细胞生物学研究方向
细胞生物学研究方向范文第1篇
[关键词]外泌体；干细胞；生物学功能；组织修复；应用前景
干细胞是一类具有多向分化潜能并能够进行持续自我更新的未分化细胞，可分化为体内多种类型的成体细胞。在干细胞的研究中，干细胞培养基的上清液中可提取多种生长因子和细胞因子，因此，普遍的观点认为干细胞主要通过旁分泌途径分泌多种细胞因子参与组织修复。而Timmers等[1]研究发现，对含有骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）的条件培养液进行分馏研究中，只有含有100～200nm囊泡培养液可对缺血再灌注损伤的小鼠模型进行心脏保护。目前研究者认为，通过分泌某些物质来实现修复作用是干细胞发挥生物学功能的重要方式[2]。起初，Johnstone等在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程中，发现网织红细胞能分泌一种双层膜小囊泡，最初这种囊泡结构被命名为外泌体（exosome）。长期以来，这种囊性小泡被认为是细胞分泌的一些无作用碎片[3]。但越来越多的研究表明，外泌体是一种富含多种生物活性因子的亚细胞双层膜囊泡，并且能够发挥多种生物学作用。近年来干细胞来源的外泌体研究成为热点，对干细胞外泌体的生物学功能，以及其在临床当中的应用进行了较多研究探索。本文拟就干细胞外泌体的研究现状进行综述，重点阐述干细胞外泌体发挥生物学效应的物质基础及机制，以及干细胞外泌体在临床应用中的研究进展。
1干细胞外泌体简介
1.1外泌体与微泡：两者均属于细胞外囊泡[4]（Extracellularvesicles，EV），是细胞在静息或应激状态下产生的异质性膜分泌体系[5]，包括直径在100～1000nm的微泡(microvesicle,MV)和30～100nm的外泌体(exosome)。两者在多数情况下被混淆，其主要区别在于形成方式不同。微泡通常比外泌体大，是质膜直接以“出芽”的方式向细胞外突出形成的大囊泡[6]。外泌体则是经由内涵体（endosome）途径生成[3]。细胞内晚期内涵体的界膜多处凹陷，向内出芽形成管腔状囊泡，从而转变为具有动态亚细胞结构的多囊泡体(multi-vesiclebodys，MVBs)。MVBs是真核细胞重要的蛋白运输与分拣中心，当MVBs与胞膜融合后，其内的管腔状囊泡凹陷以内出芽方式形成颗粒状小囊泡，并释放入细胞外环境，即外泌体。参与细胞信息传递的外囊泡即为外泌体和微泡，在已发表的文献中多将两者合称为“EV”。
1.2干细胞外泌体：干细胞来源的外泌体是干细胞在静息或缺氧应激、辐照、氧化损伤等刺激下分泌产生的细胞外囊泡[7]，可通过选择性的转运蛋白质、mRNA、microRNA来充当干细胞与已分化细胞的信号分子[2]。现有研究已证明间充质干细胞外泌体在减少心肌梗死面积[8]，减轻肢体缺血[9]，增进伤口愈合[10-11]，改善移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease，GVHD）[12]，减少肾损伤[13]，促进肝再生[14]，减轻视网膜损伤[15]，以及最近改善软骨[16]和骨再生[17]等方面具有重要作用。外泌体是细胞间信息交流的重要载体,且外泌体特性与其来源的细胞有关，因此干细胞外泌体的功能与其干细胞的功能密切相关。Quesemberry[18]等人提出外泌体扮演着干细胞生物学连续体模型的关键角色，则可推测外泌体在促血管形成、促进细胞新生及免疫调节方面有重要作用。
2干细胞外泌体的生物学功能
外泌体表面富含胆固醇、甘油二脂、鞘脂、磷脂等脂类物质，这些脂类分子不仅可以维持外泌体的形态，还可以作为信号分子参与多种生物学过程[19]。且外泌体内载有蛋白质、mRNA、microRNA等生物学信息，在细胞微环境中发挥重要作用[20]。研究发现，外泌体不仅存在于体内活细胞，在体外培养的细胞中也能检测到外泌体，如脂肪细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞等[21]。随着研究进展，外泌体已可从人体血液、尿液、羊水及腹水等多种体液中分离出[22]。这说明外泌体不仅是细胞正常生理病理的代谢产物，且分泌外泌体是一种普遍的细胞功能[23]。Lai等[24]研究发现，骨髓MSC培养基上清液中发挥损伤修复作用的物质可能是一种直径在50～100nm的磷脂膜包裹的小囊泡。后续研究发现此种囊泡可参与机体免疫调节、血管新生、细胞增殖及凋亡等环节，从而发挥组织修复作用。
2.1免疫调节：Zou等[25]研究发现，间充质干细胞外泌体可降低巨噬细胞趋化蛋白CX3CL1及肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）的表达，同时上调白细胞介素-10（IL-10），降低局部炎症反应，起到免疫调节的作用。Kordelas等[12]研究发现，干细胞外泌体可降低难治性抗移植物抗宿主病（therapy-refractorygraft-versus-hostdisease，GVHD）患者体内的IL-1β、TNF-α及γ-干扰素水平，调节机体免疫，促进受损组织修复。
2.2促血管新生：有研究证明[26-27]来自内皮祖细胞的外泌体携带有促血管生成的miRNA，如miR-126、miR-296和let-7，其能够在静止的内皮细胞中通过水平转移RNA激活血管形成。当MSC外泌体与血管内皮细胞体外共混培养条件下，MSC外泌体可被血管内皮细胞摄取并内化，经realtime-PCR检测发现,培养后的血管内皮细胞同样高表达MSC外泌体携带的促血管化miRNA[28]。脂质间充质干细胞(adiposemesenchymalstemcells，ASCs)可促进血管内皮的增生，并且血小板衍生的生长因子可促进ASCs释放增强血管生长潜力的外泌体[29]。人脐带MSCs分泌的外泌体与体外培养的人脐静脉内皮细胞共培养时，内皮细胞成管状结构更加明显，内皮细胞迁移更加良好[30]。
2.3促进细胞增殖、抑制细胞凋亡：在甘油诱导的严重联合免疫缺陷（severecombinedimmunedeficiency,SCID）鼠急性肾损伤模型中发现骨髓MSC分泌的外泌体具有保护肾功能的作用[31]，其修复能力与其母体细胞无显著性差异。其通过上调bcl-xl、bcl2、birc8等抗凋亡基因，下调Casp1、Casp8、LTA等促凋亡基因，同时活化细胞外信号调节激酶，以促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，从而发挥组织修复作用。此外，外泌体可通过向靶细胞转运RNA，如mRNA、miRNA等，诱导靶细胞合成一些因子，如肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)、血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)等，激活信号通路,调控靶细胞的细胞周期活动，最终促进其增殖[13]。外泌体由干细胞释放后可通过弥散、内吞、受体介导等方式进入靶细胞，转运特异性蛋白、脂质、mRNA和miRNA等生物活性物质，从而发挥多种生物学功能。而且根据当前国内外研究，干细胞外泌体促进血管新生的机制与其向靶细胞转运具有促血管生成作用的miRNA有着密切的联系。
