨基化合物Ⅱ的光谱带分别位于 1650 cm－1和 1570 cm－1，脂质的光谱带在 1200 cm－1至 1400 cm－1的区域内占优势，含苯丙氨酸的蛋白质在1002 cm－1能被清楚地观察到，也有蛋白质在 860 cm－1的位置出现光谱带，在 800 cm－1以下区域的弱带一般代表核酸。Harvey 等[34]还采用化学方法固定前列腺癌细胞、早期前列腺良性肥大细胞和尿道细胞，并应用拉曼光镊技术对这三种细胞进行鉴别。实验结果显示，敏感性大于72%，特异性大于 90%。可见，该研究方法有可能应用于临床，通过简单的尿液检查对前列腺癌进行诊断。与活体组织检查相比，该方法对患者造成的痛苦少，但就其敏感性和特异性而言，仍无法取代活检。

结直肠癌

Zheng等[35]应用拉曼光镊技术获得了 200 个正常和 200 个癌变结直肠细胞的拉曼光谱，并使用ANN和 PCA 对光谱进行分类。结果显示：80 个光谱的单盲试验，敏感性和特异性均达到 86.3%；双盲试验，敏感性达到 85%，特异性达到 92.5%。Chen 等[36]制备了取自直结肠癌变组织的细胞悬液，用光镊捕获正常和癌变结直肠上皮细胞并获得其拉曼光谱，分析显示癌细胞包含更多的核酸和蛋白质。通过单盲试验，敏感性达到 82.5%，特异性达到92.5%。Deng等[8]使用拉曼光镊技术对正常和癌变的直结肠细胞进行研究，发现正常直结肠细胞的光谱带强度比( 1002/1300)为 1.08，而癌变直结肠细胞的光谱带强度比为 0.85。1002 cm－1的光谱带代表蛋白质，1300 cm－1的光谱带代表脂质，可见，正常的直结肠细胞比癌变的直结肠细胞含有更多的蛋白质和更少的脂质，因此通过选择合适的参数(如光谱带强度比)，可实现对细胞良、恶性的快速鉴别。

其他肿瘤

Banerjee和 Zhang[37]应用拉曼光镊来区分星形胶质细胞和它的癌变细胞，与其他肿瘤的研究结果相似：癌变细胞的蛋白质和脂质的光谱带强度比星形胶质细胞的光谱带强度高，这项研究说明拉曼光镊有在较为复杂的领域中进行研究的潜力。姚辉璐等[38]利用拉曼光镊获得了鼻咽癌细胞株和正常人鼻咽部气道上皮细胞株的单细胞拉曼光谱，结果显示：正常细胞和癌细胞的平均拉曼光谱有显著差异，正常细胞的光谱强度比癌细胞明显要高，正常细胞的光谱带强度比(1304/1336)为 1.05，癌细胞为 1.22。证明拉曼光镊可以成为区别正常鼻咽细胞和鼻咽癌细胞的有效手段。该实验组[39]还应用相似的实验模型获得了正常肝细胞株和肝癌细胞株的单细胞拉曼光谱，得到了类似的结果：正常细胞和癌细胞的平均拉曼光谱存在显著差异；癌细胞谱线强度整体变弱；正常细胞1658 cm－1处峰和 1450 cm－1处峰的强度比值为 0.63，癌细胞为 0.99；癌细胞的核酸、蛋白质、脂类等重要生物分子在结构或含量上都发生了不同的改变。用 PCA 方法对单个细胞的平均拉曼光谱进行分析，结果发现PCA 可以正确区分出正常细胞和癌细胞。

