生物克隆技术范文第1篇

日前，不同于华大基因的克隆猪主要用于测试新药和宠物饲养，博雅控股提出了克隆牛肉商业化的构想。博雅控股董事长许晓椿认为，动物克隆从技术、市场和资金方面都已具备商业化的能力，天津“克隆工厂”的投产将会填补国内优质牛肉短缺的市场空白。

不过，《财经国家周刊》记者了解到，博雅的牛肉克隆项目目前尚未取得农业部的正式许可，商业化的前景不明。更为重要的是，虽然克隆技术已经诞生近20年，但其安全性一直受到质疑，即便商业化，克隆动物的肉会得到市场的认可吗？消费者敢吃克隆肉吗？

“已经倒下了许多先烈”

“总有人会做先驱，这次不成功就会是先烈，没有一项科学实验能否达到100%成功”，许晓椿向《财经国家周刊》记者坦陈，自己要做第一个吃螃蟹的人。

2015年末，天津滨海新区与北大博雅控股集团（原博雅干细胞集团）旗下博雅基因签署协议，在天津滨海新区建设全球最大的“克隆工厂”（Cloning Factory）。此次落户于天津的“克隆工厂”项目，第一期投资2亿元人民币，总投资30亿元。建成后，将拥有全球最大的动物克隆实验室流水线、最高标准的克隆动物中心、生物多样性基因资源库以及科教展示中心。

所谓克隆技术是指干细胞技术的姊妹技术，又称无性繁殖技术，指不需要经过雌雄就可以大规模繁殖相同后代的技术。在我国，转基因植物很多，目前转基因食用油在我国已经大规模商业化。

据了解，博雅控股天津克隆工厂的运营分为两个阶段，第一阶段计划每年生产10万头肉牛，第二阶段年产量升至100万头。预计2016年启动生产，总投资5亿至10亿美元。除肉牛外，基地还将克隆其他工具类动物和濒危物种动物。

“之所以选择肉牛，是因为中国的饮食结构在逐渐发生改变，对牛肉的需求大量增加，过去几年，牛肉消费量以两位数增长，预计未来5-10年，中国牛肉的消费量会翻一倍，存在1000万头牛的缺口。”许晓椿举例说，以2014年为例，中国肉牛屠宰量为690万吨，人均消费5.25公斤，供应量仅为世界平均水平的一半。

另据农业部预测，2020年我国肉食需求总量将达到1亿吨，但肉类总产量只能达到9000万吨左右，大约有1000万吨的供求缺口要靠进口来弥补。

因此，在中国肉类协会会长李水龙看来，在推动我国肉类产量的稳步增长的同时，还要使得产品结构更趋合理，在2020年9000万吨的大目标下，协调好猪肉和其他肉类的比例关系，猪肉、禽肉、牛肉、羊肉、杂畜肉的产量可分别为5490万吨、1890万吨、810万吨、630万吨和180万吨，占比分别为61：21：9：7：2。 中国肉类消费不断增加，优质牛肉的缺口越来越大，这是企业推动克隆肉上餐桌的商业动机。

在许晓椿看来，想要让中国的低端畜牧业迅速升级为现代畜牧业，克隆技术是最好的途径。2014年，中国进口了29万吨高端牛肉，只占总消费额690万吨的5%不到，光靠进口远远满足不了人们对优质牛肉的需求，但通过克隆技术，企业就可以在中国本土养殖最优质的肉牛，生产最优质的牛肉。

“一个技术的成功有三大要素：技术的成熟性，合适的市场和充足的资本，没有信心我们就不会做。”许晓椿告诉记者，任何一个技术，太早商业化就会成为先烈，太晚又会丧失机会，博雅的前面已经倒下了许多先烈，发展到现阶段，动物克隆技术已经具备了产业化的条件。

安全考验还不够

从1996年7月一只名叫“多利”的克隆绵羊诞生，至今近20年过去了，克隆依然是一个有道德争议的技术。不过，在植物领域，克隆技术已经广泛用于各类经济类作物并形成了相当的规模，包括草莓、香蕉、木瓜、桉树等规模化种植均大规模使用植物克隆技术（又名植物组织培养）。比如，全球领先的植物种业技术公司孟山都市值400多亿美元。