3外泌体的作用方式
外泌体内含有多种生长因子及细胞因子，如血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、干细胞因子（StemCellFactors，SCF)，并且几乎所有的外泌体都含有生理活性的脂质成分，如1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-l-phosphate，S1P)、神经酰胺-1-磷酸(ceramide-1-phosphate，C1P)。外泌体进入靶细胞后，这些旁分泌因子可与细胞相互作用，如S1P、C1P可抑制细胞凋亡和刺激血管新生[32]。一系列研究表明,外泌体发挥作用的方式主要有3种：①通过直接识别靶细胞表面的信号分子，与受体结合传递细胞间信息[33]；②外泌体与靶细胞融合后，释放其内容物，实现信息转运[34-36]；③通过释放胞内的信号分子作用于靶细胞表面受体，完成信息转运[37-38]。通过识别靶细胞膜表面的信号分子转运信息，常见于免疫系统中。第二种作用方式是Valadi等[34]在实验中观察到鼠肥大细胞分泌的外泌体可被人肥大细胞所摄取而发现的，外泌体所携带的mRNA进入细胞后会被翻译成蛋白质。这是研究者首次发现基于基因水平的细胞间的信息转运。这种信息转运广泛存在于机体中，例脂肪细胞的脂肪合成[36],间充质干细胞的心肌保护作用[24]等。外泌体中的细胞因子，如血管内皮生长因子,纤维母细胞生长因子等，通过第三种作用方式与内皮细胞表面受体相结合起到促进血管形成的作用[37]。因而干细胞来源的外泌体促血管新生、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等作用，可能与多种机制共同作用有关，具体作用方式尚待进一步探究。
4干细胞外泌体的生物学优势及临床应用前景
目前干细胞广泛应用于组织修复及缺血性疾病治疗领域。与干细胞比较，作为其旁分泌物的干细胞外泌体具有更稳定的生物特性，有研究表明[39]外泌体在-80℃保存2年仍能保持其生物学功能。在体内实验中外泌体的脂质双分子膜结构能防止其内容物降解，保持内部蛋白及遗传物质的活性[40]。而且与干细胞分泌的可溶性细胞因子不同，外泌体可直接进入靶细胞，通过向靶细胞转运特异性蛋白、脂质及RNA等生物活性物质，来诱导靶细胞的增殖、迁移、血管化等生物学变化，从而改变局部微环境，稳定而持久地发挥多种生物学功能。这种“载体式”信号转导方式使外泌体具备更高更稳定的信号转导效率，且在生物体内不会被细胞外介质稀释[41]。
4.1干细胞外泌体对创面的修复作用：研究发现，MSC外泌体可通过促进血管生成发挥组织修复作用。Zhang等[11]研究发现，MSC外泌体可促进热刺激后皮肤细胞的增殖，并抑制其凋亡，在大鼠皮肤烧伤模型中，外泌体能促进烧伤部位的再上皮化，加快伤口愈合。人脐带MSC外泌体所递送的Wnt4基因信号是皮肤伤口愈合所需的。在体外实验中[10],成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞的增殖及迁移依赖于MSC外泌体的剂量。同样，成纤维细胞分泌的I型、III型胶原、弹性蛋白量的提高和血管内皮细胞管状形成率的提高也与外泌体的浓度增加有关。
4.2干细胞外泌体在缺血性疾病中的治疗作用：研究发现，人CD34+造血干细胞分泌的外泌体具有促血管形成的作用，从而改善缺血性疾病[40]。MSC外泌体可通过转运microRNA改善心肌缺血，对心脏功能产生保护作用[24]。在缺血性脑病中，可同样观察到间充质干细胞可通过外泌体的转运，使具有保护作用的miR-133b进入到周围神经元，改善疾病状况[42]。在小鼠后肢缺血模型中，HUGW[9]等发现MSC外泌体可促进小鼠血管生成和血液灌注来减轻严重的后肢缺血。干细胞分泌的外泌体具有促血管生成的作用，这在缺血性疾病的治疗中具有非常重要的意义。
4.3干细胞外泌体对器官急性损伤治疗方面的临床应用前景：相关研究已证实来源于胚胎干细胞（embryonicstemcells,ESCs）和某些成体干细胞的外泌体可以改变受体细胞的生理功能，从而保护急性损伤的心脏和肾脏。Lai等[24]观察到纯化的MSC外泌体能够减少小鼠心脏的梗死面积。Arslan等[43]也研究证明，MSC外泌体可通过增加ATP水平，降低氧化应激，激活P13K/Akt通路增强心肌生存能力及防止缺血再灌注损伤后的心肌不良重塑。MSCs生成的外泌体在治疗急性心肌梗死方面有着巨大的潜力。上皮细胞分泌的外泌体，其内的激活转录因子3(activatingtranscriptionfactor3，ATF3)RNA可减弱缺血再灌注损伤时的促炎基因CMP-1的转录，减轻炎症反应，起到肾保护作用[44]。在急性肾损伤的干细胞治疗实验中，MSC外泌体可通过旁分泌途径提高肾脏的恢复[45]。
4.4干细胞外泌体对骨及软骨损伤治疗方面的临床应用前景：Strassburg等[46]研究发现，外泌体与髓核细胞的相互作用可能是MSC促进退化的椎间盘结构恢复的一种机制。最近研究报道[16]，在免疫大鼠骨软骨缺损模型中人MSC外泌体可促进软骨再生。在该研究中，外泌体加速了新组织的填充，II型胶原的合成，并增强硫酸化糖胺聚糖（sulphatedglycosaminoglycan，s-GAG）的基质合成。到12周末，观察到MSC外泌体处理的大鼠其软骨和软骨下骨完全恢复，特征包括表面具有良好且规则的透明软骨，并与相邻软骨完全结合。TAOSC[47]等研究发现，过渡表达miR-140-5p滑膜间充质干细胞（miR-140-5p-overexpressingsynovialmesenchymalstemcells，SMSC-140s）的外泌体在骨关节炎大鼠模型中可有效治疗骨关节炎（Osteoarthritis，OA）。MSC外泌体因其抗纤维化、抗凋亡、免疫调节功能，在骨关节炎、风湿性关节炎等疾病中的治疗作用将有着巨大的临床应用前景[48]。