抗癌药物

国外学者使用光镊研究 DNA 插入药物与 DNA 的结合方式和亲和性。过去的研究发现喹唑酮类药(PD153035)为新型酪氨酸激酶抑制剂，还发现 PD153035 可以直接插入 DNA，说明这种多靶向定位药物具有很大的治疗人类恶性肿瘤的潜能。Cheng等[40]使用双光镊来确定 PD153035 的亲和性常数 (KA)和插入位点之间最小的碱基对数(n)。光镊系统与一个倒置的光学显微镜结合，包含两束激光，一束采用减反射镜来控制，作为固定势阱，另一束采用扫描镜来控制，作为扫描势阱。另外，用一个四象限光电二极管探测被捕获微珠的位置。为了构建 DNA- 微珠复合体，将噬菌体 DNA 片段的生物素酰化末端与 T4DNA 连接酶捆绑，末端附着于抗生蛋白链霉素包裹的平均直径为 1.87 μm 的微珠上。实验结果表明，DNA在 1 mmol/L 的甲次砷酸钠液中明显增长，在 (23±0.5)℃的环境温度下，KA= (1.18±0.09)×104mol－1L，nPD153035=11 bp。在测量 DNA 分子力的实验中，直接进行 DNA 的操作并不方便，通常需要将DNA 链的一端与微珠相连，以便于对 DNA 的操控。

光镊和拉曼光镊技术应用于亚细胞结构的研究

除了细胞水平的研究，拉曼光镊也可应用于对亚细胞结构(如染色体、线粒体、DNA、RNA等)进行研究。Ojeda 等[41]采用拉曼光镊技术，捕获操控染色体并获得即时光谱，成功鉴别了三个不同的染色体。他们使用光镊分离三个不同的染色体，获得拉曼光谱并进行GDA分析，再用光镊将染色体放置于载玻片上，通过 G 带染色来验证光谱的检测结果。实验结果表明能够根据拉曼光谱区分这三个染色体，从而证实了使用拉曼光镊技术无需染色就能够鉴定人类染色体。Reiner等[42]使用光镊技术从溶解的人 HL-60 细胞中成功提取出单个线粒体并完成线粒体 DNA 异序性的检测。用线粒体绿色荧光染料 (Mitotraker Green FM) 对线粒体染色标记，利用紫外光使细胞溶解，用荧光辨认单个线粒体，再用红外激光捕获线粒体并将其移动到微小的吸液管尖端，线粒体被吸入缓冲液，为分析线粒体 DNA (mtDNA) 做准备。使用PCR 技术 3 次 DNA 扩增后，通过基因测序的方法发现单个线粒体中 mtDNA 的异序性比率约为 50%。该研究说明，荧光显微镜及荧光染料的发展为光镊对细胞中某些特定物质的研究打下了基础。Tang 等[43]应用拉曼光镊技术研究从大鼠的肝脏、心肌和肾脏组织中提取出来的线粒体。首先记录脂质、蛋白质、核酸的拉曼谱峰，再通过拉曼光镊获得各组织中提取出来的线粒体的拉曼光谱，发现从不同组织中提取的线粒体的差异是由于各组织中线粒体组分的不同造成的，例如，肝脏线粒体和心肌线粒体的光谱差异源于脂质的结构和蛋白质的分子量不同。Tang 等还发现，当线粒体与含 100 μmol/L Ca2+的 KCl 缓冲液接触时，1602 cm－1的拉曼谱峰强度下降。这项研究说明拉曼光镊技术可以研究单个线粒体的生命活动及其与药物、毒素接触时的组分变化情况。