“华大基因有个公司叫华大方舟，此前发明一种技术叫手工克隆技术，由于比较复杂，尚没有实现商业化。”华大基因研究院执行院长徐讯接受《财经国家周刊》记者采访时表示，欧美国家利用克隆技术生产肉制品并不是很多，他们喜欢用胚胎移植技术，在胚胎早期进行切割，这样就可以产生更多的胚胎，但是直接用体细胞克隆的比较少，因为体细胞克隆的效率比较低，成本较高，现在克隆技术商业化应用的最大障碍就是效率和成本。 动物克隆技术应用的时间短，从食品角度说，没有30至50年时间很难验证克隆肉的安全性。

在博雅控股之前，华大基因在克隆猪项目上已经走在了前列，但是截至目前并没有实现商业化。对此，徐讯解释称，目前的动物克隆商业化的一大阻碍还有社会接受度的问题，其实体细胞克隆并不会改变自然界的原有结构，只不过是改变了传统的动物繁衍方式，克隆技术的安全性还是可以得到保证的，这个技术在自然界已经应用广泛，动物克隆的商业化还需要进一步探索。

许晓椿认为，从发展阶段上来看，虽然当前的动物克隆技术类似于上世纪80年代植物克隆技术的商业应用水平，但动物克隆技术具有更高的技术壁垒，同时商业应用范围和规模更为广泛。

不过，中国肉类协会会长李水龙则表达了不同观点。他告诉本刊记者，所有的食品都应该做致癌、致畸、致变的“三致试验”，需要反复的试验，一般要30到50年的时间才能验证，现在动物克隆技术才多长时间？所以很多人质疑这个技术的安全性，这个技术在欧洲并没有被推广，因为大家还是有疑问的。

“在植物克隆方面，基本上已经实现大规模商业化，世界上已有孟山都、先正达等规模化、产业化工厂。”中投顾问研究总监郭凡礼接受本刊记者采访时表示，在克隆动物方面，欧美国家的态度比较慎重，克隆农畜在欧洲受到禁止，而美国政府一开始也反对克隆动物商业化，到2007年政策开始松动，尽管现在没有法律规定禁止出售克隆动物食品，但是食品生产行业一直秉承“自愿性禁止”原则。

商业化的未了局

不同于博雅的高调自信，市场上则表现出了更多的猜测和怀疑。第一只克隆羊“多利”只活了6年，它因患有严重的进行性肺炎，而被“安乐死”。多利的早夭被质疑为因早衰引发，这也引起了科学界对克隆动物健康与寿命是否正常的争论。

2015年9月份，欧洲议会以克隆的后代比常规繁衍的动物有更多的健康问题为由，决定禁止克隆牲畜和销售克隆牲畜，禁止从其他国家进口克隆产品。

此外，国际食品信息委员会的一项调查显示，22%的美国消费者对克隆动物持支持态度，而反对者则高达50%。很多网站上对于公众是否接受克隆肉的调查问卷比比皆是，消费者各抒己见，但是没看到明确性的调查结果，也很少权威性的调查报告。

生物克隆技术范文第2篇

克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后，再被植入动物子宫中使动物怀孕，便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。

克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功，被人们称为“历史性的事件，科学的创举”。有人甚至认为，克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。

克隆技术可以用来生产“克隆人”，可以用来“复制”人，因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说，克隆技术是悲是喜，是祸是福？唯物辩证法认为，世界上的任何事物都是矛盾的统一体，都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人，那会给人类社会带来什么呢？即使是用于“复制”普通的人，也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产，将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究，就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术，是一把双刃剑，剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动，避免“克隆人”的出现，使克隆技术造福于人类社会。

克隆技术太有趣了，我要是会克隆呢（陷入想象）。

假如我会克隆，我会克隆出小草大树，让荒芜的地方一片生机。

假如我会克隆，我会克隆出一些孩子，让那些没有子女的父母摆脱无子之痛。

假如我会克隆，我会克隆出一对翅膀，在宇宙中翱翔，探索宇宙的奥秘。

假如我会克隆，我要克隆出一些镭，供居里夫人研究，再为人类做贡献。

假如我会克隆，我会克隆出一些人体器官，让身患重病的人，残疾的人重获健康，享受本该享受的一切。

假如我会克隆，我会克隆出一（大）片乌云，让干旱地区“重获新生”