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4.5干细胞外泌体作为药物载体的临床应用前景：理想的药物载体需能逃避宿主免疫系统，被靶细胞特异性吸收。具有足够时长的循环半衰期，无毒性，且能加载多种不同的药物。因此外泌体作为一种天然的脂质体，被认为较目前广泛使用的人工合成脂质体具有更多优势。将外泌体用于药物递送的另一个重要考虑因素是外泌体的细胞来源，例如，临床试验的树突状细胞（dendriticcell,DC）外泌体已被纯化，并负载抗原肽来刺激T细胞增殖，将其作为一个潜在的抗肿瘤或感染性疾病的疫苗[49]。然而，DC外泌体是具有免疫原性的，并且将它们作为药物递送载体时需要使用免疫相容性外泌体。因此，用于药物递送的外泌体，其理想的细胞来源是可产生丰富的非免疫原性外泌体的细胞。人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞(humanembryonicstemcell-derivedmesenchymalstemcells,hESC-MSCs)为外泌体运用于理想的药物载体提供了来源[50]。MSC有一个十分独特的功能，可以调节参与适应性免疫和固有免疫的多种细胞，从而产生免疫抑制和免疫调节的效应[51]。MSC在同种异体宿主中耐受性良好，因此推测它们的分泌的外泌体也可具有良好的耐受性。与此假设一致，在小鼠动物模型研究中发现，用来源于人胚胎干细胞的外泌体静脉注射治疗具有免疫能力的小鼠可达到一定的治疗效果，且未用免疫抑制药物抑制小鼠的免疫系统[24,52]。MSC外泌体被证明是普遍耐受性良好，并且所具有免疫原性及毒性的风险最小[12,16]。这种以同种异体或自体方式发挥免疫抑制和调节作用的能力可以增强MSC外泌体即药物递送载体的寿命和其装载药物的生物利用度。因此可想而知，静脉输注MSC外泌体可以耐受性良好，便于更精确剂量的装载药物。
5结语与展望
细胞生物学研究方向范文第2篇
【关键词】肿瘤干细胞；筛选；耐药性
【中图分类号】R739.4 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）03-0141-02
1结肠癌干细胞的筛选
1.1筛选方法
肿瘤干细胞是肿瘤研究中的一大难题，其中最困难的是如何从肿瘤组织中分离出肿瘤干细胞。目前，分离和纯化肿瘤干细胞的方法主要有三种，但各有各的优缺点。一是无血清培养形成细胞球，亦是富集肿瘤干细胞的方荧；二是荧光染料法，但此种方法有一定的局限性；三是表面标志分子筛选法，又可分为流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法。这两种方法均利用肿瘤干细胞表面特异的标志分子与带有标志的抗体结合，从而使其与非肿瘤干细胞分离。
1.2筛选过程
采用干细胞球培养法筛选结肠癌干细胞时，要取生长状态良好的结肠癌细胞制成单细胞悬液并计数，取单个细胞放入肿瘤干细胞培养基中悬浮培养，每天晃动几次，防止细胞贴壁，待细胞球变大，亮度降低，结构变松散时用酶消化传代，取亲本及传代后细胞放入孔板中培养后，计算成球率。取生长状态良好的结肠癌干细胞球置于含有牛血清的中培养，观察细胞贴壁分化情况进行磁珠分选。磁珠分选后，采用流式细胞术检测分选后细胞中含有表面抗原分子细胞含量。为了检测结肠癌细胞形成的癌细胞克隆球的抗原分子蛋白表达情况，接种后第6天克隆细胞球被采用免疫荧光检测。将分选后的细胞分别接种于无血清培养基中，检测标记细胞的体外增殖能力。
1.3标志分子的功能及其在结肠癌干细胞筛选中的应用
筛选结肠癌干细胞的标志分子大部分根据其表达水平而定，但标志分子在肿瘤干细胞中的功能尚不清楚。尽管结肠癌一直被认为起源于肿瘤干细胞，但因缺乏可靠的生物学标记，直到最近这个假说才得以证实。表面抗原分子是第一个用于筛选结肠癌干细胞的表面标志分子，是维持肿瘤干细胞干性的重要分子。以表面抗原分子筛选所得到的结肠癌细胞经鉴定具有体内成瘤能力，然而有研究发现表面抗原分子和转移后的结肠癌细胞都具有体内成瘤能力，这使利用表面抗原分子筛选结肠癌干细胞令人质疑。因此，利用表面抗原分子来筛选肿瘤干细胞需进一步的验证。跨膜糖蛋白是另一个在肿瘤中运用广泛的筛选肿瘤干细胞的标志分子，也是第一个应用于判断肿瘤放射治疗疗效的干细胞标志分子根据跨膜糖蛋白的表达来判断肿瘤组织中肿瘤干细胞的密度，从而就能达到预测放射治疗的效果。研究发现肿瘤干细胞标志分子在诱导与维持细胞与基质之间的链接起着重要作用，同时也能增强肿瘤细胞在新环境的增殖能力。
2结肠癌干细胞的耐药性研究
2.1引起肿瘤干细胞产生耐药性的原因
恶性肿瘤的治疗方法主要有手术、化疗和放疗。其中化疗是最主要的治疗手段。但由于肿瘤干细胞可以产生耐药性，使得肿瘤可以对多种化疗药物产生耐受，最终导致化疗失败。导致肿瘤干细胞产生耐药性的主要原因有以下几点。一是高表达转运蛋白可以参与多种跨膜转运过程，将糖类、脂类、氨基酸及细胞毒性药物等大分子物质逆浓度梯度转运到细胞外；二是肿瘤干细胞通常很少处于细胞生长的增殖期，当其收到一定刺激时会重新进入有丝分裂期，造成肿瘤复发；三是临床上常用的化疗药物的作用机制之一是诱导细胞凋亡，而肿瘤干细胞内细胞凋亡受到抑制，对这类化疗药物不敏感；另外，化疗药物的作用靶点通常是DNA，而肿瘤干细胞内的多种酶可以促进DNA的损坏修复功能，使肿瘤干细胞无法收到这类药物的作用。
2.2肿瘤干细胞的耐药性实验及结论
可靠的肿瘤干细胞筛选将为肿瘤干细胞干性及分化信号通路调节机制研究奠定基础。经实验证实，结癌干细胞对传统化学治疗药物比一般的肿瘤细胞具有更强的耐受性。处于静止期或慢周期状态是成体干细胞的一个重要特点，研究表明肿瘤干细胞也大多处于静止状态，并参与了肿瘤的耐药、复发和转移。细胞周期检测发现干细胞中处于静止期的细胞要明显多于亲本细胞，一方面表明肿瘤干细胞与成体干细胞的相似性，另一方面也进一步解释了肿瘤干细胞对细胞周期特异性药物的耐药性。实验结果还显示了结肠癌干细胞富集与耐药的相关性。干细胞球细胞对不同药物的耐药性均明显高于亲本细胞，其中细胞处于静止期使细胞对药物周期特异性的耐药，而表达升高使细胞对不同种药物均耐受，表现出多药耐药性。结肠癌治疗多年后复发及远处转移都与残留的结肠癌干细胞有关。因此，肿瘤干细胞靶向治疗具有重要的研究前景。
2.3肿瘤干细胞的靶向治疗
目前肿瘤干细胞靶向治疗的原理就是利用其表面表达的标志分子开展的。通过组织芯片发现这种标志分子抗原在不同临床病理分期的结肠癌中均有表达。这表明碳末端抗原表位可作为潜在的分子靶点，而化疗药物就可特异性结合到这个靶点，继而靶向治疗结肠癌。在临床结肠癌的治疗方面，一些研究者发现细胞膜表面表达的膜蛋白可以作为直接靶向目标或间接介导凋亡诱导复合物的内部分化而杀死肿瘤细胞。目前结肠干细胞的表面标志仍然不明确，因此，是否存在其他亚群的结肠癌干细胞仍是科学研究的方向。随着研究的进一步深入，可能会出现更多结肠癌干细胞表面标记，使得更为精细和科学的结肠癌干细胞的分离、鉴定成为可能。
3结语
干细胞标志分子在结肠癌干细胞研究中的作用是不容置疑的，但是目前对肿瘤干细胞生物学特性的功能仍不清楚。由于结肠癌干细胞迄今缺乏高特异性生物标记，生物学特性复杂，要开展靶向治疗还有待探索。对结肠癌干细胞的深入研究，有可能会从全新的角度去阐明结肠癌发生、发展的机制，从而为结肠癌的诊断、治疗提供一种新的思路，具有无限的发展空间和深远的科学意义。