光镊和拉曼光镊技术应用于生物学基础研究

在一些研究中，需要以可控的方式去除某些细胞成分而又不损伤其他细胞组分。此时，可以采用脉冲紫外激光或者近红外激光作为光刀攻击细胞器，使其不可逆地失去功能。Paterson等[11]使用紫外光二极管为光源，以相对较低强度的光切细胞膜，向仓鼠卵细胞中引入外源 DNA。Stevenson 等[44]使用钛宝石激光，以同样的实验模型研究细胞的转染率和生存力，研究显示光手术非线性地依赖于光强度，作用于细胞膜上的激光强度为 1.2 μJ/cm2时，细胞转染率为 50%。光刀也可应用于研究细胞不同部分的功能。Grigaravicius 等[45]将光刀应用于老化研究。DNA 的自我修复作用在维持胞内生化反应中起着至关重要的作用，为了更多地研究 DNA 修复分子与 DNA 损伤位点之间的动力学，在时间和空间上有控制地敲除特定DNA很重要，光刀提供了卓越的空间和时间控制，因而成为该实验的理想工具。将光刀与荧光显微镜结合，他们发现，对 DNA 轻度损伤的修复发生在实际发生 DNA 损伤位点的旁边而并不直接位于该位点上，其原因需要进一步的研究。另外，紫外激光也可在细胞膜上钻孔，以观察荧光染料在细胞内的扩散，该技术被应用于研究细胞内区室之间的连接情况[46,47]。将紫外光导向相邻两个细胞的邻接点可引起两个细胞的融合，He 等[48]应用这种方法，使用1550 nm 的飞秒脉冲激光将人肝癌细胞与人子宫颈癌细胞融合，细胞融合率为37%。多光镊的出现实现了多个粒子的同时操作，而使激光穿过空间光调制器(SLM-spatiallight modulator)可得到需要的光结构。随着成像技术和计算机的发展，实现了全息计算直接与 SLM 连接，最终建立起全息光镊系统。Monnoret 等[49]将设计的储液池与全息光镊结合，引导多个橡胶微珠与 cos-7 细胞的特定区域结合，这项研究作为使包裹配合基的橡胶微珠与细胞膜密切结合的基础，可应用于细胞膜受体的动力学研究。此外，光镊在组织工程学研究中有巨大的应用潜力，Mirsaidov 等[50]通过将微流控系统与分时光镊结合，成功构建了人工合成组织。其中，微流控系统将细胞导入组织装配区；分时光镊用于将细胞组装成为复杂的培养组织，之后，这些细胞被包裹在模拟细胞外基质的可光聚合水凝胶中。通过上述过程的反复操作，该人工合成组织的体积逐渐增大。

细胞生物学的研究方法范文第3篇

【关键词】 治疗性克隆；细胞核;移植；胚胎干细胞

1治疗性克隆概述

治疗性克隆（therapeutic cloning）是体细胞核移植技术和最新的人胚胎干细胞技术结合的产物，将成为人类医疗历史上革命性的技术. 该技术首先应用患者体细胞，如皮肤细胞、骨髓间充质干细胞，作为核供体，移植入去核的人卵母细胞，获得克隆胚胎；然后从克隆胚胎分离建立胚胎干细胞系；并将这些胚胎干细胞在一定条件下，诱导分化成所需要的各种类型的细胞用于治疗目的［1，2］. 目前已报道，将产生多巴胺的神经元细胞用于治疗帕金森症［3］，将产生胰岛素的胰岛细胞治疗糖尿病患者［4］. 从理论上来说由于使用的是患者自身的细胞生产出来的治疗用细胞，移植这些细胞到患者体内将不会产生免疫排斥反应. 另一方面，每年都有数以百万计的患者需要细胞、组织的修复或者器官移植，由于胚胎干细胞可以无限传代，在数量上可以保证治疗的需要，从而解决可供移植的细胞、组织和器官来源严重不足的瓶颈问题［5］，为人类健康和长寿提供了新的希望.