参考文献
[1]汪春良，夏良，孙玉岭，结肠癌患者术前外周静脉血CD133阳性细胞数量与血清癌胚抗原及肿瘤进展的关系，实用医学杂志，2008；
细胞生物学研究方向范文第3篇
[关键词] 生物活性因子；骨髓间充质干细胞；基因修饰
[中图分类号] R457.7 [文献标识码]A [文章编号] 2095-0616（2014）13-48-04
[Abstract] Bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） are non-hematopoieticstem cells existing in bone marrow matrix that have multi-directional differentiation potential and they have become the hotspot of domestic and overseas medical research.Bioactive factors distribute all over the tissues of human body and have important regulatory effect on the BMSCs.This paper illustrates the implication，cell characteristics，multiple bioactive factors combination，tissue treatment and other aspects in detail.
[Key words] Bioactive factor；Bone marrow mesenchymal stem cells；Gene modification
骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一类自我更新能力强、多向分化潜能、可塑性高的干细胞。在特殊的诱导下，能分化为多种细胞，包括心肌细胞、骨细胞、神经细胞、血管内皮细胞等等。目前，转基因技术的优势已发挥重大的作用，已有多种不同的生物活性因子被导入到BMSCs中，并持续在BMSCs中表达，进而诱导和刺激BMSCs的增殖、分化及成熟。
1 BMSCs的来源及其分子表达
目前研究最多、最为深入的就是骨髓来源的间充质干细胞，它是构成骨髓造血微环境的重要部分，具有支持和造血调控的作用。也有人称其为骨髓基质细胞，是因为它们来自骨髓的支持结构，起到维持造血干细胞存活及其功能的作用。随着对这种细胞研究的逐渐深入，发现其在多向分化、自我更新、免疫调节、分泌细胞因子功能等方面具有独特的性质，故目前学术界一般将其称BMSCs。
一般认为，BMSCs能表达CD34、CD106、CD124、CD105、CD146、CD90、CD13、CD44、CD54、CD29、CD73、CD120a、CD166、SH2、SH3、SH4、STRO-1特异性细胞表面抗原以及ALCAM/CD44黏附分子，但一般不表达类似造血干细胞表面的相关分子[1]。
2 BMSCs的特性
在目前研究的干细胞中，应用较为广泛的就是BMSCs。它具有其他干细胞所没有的的特性：（1）具有多向分化潜能，在适当条件下可被诱导分化为心肌细胞、内皮细胞及平滑肌细胞等多种细胞；（2）从骨髓中容易分离，在适宜的培养环境中能快速贴壁生长，容易纯化，可成倍扩增，且具有遗传稳定性，在传代后仍能保持原来的细胞特性，不会发生转化；（3）可分泌多种细胞因子，这些细胞因子能改善重要器官的功能；（4）具有低免疫源性，这种特性的存在降低了BMSCs移植后所产生的免疫排斥反应和相关并发症的发生；（5）易导入外源基因，并可以持续地表达该基因，可以提高BMSCs移植的存活率，促血管生长等作用。这些特性决定BMSCs适合作为一种种子细胞进行有效的移植治疗[2]。
3 修饰BMSCs的生物活性因子
生物活性因子主要有转录因子、营养及生长因子、信号分子及其通路等。下面将介绍近年来主要应用于实验方面的生物活性因子。
3.1 转录因子
GATA-4作为一种特定的蛋白转录因子，在细胞的分化、生长和存活的过程中起着至关重要的作用。它可以促进血管生成、增加细胞存活和分化，减少心肌细胞的凋亡。李红霞等[3]探讨了GATA-4过表达对大鼠骨髓间充质干细胞保护心肌细胞的影响，试验结果表明GATA-4转染后，增加了BMSCs转化为心肌样细胞，并对心肌梗死后的重构产生很大的作用。
SOX9基因是软骨类细胞分化的一个必需转录因子，它除了是维持软骨表型的主要调控基因之外，还可以增加Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因的表达水平。许云等[4]探讨了SOX9基因修饰骨髓间充质干细胞并诱导其向髓核样细胞分化的实验研究，选用SOX9、Ⅱ型胶原及Aggrecan作为BMSC向髓核样细胞分化的特征指标，结果表明过表达SOX9基因特定环境中能促进骨、关节及软骨细胞的再分化。
低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1α）是一种重要的核转录因子，目前被认为是最具有前途的治疗基因之一。它具有促进血管新生、上调下游靶基因、改善组织的血液供应等作用。王君等[5]探讨了大鼠低氧诱导因子-1α基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究，发现转染后BMSCs具有向神经干细胞分化的潜能，并可维持该细胞的特点。更有研究发现，不同类型的HIF-1α基因诱导骨髓间充质干细胞均能向心肌细胞分化，为两者的联合应用提供了实验证据[8]。
还有很多相关的细胞转录因子，如Tbx-5和NKX2-5等均可诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化[6]；Mef2c基因参与介导骨骼肌、心肌以及平滑肌细胞的分化过程；Cbfa-1基因则可促使骨髓干细胞向成骨细胞分化[7]。
3.2 营养因子及生长因子
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种高度特异性细胞因子，具有促进缺血心肌的毛细血管的再生，恢复血管内皮的正常组织结构及其生理功能，最终起到改善器官组织微循环的作用。杨锴等[8]研究探讨了VEGF基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗对大鼠心肌梗死组织血管再生以及心功能的影响，可明显改善缺血心肌的心功能，促进血管再生和心肌细胞的形成。
碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）是调控增殖及定向分化的首选生长因子之一，也是一种重要的营养因子，具有刺激新生血管形成，促进神经细胞生长和纤维再生的作用，同时对软骨细胞的分化和增殖也具有生物学效应，是目前发现的最强的促细胞生长因子。缪黄泰等[9]研究了碱性成纤维细胞生长因子体外诱导犬骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，还得出了bFGF体外诱导BMSCs向心肌细胞分化的最适浓度（10?/L），为今后的研究提供了证据。
胶质细胞源性神经营养因子（glialcell line-derivedneurotrophic factor，GDNF）是一种强效的神经营养因子，除对神经元具有保护作用外，对中枢神经系统神经元的分化、发育、生长和存活具有重要意义。杜杰等[10]探讨了GDNF基因修饰的BMSCs向神经元样细胞的分化及神经营养因子的表达，试验结果提示GDNF具有诱导BMSCs向神经元样细胞分化的作用。
脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神经营养因子家族中的重要成员，可以促进感觉神经元谱系分化，维持运动神经元的存活，对神经细胞的生长发育及修复有重要的保护作用。于泽洋等[11]研究发现脑源性神经营养因子转染BMSCs可以有效表达该蛋白，并且使BMSCs向成骨细胞的分化进程加快，对骨折后损伤部位的组织修复等具有重要的作用，为临床疾病提供了新的方向。
血管生成素-1（Angiopoietin-1）是一类重要的血管生长因子，可以提高血管内皮细胞的存活力，对细胞凋亡有着抑制作用，可使血管通透性降低，减少血管的萎缩和退化。侯淑红等[12]研究了Ang-1基因修饰骨髓间质干细胞移植后心肌梗死大鼠的心功能变化，不仅稳定了Ang-1基因的表达，提高了BMSCs存活率，而且对新生血管起到了很好的调控作用，改善了梗死心肌的功能。
血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是一种细胞生长因子，具有调节水钠代谢及血管张力的生理作用，可刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞的增生，还可诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞[13]。张蕾等[14]研究还发现血管紧张素Ⅱ联合生长因子诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化。
胰岛素样生长因子1（Insulin-like growthfactor 1）是软骨发育过程中一种强有力的合成代谢刺激生长因子，能够促进软骨细胞的增殖和成熟，延缓基质的降解，抑制软骨细胞的凋亡。邬波等[15]探讨了胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化及基质金属蛋白酶表达的影响，结果显示胰岛素样生长因子1能够促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，还可保护软骨胶原纤维的稳定性。
转化生长因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）是属于TGF-β超家族的一组重要的生长因子，对细胞的增殖、分化、黏附和凋亡具有调控作用。目前研究较多的是TGF-β1和TGF-β3。吕洋等[16]采用了转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞进行定向诱导，得到其定向可分化为心肌样细胞，且分化的细胞还具有心肌细胞的特性。而王体俊等[17]研究了转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞，发现TGF-β3能增加骨形态发生蛋白的诱导成骨量，从而促进BMSCs的分化。
骨形态发生蛋白2（Bonemorphogenetic protein2）是一种多功能的细胞生长因子，在骨形态发生蛋白家族中是骨诱导性能最强的，对骨形成有调控作用。段智霞等[18]通过实验证明骨形成蛋白2活性多肽在体外能诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，且这种诱导效应存在明显的剂量依赖关系。
还有一些营养因子如神经营养因子（NT）、神经生长因子（NGF）、表皮生长因子（EGF），均能促使BMSCs向神经元样细胞分化[19-21]；肝细胞生长因子（HGF）体外诱导BMSCs可向肝细胞分化[22]；血小板源性生长因子（PDGF）则可促使BMSCs向心肌细胞和平滑肌细胞分化。
3.3 信号分子及信号通路
Wnt信号通路是一条高度保守的信号传导通路。Wnt家族成员通过自分泌或旁分泌作用与细胞膜上的受体相结合，激活细胞内的信号通路，调节靶基因的表达，在细胞增殖及迁移，心脏及神经系统发育，干细胞分化及增殖等多种生理过程和肿瘤的发生和转移等病理过程中起着至关重要的调节作用。近年来已有研究证实Wnt信号通路参与骨髓间充质干细胞的定向分化及增殖的过程[23]。Wnt基因家族中研究最多的当属Wnt3a，Wnt5a和Wnt7a这三种蛋白信号因子。Wnt3a主要促进神经干细胞以及成骨细胞的分化，且可使体外培养的BMSCs大量增殖[24]。沈亚莉等[25]的研究证明了通过腺病毒实现了外源性wnt5a基因转染bMSCs，促进了BMSCs的增殖。而Wnt7a对促进BMSCs向神经元样细胞分化有重要作用[26]。
Notch信号通路是一条保守而重要的通路。Notch通路几乎涉及到了所有的细胞，对细胞的分化、增殖及凋亡起到了重要的调控作用。Notch信号通路还参与BMSCs分化的调节过程。柳柯等[27]研究了Notch信号通路在骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中的动态表达特征，用实验方法检测到在Notch信号通路中关键因子的表达作用，为干细胞的临床未来治疗提供了基础。
Hedgehog信号通路是一条保守而高效的通路，对各种组织器官的形态功能有着调节作用。Hedgehog家族蛋白是一种分泌型信号蛋白，主要包括Shh、Ihh和Dhh。其中的Shh和Ihh，不仅能调控成骨细胞的分化，还能促进BMSCs的增殖分化[28]。Hedgehog信号通路被抑制剂激活后还能抑制BMSCs向脂肪细胞分化[29]。目前尚有许多关于Hedgehog信号通路及相关分子机制研究的不确定性，还需要我们进一步去证实。
4 存在问题及展望
骨髓间充质干细胞是重要的组织工程学细胞，具有广阔的应用前景，它可以诱导分化为多种细胞，如心肌细胞、成骨细胞、神经细胞等。而基因对骨髓间充质干细胞的修饰作用，不仅可以增强其定向分化的能力，还能促进细胞的增殖，调控细胞的凋亡。目前骨髓间充质干细胞的研究已经取得了很多的成绩，但还有很多问题需要我们去解决，比如如何提高被修饰后的骨髓间充质干细胞的机体存活率；某些基因对骨髓间充质干细胞的作用机制尚不是很清楚，应用于人体当中会不会有负性作用，还有待进一步的验证。