近年来，利用核移植技术和胚胎干细胞技术相继建立了人核移植胚胎干（nuclear transfer embryonic stem cell，ntES）细胞系和人兔异种间ntES细胞. 这2项阶段性研究成果的取得，标志着治疗性克隆研究的巨大进步. 韩国科学家Hwang等［6］通过核移植技术获得了人人ntES细胞. 他们以健康女性志愿者的体细胞为核供体，以其自身卵母细胞为受体. 在30枚核移植囊胚中，得到20个内细胞团（ICMs），建成1株人 ntES细胞系，可传代培养70 代以上. 上海第二医科大学盛惠珍研究小组［7］在国际上首次构建了人兔核移植重构胚. 分别将5，42，52和60岁4个年龄组的人皮肤成纤维细胞核移入去核兔卵母细胞内，获得ntES细胞，通过原位杂交、免疫组化、核型和同源基因分析等证实 ntES细胞具有人源性，并且保持干细胞的未分化特性，能形成类胚体，在一定诱导条件下可以分化为神经、肌肉等3个胚层的细胞群. 200506，汉城国立大学的研究者［8］以患者的皮肤细胞为供体，以志愿者捐赠的卵母细胞为受体，利用体细胞核移植技术成功建立11株人核移植胚胎干细胞，这些细胞具有多能性，染色体正常，与供核患者的DNA一致、组织相容性抗原一致.

2治疗性克隆的应用前景

ES细胞在生物医学的各个领域均有广阔的应用前景，ntES细胞也有着同样广阔的前景，为临床治疗学、细胞生物学、生物发育学、比较动物学等研究提供研究材料和方法.

2.1临床疾病的治疗ntES细胞与普通的细胞移植治疗相比，具有革命性的进步. 它以患者的体细胞为核供体，通过核移植技术获得的ntES细胞，与患者的遗传物质相同，可以消除受体对供体的免疫排斥反应，为目前多种退形性疾病，如心脏病、脊髓损伤、帕金森病、1型糖尿病等的治疗带来了新的希望. 特别是一些目前还没有找出致病基因的遗传病，如脊髓侧索硬化症，ntES细胞移植是最有希望的治疗方法. 目前已经应用ntES细胞在体内外分化成多种细胞，包括神经细胞和生殖细胞［9，10］. 尤其Barberi等［9］建立了一套方法，能使 ntES细胞向中枢神经系统细胞特定分化，能产生高效率的神经胶质细胞、寡突细胞、神经元细胞，包括多巴胺能神经元、γ氨基丁酸能神经元等，将分化的多巴胺能神经元移植到 Parkinson病模型后，能改善其症状. 细胞治疗的途径有两种：其一，ntES细胞定向分化后移植. 细胞扩增后，体外定向分化，对分化细胞进行纯化，将获得的目的细胞移植到病变部位，替代丧失功能的部分细胞；其二，ntES细胞原位移植. 与定向分化后相比，ntES细胞原位移植有以下缺点：①没有经过纯化，可能将污染的异源饲养层细胞带进移植部位；②ntES细胞没有转入经选择基因，无法控制植入细胞的命运，可能发生癌变；③ntES细胞分化成分复杂，目的细胞分化成分少，可能出现大量非必须细胞的分化.

2.2细胞生物学通过研究ntES细胞的体外分化特性，可以识别某些靶基因，对人类新基因的发现，功能基因的研究，以及基因治疗的研究均有重要意义. 通过探讨ntES细胞体外增殖和分化的机制，了解各种生长和分化因子的作用，为组织再生和修复的研究提供了新的工具；通过诱导ntES细胞癌变，可分析肿瘤细胞发生的分子机制. ntES细胞作为一种得天独厚的研究材料，对于阐明细胞增殖、分化、凋亡、迁徙、恶变等机制有着重要意义. 自发现ES细胞以来，人们已经利用ES细胞建立了多种细胞类型的体外分化系统，体外分化的多种细胞类型都曾被成功的植入胎鼠或成体鼠，在受体鼠体内形成有功能的细胞群.

2.3发育生物学由于哺乳动物在母体内受胚胎发育的个体大小和内环境条件的限制，很难系统地研究其早期的发育进展、细胞分化及调控机制等. 比较动物卵母细胞质对同种或异种细胞核发育的影响，在细胞和分子水平上为研究哺乳动物胚胎早期发育的调控机制提供了良好的材料和方法，也为研究胚胎发育的影响因素提供了便利条件. 建立在ES细胞和基因打靶技术基础上的复杂的转基因系，使人们可以建立有效的分析系统，从而在分子水平上研究不同的生物学问题. 它不仅可以将一些在发育过程中对动物体非必需或可被替代的特定基因进行敲除(gene knockout)，在体内进行功能缺失研究，而且还可以研究基因在不同发育时期中的作用. ntES细胞作为一种体外细胞系，提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系. 因此，就有可能人为地产生一些基因突变，如对胚胎致死性基因的研究等，也可利用这些突变的基因来克隆产生转基因小鼠，从而建立基因突变的模型.

3治疗性克隆面临的问题

3.1亟待解决的问题①体细胞克隆效率与ntES细胞建系效率普遍较低：核移植胚发育至囊胚的几率为19%～25％，与牛、猪的核移植囊胚发育率相当分别约为25％和26％；从克隆囊胚获得ntES细胞的效率仅有4%~16％，平均8.2%［11］. ②卵母细胞来源问题：ntES细胞用于人治疗性克隆，卵母细胞的需求量是非常大的，目前尽管已有许多措施来改进核移植技术，但仍没有明显提高. 要得到一个ntES细胞系平均需要12 个囊胚，而所需要的卵母细胞数就更多了，一个ntES细胞系平均需要666个. 如果ntES细胞系用于人类疾病的治疗，这样的代价是非常大的，即使目前报道的最高效率的建系，也是30个卵母细胞，才能得到一个ntES细胞系. 另外一种替代策略就是利用非灵长类异种哺乳动物的卵母细胞，例如兔、山羊等. ③伦理问题：胚胎生物技术涉及使用早期未着床的胚胎，特别是治疗性克隆技术还将无法避免的使用通过体细胞克隆获得的人的早期克隆胚胎. 世界各国尤其是西方国家对此争论很大［12，13］. 迫于社会公众与宗教的压力，大多数西方国家对治疗性克隆技术应用于人类，持反对态度，不允许国家科研经费支持治疗性克隆的研究. ④临床应用问题：如ES细胞系可能在培养过程中出现染色体非整倍性问题，ES细胞定向分化能力及分化细胞的稳定性问题；其次，异种核移植产生的人动物重构胚还存在安全性问题：异种重构胚在发育早期含有2种线粒体，以后供核体的线粒体取代了受体的线粒体，但受体卵浆中所带的异种蛋白，包括细胞器及mRNA，它们的命运如何，是否也像线粒体一样完全被供核体所取代，还有待进一步证明. 再次，在核移植的过程中，可能存在跨种间病毒传染，例如，人兔核移植胚胎干细胞，有可能将某些目前未知的兔疾病传染给人类，就像艾滋病病毒可能是从非洲猩猩而来那样.

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3.2建立我国知识产权的治疗性克隆技术随着干细胞技术和体细胞核移植技术的研究进展，我国学者在治疗性克隆的技术方面也处于世界前列. 当前，在我国研究和发展治疗性克隆技术，建立我国知识产权的治疗性克隆的细胞产品，创建细胞治疗产业，是一个很好的机遇. 我国在治疗性克隆研究领域的优势：①目前，我国在哺乳动物克隆技术的研究方面处于国际先进水平，相继成功克隆出了牛、羊等动物. 1991年，西北农林科技大学生物工程研究所在世界上首次获得山羊胚胎细胞核移植成功，共得到5只羔羊. 1998年，该研究小组用来自成年雌性山羊的皮肤成纤维细胞作供体，采用细胞质内直接注射的方法将供体细胞核直接注入去核卵母细胞内，胚胎激活后移植到受体母羊子宫角，获得了2只体细胞核移植后代，这是世界上首批成年体细胞克隆山羊，并获得了克隆山羊的第4代后裔，目前仍生长健康. ②宽松的人文环境. 中国公众有着不同于西方的伦理观念，对于动物权利和早期胚胎的担心没有西方国家严重，也基本没有因为宗教信仰而反对胚胎生物技术的问题. ③法律和法规的基本保证. 为保证和促进人胚胎干细胞研究的健康发展，国家科技部和卫生部联合下发了《人胚胎干细胞研究的伦理指导原则》，使治疗性克隆的研究合法化. 但我国明令禁止克隆人和买卖人类胚胎.