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细胞生物学研究方向范文第4篇
1生物学特性分析与比较
自1995年Grane提出骨组织工程这一概念以来,经过十几年的研究,骨组织工程在种子细胞、支架材料以及细胞-支架材料复合体等方面的研究取得了很大进展,为临床骨缺损修复重建打下了良好的基础。其中种子细胞的研究与应用主要集中在以下几种间充质干细胞:骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪干细胞、肌源性干细胞等。
MSC是一类具有多向分化潜能的干细胞,可来源于骨髓、脂肪、胎盘、脐血、脐静脉内皮下层、外周血及肌肉等各种组织中。在特定条件下可向骨、软骨、心肌、脂肪、血管内皮等间叶组织细胞转化。来源不同的MSCs,虽在生物学特性方面均表现干细胞特性,但相互之间仍有一定差异。目前对于MSCs的生物学特性研究主要集中在以下几个方面:
1.1分离培养
1.1.1骨髓间充质干细胞(BMSCs):具有来源广泛、相对容易获取、扩增表型稳定,无医学伦理学争议及过大的骨异常增殖趋势等优点,被公认为是骨组织工程最为常用的种子细胞。目前分离BMSCs的常用方法有5种:即全骨髓法、密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪法及免疫磁珠法。全骨髓法即根据干细胞贴壁特性,定期换液弃去不贴壁细胞,从而达到纯化细胞的目的;密度梯度离心法是根据BMSCs与其他细胞的密度不同而采用percoll分离液将其分离出来;贴壁筛选法则是根据BMSCs具有在塑料组织培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离;流式细胞仪分选法则是根据BMSC体积小、相对缺少颗粒的特性对它进行分选;而免疫磁珠法则根据细胞表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选,用抗体包被磁珠,获得相对纯化的细胞。其中由于经过流式或磁珠分选后的干细胞会出现增殖缓慢等一些问题,加之耗费较大和技术的难度,两者应用并不广泛。目前最为常用分离BMSCs的方法主要是全骨髓法和密度梯度离心法,由于单独应用时存在获取细胞纯度不够及数量较少等缺陷,近年有人尝试用密度梯度离心结合贴壁筛选法分离提取骨髓间充质干细胞,效果比较理想[1]。
BMSCs一般原代培养接种3～4h后开始贴壁,24h大量贴壁;2～3天见部分集落形成,大多数细胞有胞浆突起;7～10天集落迅速增多,以梭形细胞为主,胞浆丰富、核大、核染色质细、核仁明显,细胞呈平行排列或漩涡状生长;14天左右融合达80%～90%,可进行传代。传代细胞呈均匀分布生长,细胞以梭形为主。BMSC的生长潜伏适应期为1～2天,3天后进入对数生长期,6～7天后进入生长平台期。BMSC倍增时间为30～50h,细胞每传一代,细胞数约增长2倍。不同物种的BMSCs特性不尽相同,不同培养基、血清浓度、细胞接种密度、换液时间、酶消化时间、培养基pH值都会影响其生长[2]。
1.1.2脐血间充质干细胞(UC-MSCs):脐带血是脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞(HSCs)和MSCs。与骨髓相比,脐带血有更充足的来源;脐血的免疫原性较弱,能耐受更大程度上的HLA配型不符;移植物抗宿主病(GVHB)发生率较低;其间充质干细胞更为原始,扩增能力更强等优点,故脐血干细胞可作为一种新的替代细胞来源,用于各系统疾病的细胞移植及基因治疗,它的作用也越来越受到重视[3]。
目前用于UC-MSCs分离的方法同BMSCs基本相同,但UC-MSCs的分离培养和筛选与脐血样本的选择、培养基的差异以及分离、筛选过程中操作技术等多种因素有关,也无统一标准。不同培养基、不同批次的血清、不同的pH值、不同接植密度都会影响细胞的生长。一般原代培养的脐带血间充质干细胞多在培养24～48h后贴壁,1周左右成梭形,并成克隆性生长,4～5周可达80%以上的融合。原代培养的干细胞中可见多核,形态扁平的破骨样细胞混杂,一般传代至第3代时即可获得纯度较高且形态均一的长梭形的间充质干细胞[3]。
1.1.3脂肪间充质干细胞(ADMSCs):是指从脂肪组织抽吸物中获得的一种成纤维细胞形态的细胞群,具有取材容易,获得率高, 自我更新能力与多向分化潜能类似BMSCs等优势。原代培养细胞呈平行排列,漩涡样生长,细胞多为梭形、多角形等,胞浆和核仁丰富。传代培养中,经过多次传代(10～20 代),细胞的增殖速度无明显减慢,衰老和死亡细胞所占比例也很少。这表明脂肪组织蕴含丰富的干细胞,且细胞体外扩增能力很强,易于传代培养[4]。由于ADMSCs来源广泛、取材容易且分离提取方法相对简单,形态及功能均类似BMSCs,近年来日益受到研究者的重视。
目前对于ADMSCs的提取主要采用的是酶消化法,即在无菌条件下取脂肪组织,经I型胶原酶消化后离心收集沉淀再经200目细胞筛过滤获取目的细胞。同其他MSCs一样,不同组织来源的脂肪、不同实验室不同操作人员的操作技术、不同培养基、不同批次的血清、不同接种密度等也都会影响ADMSCs的生长。
1.1.4肌源性干细胞(MDSCs):骨骼肌中含有丰富的细胞成分,从原始的干细胞到终末分化的成熟细胞。近年来在骨骼肌中发现了一群被称为MDSCs的细胞群体。研究表明,它是和被证实的骨骼肌中含有的能够自我更新并向肌、骨以及脂肪组织细胞等分化的肌卫星细胞是完全不同的一类细胞群,可能是一群未向任何方向分化的原始干细胞。与BMSCs相比,其具有来源相当丰富、易于分离、易于诱导成骨等优点,使之得到越来越多研究者的重视,并在骨组织工程研究中被广泛应用。目前对于MDSCs的分离,基本上同ADMSCs,同样是在无菌条件下取特定组织块,然后经酶消化后离心、过滤。具体操作流程与细节,由于实验室条件、操作者水平等差异,而略有差异。而纯化技术主要有三种:冷冻法、Hoechst/FACS法以及Pre-plate法。其中冷冻法与Hoechst/FACS法并不常用,而Pre-plate是利用细胞贴壁速度慢的特点,经反复贴壁培养而除去非干细胞以达到分离纯化MDSCs的目的,因此有学者称之为差速贴壁法。该方法在近年MDSCs的分离纯化上逐渐得到认可并被广泛使用[5]。原代培养MDSCs的较其他细胞贴壁较慢,一般在分离后5～6h贴壁,其体积较小,呈球形,折光性强,48h后完全贴壁,并开始增生,细胞逐渐变成椭圆形或纺锤形,进一步相互融合有规律地逐渐平行排列,7～10天时,细胞90%融合,常规消化传代同其他干细胞[6]。