然而，中国的优势不能在治疗性克隆的研究领域走在国际前列，主要原因是经费不足和相关学者缺乏协同研究. 应用克隆技术结合胚胎干细胞体外诱导分化和细胞治疗方法的关键是技术问题. 我们希望临床学者与基础细胞生物学家联手合作，借鉴国外的思路，应用自愿者的卵母细胞，建立中国人的ntES培养技术，为治疗性克隆的临床应用奠定基础. 我们坚信，中国有可能在这个领域走在世界前沿.

【参考文献】

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［4］ Segev H， Fishman B， Ziskind A，et al. Differentiation of human embryonic stem cells into insulinproducing clusters［J］. Stem Cells，2004；22(3)：265-274.

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［8］ Hwang WS， Roh SI， Lee BC， et al. Patientspecific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts［J］. Science，2005；308(5729):1777-1783.

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［11］ Mombaerts P. Therapeutic cloning in the mouse［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2003；100（Suppl 1）：11924-11925.

细胞生物学的研究方法范文第4篇

铅离子对K562细胞红系分化的影响

二巯基丁二酸与不同营养素联合干预小鼠铅中毒的研究

食品添加剂亚硫酸钠对肝细胞蛋白合成功能的影响

自噬参与锰诱导的SH-SY5Y细胞毒性研究

全氟辛烷磺酸对SD大鼠肝毒性及其肝脏细胞色素P450 mRNA表达的影响

杠柳毒苷单次给药的毒性研究

过氧化苯甲酰对雄性大鼠质量及睾酮水平的影响

影响卷烟烟气总粒相物细胞毒性测试的因素

溶血空斑分析仪在抗体形成细胞检测中的应用

免疫相关细胞因子在不同程度慢性苯中毒中的表达及意义

葛根素注射液对不同物种红细胞体外溶血性比较

海南树仔菜亚慢性毒性研究

体内外替代方法在急性毒性评价中的研究进展

化学物眼刺激性测试策略研究进展

致作者

外源化学物的表观遗传毒性及其安全性评价

二硫化碳对大鼠组织的影响及维生素E的干预作用

三氯乙酸染毒对肝L-02细胞的增殖作用及对DNA甲基化水平的影响

氯化镉处理人肝癌SMMC-7721细胞株某些生化指标的变化

单氰胺对大鼠肾细胞抗氧化功能的影响

二噁英对成骨肉瘤细胞中胰岛素样生长因子2基因表达的作用

铅镉联合暴露对大鼠肾脏功能损伤的研究

甲基苯丙胺对大鼠心肌细胞线粒体结构及Cytochrome C、Caspase-3、Caspase-9 mRNA的影响

异丙基硫杂蒽酮(ITX)的大鼠致癌性实验研究

氧化锌对人Ⅱ型肺泡上皮细胞IL-6、IL-8和TNF-α表达的影响

乙酸铅诱发的HK-2细胞氧化应激与凋亡

体外应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选大气细颗粒物(PM2.5)污染相关基因

纳米四氧化三铁、碳纳米管对A549细胞的毒性研究

淫羊藿总黄酮对丝裂霉素致小鼠骨髓细胞突变的保护作用

多廿醇毒性作用研究

镉对小鼠脾脏淋巴细胞转化率的影响及锌的保护作用

硫酸镍诱导小鼠卵巢细胞P53、P16、Bcl-2蛋白表达的研究

比久和赤霉素GA_3对蚕豆根尖细胞的诱变作用

不同生姜提取物对小鼠畸形的影响

Es-生物炔丙菊酯原药对大鼠的致畸作用

大鼠卵巢颗粒细胞培养及分泌产物测定条件的研究

PC12细胞中氧化还原因子-1对过氧化氢和谷氨酸损伤的不同反应

慢性砷暴露对小鼠肾组织DNA损伤及牛磺酸和维生素C的保护作用

盐酸苯环壬酯及其异构体抗NMDA神经毒性保护作用的比较

醋酸铜诱导Hela细胞的凋亡

百草枯中毒患者脏器损害与血清细胞因子变化的研究

扶正解毒颗粒对硫酸镍致大鼠生殖细胞损伤的拮抗作用

复方轮叶党参对小鼠乙醇性肝损伤的预防作用

高氯酸盐的急性毒性和遗传毒性研究

碳纳米管的生物安全性研究进展

硫酸铟急性毒性和致突变作用研究

新药安全性评价中的毒代动力学研究

药物毒理学研究新技术与新方法

创新药物非临床安全性研究应注意的若干问题

我国药物非临床安全性研究与评价面临的机遇与挑战

代谢物的遗传毒性评价与ICH会议的动向

遗传毒理学的若干进展

药物遗传毒性研究技术指导原则的修订

药物临床前生殖毒性研究进展

细胞生物学的研究方法范文第5篇

从前述国内外相关领域的研究进展，我们可以看到，干细胞由于其活细胞及动态的特点，使其具有化学药品无法完成的“神奇疗效”，从单一靶点的药物转变为多靶点的系统治疗，为未来医学发展的方向打开了一扇新的大门，也为许多身患难治性疾病的患者与家庭带来了新生的希望。但同时，正是由于干细胞的活细胞特性，也使得干细胞的临床转化成为常规医疗实践的途径更具有挑战性，细胞来源的个体差异，细胞传代的表观遗传学变化，免疫原性，冻存和复苏等都会成为影响其治疗效果的可能因素。据此，干细胞治疗临床转化的关键在于构建与其活细胞特性相匹配的管理法规与临床转化路径，而不是套用现行的化学药品的法规框架与商业模式。首先界定干细胞治疗临床转化的边界。界定的关键要素主要包括干细胞的伦理考量，某类干细胞的科学研究进展，与之配套的管理法规及转化路径。以目前干细胞研究和临床前实验开展的最充分的间质干细胞（mesen－chymal　stem　cell，MSC）为例，应先行明确MSC在我国进行临床转化研究的合法性地位，进一步根据伦理，科学，法规及商业等方面制定细则来评价和规范其转化路径，推动干细胞治疗的分层、有序管理，成熟一个转化一个。间质干细胞管理规范与质量标准制定通道，管理法规与质量标准：包括有硬件设备、软性流程、人员资质，并设立第三方的检测机构。最低门槛：根据供者筛查方面的最新能达到的检测手段，及实际实施的可能性，保证安全、有效及可控的前提，制定准入门槛性标准。这是必须要达到的，具有强制性，应由卫生行政主管部门制定。行业标准：为行业学会（如中国细胞生物学会干细胞生物学分会等）根据目前国际发展趋势，建立的质量标准与管理规范，相对于现行门槛标准要高，为提升我国在该领域国际竞争力而进行的质量管理标准升级而进行的前期准备与探索。行业规范与标准不具有强制性，但代表着该领域未来管理法规与质量标准升级、改进与完善的方向。产业标准：为提升中国干细胞产业在国际中的竞争力，中国干细胞产业中的龙头企业或产业联盟（如国家干细胞与再生医学产业技术创新战略联盟等）须根据国际干细胞的研究进展，结合临床应用经验与数据积累，产业国际发展趋势而制定更高的质量标准与管理规范。产业标准应着眼于未来的国际竞争而先人一步的进行研究探索，既为干细胞产业联盟的首要责任，亦是其永续经营的必由之路。通过在龙头企业内运行通过，输出为行业标准，再经过行业协会内更多企业的运行，最终形成法定标准的升级换代。这也是我国目前制定中国干细胞产业化管理规范与质量标准的产出通道，即龙头企业标准—行业协会标准—通行的国家标准。