1.2细胞分化功能:MSCs是一类具有多向分化潜能的干细胞,在特定的诱导实验条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞等。由于来源不同,分化表型亦有一定差异。而骨组织工程常用种子干细胞在分化功能上有着统一的共性―极易诱导分化为成骨细胞。应用常规诱导培养剂:VitaminC、Beta-甘油磷酸钠以及地塞米松,均可将它们成功诱导分化为成骨细胞。另外,随着近年来对于细胞因子研究的深入,越来越多的细胞因子亦被发现具有明显的促进干细胞成骨的特性,如骨形态蛋白BMP、碱性成纤维细胞因子bFGF、转移生长因子-Beta等[7-8]。
1.3 间充质干细胞的免疫表型及鉴定:目前,认为MSCs是一个异质细胞群, 因此至今仍未发现其特异性抗原表型,且不同来源的间充质干细胞免疫表型也有不同。BMSCs表达的抗原标记主要有: SH2、SH3、CD29 、CD44、CD71、CD9、CD105、CDl06、CDl20a、CDl24、HLA-I等,而不表达其他造血细胞系的表面标记CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD117 等细胞表面抗原[9-10]。这些抗原均具有间质细胞特征,无特异性。而UCB-MSC表达的主要分子包括:①粘附分子,CD54、CD51、CD44、CD13等;②整合素家族成员,CD49b、CD49e、CD29等;③其他,CD90(Thy1)、SH2(CD105)、HLA-ABC、ASMA、SH3(CD166,ALCAM)、SH4(CD73)等。但不表达造血细胞的表面标志,如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8、CD2、CD15、CD16、CD19、CD24、CD33、CD 38、CD133、CD135(Flt-3)、CD117(c-kit)、Glycophorin A等,也不表达与人白细胞抗原(HLA)识别有关的共刺激分子B7-1、B7-2及主要组织相容性复合物II类分子如HLA-DR抗原等[11]。ADMSCs在免疫表型方面则较以上两者又有一定差异。苏海鹏等[12]总结了体外培养的ADMSCs表达的蛋白:①粘附分子:可表达CD9、CD29、CD49d、CD54、CD102、CD106、CD166,但不表达CD56、CD50、CD11b、CD18、CD62;②分子受体:可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体;③细胞外基质蛋白和糖蛋白:ADAS细胞能生成I和II型胶原、骨桥蛋白、ostenectin、Thy-1 (CD90) 和MUC-18 (CD146);④肌蛋白:能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白;⑤造血细胞标记:不表达造血细胞标志物CD14、CD31 或CD45;⑥补体调节蛋白: 确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白;⑦组织相容性抗原: 表达类组织相容性蛋白HLA-ABC,而不表达类蛋白HLA-DR。目前,MDSCs由于取材、分离提纯方法及培养环境的不同,获得的MDSCs表面标志物也不尽相同。但Mastrogiacomo等[13]对比了MDSCs和BMSCs表面标志物,结果显示两者有十分相似的表达,证明两者是性质相似的MSCs,其特点为:①干细胞标志Sca-1(+)、CD34 (+/-);②早期成肌系标志Desmin、Bcl-2、C-met表达不一致;③造血干细胞标志c-kit(-)、CD45(-),其他CD10、CD13、CD56等标志物表达不一。
2在骨组织工程中的应用
鉴于上述间充质干细胞的生物学特性及各自优势,它们在骨组织工程研究中的应用越来越广泛,并在基础实验与临床应用研究两个环节都取得了可喜的成果。目前,伴随基因工程的发展,它们在骨组织工程研究中的作用得到了更大的体现和发挥。
2.1 基础研究:由于大块骨缺损修复面临的血管化难题目前还没能得到很好解决,利用骨组织工程技术仍无法满足临床上形式各异的骨缺损修复需要,因而大量的基础研究正在为解决血管化难题,尽快实现由基础研究向临床过渡而努力。Jian Zhou等[14]将兔的BMSCs与源于MSC的内皮细胞联合培养于多孔beta-磷酸三钙支架材料上构建血管化组织工程骨用以修复兔的大尺寸骨缺损。结果显示出良好的成骨和血管化效果,不仅证明该方法修复动物大块骨缺损行之有效,也是临床修复大块骨缺损很有潜力的方案。而Lei Cui等[15]利用脂肪来源的间充质干细胞复合珊瑚支架,成功修复了犬临界尺寸(20mm×20mm)颅盖骨的缺损。实验在12周与24周时分别对植入犬颅盖骨缺损处的细胞-珊瑚支架复合材料组和单纯植入珊瑚材料组做三位CT及放射图谱分析等检测,结果显示实验组较对照组骨修复体积提高了3倍多,前者基本能够达到良好修复颅盖骨缺损的要求。另外,经Rebekka等[16]研究发现UC-MSCs同BMSCs不仅在生物学特性方面有很多相似特性,与三维胶原支架复合培养实验中,经组织学、免疫组织化学、免疫印迹分析和实时定量RT-PCR等检测分析表明,UC-MSCs与BMSCs均展现了有效骨折愈合的所有特性。最后,虽然目前MDSCs在骨组织工程中的应用不如其他细胞广泛,但近年来呈现明显增长态势。Kyung等[17]对大鼠MDSCs复合壳聚糖支架于体内成骨向分化实验研究表明,凝胶壳聚糖支架是MDSCs粘附和增殖的理想基板,此外,细胞联合壳聚糖支架实验组植入体内后不光免疫反应较单纯植入支架组低很多以外,骨形成也被证实只存在于带MDSCs与骨诱导因子的凝胶壳聚糖支架材料中。
2.2 临床应用:尽管目前骨组织工程技术还没有广泛应用于临床,但近年来国内外报道的骨缺损修复临床成功病例已越来越多。其中骨髓间充质干细胞应用最早且最为常见,脂肪间充质干细胞近年来也有报道,而脐血间充质干细胞及肌源性干细胞则鲜有报道,目前还主要集中在细胞自身研究及动物基础研究阶段。Marcacci等[18]将人的BMSCs复合多孔羟基磷灰石陶瓷生物材料构建与临床患者骨缺损尺寸大小相当的组织工程骨,然后利用外科手段植入临床骨缺损处。手术早期患者无大的并发症及其他症状,手术部位亦无明显疼痛、肿胀及感染等现象,移植物在植入5～7个月时与宿主骨完全融合,跟踪调查6～7年骨结合良好且未发生迟发型骨折。最终结果证实利用骨组织工程技术能够成功修复大尺寸临床长骨骨缺损。Lendeckel等[19]则利用纤维蛋白凝胶包裹自体ADMSCs,然后应用两块可吸收板将其固定于患者颅骨缺损处,术后疗程顺利且3个月后经CT扫描观察到新骨几乎形成完整颅骨。
3 小结
间充质干细胞以其特有的优势成为组织工程理想的种子细胞,并在骨组织工程基础与应用研究中被广泛应用。但骨组织工程要想真正实现血管化进而达到临床化,对于间充质干细胞的研究仍有很长的一段路要走。MSC来源广泛但表型却有很大不同,是否是同种细胞,性质又有何特异性差别,目前尚不清楚;不同来源的MSC分化功能也有差异,如何准确控制其向某一特定方向转化也无统一标准;另外,MSC的分离提纯方法虽然很多,但同时也表明目前仍没有一种最为理想的方法来获取大量纯化的MSC。种种问题都需要我们在研究中不断地去发现、分析及解决。只有这样,MSC的价值才能在骨组织工程研究中得到最大程度的体现,真正造福于人类。
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细胞生物学研究方向范文第5篇
【关键词】急性白血病 诱导分化 靶向治疗
中图分类号：R733.71文献标识码：B文章编号：1005-0515（2011）3-105-02
急性白血病（AL）是造血系统常见的恶性克隆增生性疾病，主要包括急性髓细胞白血病（AML）和急性淋巴细胞白血病（ALL）。其主要的发生机制是造血细胞的分化能力障碍，不能向终末分化，而其增殖能力仍然保留，从而导致大量白血病细胞的出现。传统的治疗方法包括放疗、化疗和造血干细胞移植。但传统的放、化疗对人体正常细胞的毒副作用让病人痛苦不堪，而造血干细胞移植由于供体有限以及移植后高发的排斥反应，使得移植难以广泛推广。因此，迫切需要研究新的、更加安全有效的药物。国内外专家学者在近几十年的研究中，提出了定向诱导分化及靶向治疗的新方法，现已逐渐成为AL患者的重要治疗手段[1]。
1 定向诱导分化治疗
上世纪五六十年代，有学者提出了诱导分化治疗恶性肿瘤的理论，即在诱导分化剂的作用下肿瘤细胞能向终末方向分化，甚至完全变为正常细胞。
1986年，我国首先报道了全反式维甲酸（ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）获得成功，患者完全缓解（CR）率达到72%[2]。这一报道开创了临床诱导分化治疗急性白血病的先河。不久之后，三氧化二砷（As2O3）诱导APL患者获得完全缓解的研究显示，其主要的作用机制也是能够诱导白血病细胞的分化和凋亡[3]。
在成功案例的启发下，经过国内外学者的努力探究，至今全球已发现和合成各类诱导分化剂80余种，并有30多种获准应用于临床[4]。已证实不同的诱导分化剂能诱导白血病细胞分化为粒系、单核系和红系的成熟细胞。例如：外源性Wnt5a能诱导K562细胞分化成单核细胞；TPA能抑制HL-60细胞增殖，且诱导其分化为成熟的单核细胞和粒细胞等[5]。另外还有一些化学合成小分子物质诱导白血病细胞分化的报道。
到现阶段为止，对AML的定向诱导分化研究已相对成熟，但ALL的诱导分化研究相对落后，很多研究还局限于体外实验。诱导分化治疗由于针对性强，杀伤力小，治疗效果优于传统化疗。但其对于老年AL及复发或难治型AL效果尚不明确，联合用药效果的不可预计和耐药株的出现都是今后更进一步研究的方向。
2 靶向治疗
近二十年来，随着人类对白血病细胞分子生物学及遗传学特性的进一步深入研究，与AL发病相关的一系列基因、抗原、受体及细胞内关键因子被逐渐认识。针对这些靶点的新型药物的研发也开始成为探寻白血病治疗新方法的热点。这类新型药物被成为分子靶向治疗药物（molecular targeted therapeutic drugs, MTTD），而运用该类药物的治疗新手段就是靶向治疗。
2.1 AML的靶向治疗
成年AML治疗在过去十年已经取得了显著疗效，CR率约60%，5年总生存率可达43%[6]。但是AML较高的复发率和治疗相关并发症，特别是老年患者的不良反应仍然是AML治疗的瓶颈。MTTD的研发及应用或许能够攻克这一难题。
目前以吉妥珠单抗奥加米星(Gemtuzumab ozogamicin,GO. Mylatarg,美罗他格)为代表的MTTD已应用于治疗60岁以上复发和难治性AML患者[7]。GO是一种人源化抗CD33单克隆抗体，AML细胞表面有大量的CD33抗原表达。GO作用于靶细胞膜CD33的涎酸结合部位，形成复合物，进入细胞内释放毒素，引起靶细胞DNA双链断裂，从而达到杀伤肿瘤细胞的作用。另一种抗CD52单克隆抗体Alemtuzumab(Campath-1H＇阿伦单抗)，能与靶细胞表面CD52受体结合，激活补体、抗体依赖的细胞毒作用等途径杀伤靶细胞。但临床试验表明，该药对AL的疗效不完全肯定[8]。
FLT3即FMS样酪氨酸激酶3，在70%以上的AML细胞上有表达。因此，FLT3酪氨酸激酶抑制剂(TKI)具有靶向治疗的作用。常见的TKI有：CEP-701（1estaurtinib, 来妥替尼），能特异的抑制FLT3活性而不抑制其它III型受体酪氨酸激酶，具有较高的选择性，临床研究证明它可以使FLT3突变的AML病人得到缓解[9]。SU5416（semaxani, 司马沙尼）SU11248（sunitinib,舒尼替尼）目前也已进入临床Ⅰ、Ⅱ期实验阶段。但FLT3分子的细微突变会导致抑制剂丧失识别能力，因此针对不同的FLT3突变体研发不同的抑制剂，才能保证其特异性，达到靶向治疗效果。
2.2 ALL的靶向治疗
儿童ALL是目前疗效最好、治愈率最高的恶性肿瘤之一。CR率可达95％以上，5年以上无病生存率可达80％～90％，治愈率达80％。成人及复发的ALL疗效则不尽如人意，患者生存率低于40％[10]。近20年，随着人们对ALL细胞内关键因子、基因蛋白组学的深入了解，一系列针对ALL的MTI'D的研发，使ALL的治疗进入一个新时代。
ALL细胞表达CD19、CD22、CD33、CD52等多种特异性抗原，这些都能成为分子靶向治疗的靶点。因此单克隆抗体对于ALL的治疗具有很大的优越性，具有特异性强、不良反应小等特点。
TKI的代表药物伊马替尼在白血病靶向治疗种具有里程碑意义，该药对费城染色体阳性（PH＋）的CML有较好疗效，同时对PH＋ALL的CR率也高达95％。与化疗药合用，对成人及复发或难治的PH＋ALL的CR率可达96％[11]。但由于广泛的临床应用使得对伊马替尼耐药或不耐受的病例逐渐增多，因此新TKI药物的研发正在加快进行。
至今，AL的靶向治疗已经进入一个快速更新的时代，其优越性也逐渐显露。但单一靶点的分子靶向药物作用仍有限。
3 小结
AL的治疗已经从传统化疗发展到定向诱导分化和靶向治疗，更多的临床患者从中受益，获得了更好的生存状态。尽管目前定向诱导分化剂和分子靶向治疗药物临床肯定疗效还不多见，但随着分子生物学技术的进一步发展，对AL发病机制的进一步认识，必将会有更多更有效的药物进入临床。而不同药物之间的联合应用，以及多靶点作用药物的研发，仍将是今后基础研究和新药研发的方向。相信通过全世界研究人员的共同努力，必将能造福更多的AL患者。
参考文献
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