间质干细胞临床转化的产业链及关键质控点

间质干细胞临床转化产业链包括了细胞的采集，细胞的处理与制备，细胞的运输，细胞的应用。干细胞从源头采集到终点临床治疗中整个产业链中，要达到安全、有效及可控的干细胞疗法，需要从如下几个环节进行质量控制。（1）干细胞采集—来源可控：间质干细胞广泛地存在于人体的许多组织中，如骨髓、新生儿的脐带组织、羊膜、胎盘、牙髓、脂肪等。供体的筛查主要包括以下几个方面：伦理考量：用途告知；采集方法及采集方法可能并行的风险告知（如是骨髓来源的，采集骨髓可能会引起伤口感染等等告知）；供者可能的隐私尊重与保密条款（因需要进行传染病，遗传病，家族史，血清病毒学等筛查，供者相关信息的保存以供追溯细胞质量等等）；供者知情同意等等；科学方面：当前的科学研究最新进展所掌握的手段，对供者筛查包括：家族史、传染病、血清病毒学、遗传病、外源性感染等等，以及每项检测指标排除的最佳时间窗；管理法规：公共健康安全法案（FDA：Public　Health　Safety　Act，Sec－tion　361；良好组织规范（Current　Good　Tissue　Practice，CGTP）；行业认证：AABB、ISO9000、FACT等等。（2）干细胞制备：主要是控制干细胞的纯度（细胞的特异表面标记），安全（细菌、病毒等检测），潜能（多向分化潜能），免疫原性，冻存与复苏。参照规范FDA的公共安全法案和良好组织规范。制备处理操作流程的标准化：SOP从采集入库—处理制备—冻存—复苏—发放—运输—医院（临床应用），及供追溯查阅的文件，至少保存10年可供追溯；传代代数的标准化；培养液的标准化，并且界定是否有动物来源的培养液，如果用小牛血清，则其来源必须为没有发生疯牛病的国家等等；无血清培养体系的建立；细胞的鉴定检测，表面标记，活细胞的数量，纯度，及功能鉴定。ISCT对MSCs的鉴定标准；冻存、保存及复苏：操作流程的固化；运输（GDP：Good　Distribution　Practice）：温度，时间（最大限度保持干细胞。生物活性运输的时间及患者治疗最佳时间窗），运输液，包装器皿（冷冻袋）等。（3）干细胞的临床应用：到达临床的干细胞需要配备表明干细胞“身份”的质量说明书，供临床医生检测该份干细胞是否合格的清单；临床应用，标准临床诊疗路径，包括：①适合应用间质干细胞治疗适应症的纳入／排除标准；②患者知情；③疗效判定指标／治疗无效的指标；④发生副反应的处理预案（抢救设备，抢救流程等）；⑤临床应用数据的收集整理，并向干细胞制备机构沟通反馈。4．基于干细胞治疗的上述活细胞特性，干细胞治疗的商业化流通完全不同于现行制药工业的商业流通模式。化学药品成份的稳定性，使得其采取的是现行的从生产地发往世界各地的商业物流模式。但间质干细胞由于其活细胞的特点，其鉴定“身份”特质的细胞表面标记会受到组织来源、分离方法、制备方法、培养液、冻存方法、复苏方法、保存温度、运输温度、传代数及复苏后时间等变量的影响。故而需要一个完全不同于现代制药工业的商业物流模式，最大程度地保证干细胞发挥疗效的活细胞的生物学活性。

结语