生物克隆技术范文第3篇

关键词：克隆人 克隆 生殖技术 伦理

克隆的产生代表着生殖技术的突破，标志着科学技术的进步，人们以现代医学手段来代替人类自然生殖中的一个过程乃至整个过程，使生殖从自然过程走向了必然过程。克隆又称无性生殖，是细胞的完全复制，产生大量相同基因。克隆技术可以广泛应用于农作物的种植和培育，同时动物的克隆也取得了巨大的成功，但是对人类的克隆，科学家还不敢进行实践，因为克隆人牵扯各个方面的问题，包括政治、法律、伦理等。

一、关于克隆人存在的争议

今天，人们如果想创造另一个自己，也许通过克隆技术就可以实现。但是对于人类的克隆有着众多的争议。

（一）支持克隆人的基本观点

1.克隆对于不孕症及失去孩子的家庭是一种福音

患有不孕症的夫妻，可将克隆作为自己要孩子的方法，这样便可以拥有和自己有血缘关系的孩子，自此就可以享受完整家庭给自己带来的快乐；如果一个家庭的孩子得了不治之症，利用克隆技术将快死的孩子复制，这样这对夫妻就可以有一个同样的孩子在自己的身边。克隆能为不完整的家庭带来福音，使人们燃起对生活的希望之光。

2.克隆具有控制优生的功能，复制各领域的优秀人才

克隆是细胞的完全复制，与正常的生育不同，克隆的亲子遗传物质相同，所以有人提出，利用克隆技术来复制优秀人才，比如，克隆爱因斯坦发展科学、克隆姚明为国家的篮球事业做出更大的贡献。一些人认为对优秀人才的复制是推动社会发展的有效手段，优秀人才的复制可以产生更多的优秀人才，让他们为社会做出更大的贡献。

3.克隆人具有医学价值，提供器官移植的供体

现代医学中有很多的难题，如需要进行器官移植的病人，供体不足是其中最大的问题，很多病人在等待供体的过程中病情不断地恶化，甚至离世。如果利用克隆作为器官移植的有效来源，那么很多即将消失的生命可以被挽救。现代医学中供体的数量不足的问题突出，克隆技术可以有效解决供体数量少这一问题。

（二）反对克隆人的观点

1.克隆人违背自然法则

克隆是细胞的复制，与男女正常结合所产生的后代不同，克隆人与被克隆者的关系到底是怎么样的根本无法界定，是违背自然规律的。克隆人违背了人的自然本质，让人变成了“物”，损害了人类的独特性。克隆的结果是人变成了可以在生产线上大量生产的物品，个体的价值和尊严是因为每个人都是不同于其他人的，具有鲜明的独特性，而人类的复制等于失掉人的独特性，是一种不人道的做法。

2.克隆技术存在较大的风险

在以往的动物克隆上，克隆出来的动物大多存在着严重缺陷，且寿命短，一系列的动物试验以及克隆牲畜的实践证明：即使所有的基因都存在，其中大部分基因并不像正常基因自然接通或切断。机能失常的基因可能导致胚胎畸形，它们暗中隐藏微小的缺陷，后来会以残疾或慢性病的方式显现出来。克隆动物时，只有六分之一的胚胎细胞能发育成熟到出生，许多动物在出生后，由于畸形会在短时间内死去。对人的克隆必定也会出现同样的问题，所以不能贸然进行人类的克隆实验。

3.人伦关系混乱

人伦关系的混乱表现在两个方面，第一，克隆人与原型之间的关系难界定。克隆人是通过体细胞进行的，是无性生殖产生的基因型完全相同的个体，省掉了男女结合的环节，由单一的由男性或女性直接复制后代，出现了克隆人到底是原型的同代还是后代的伦理矛盾。第二，由于克隆可以选择性别，人们会根据传统的观点来选择男女，人工选择与自然不同，会造成男女性别比例的失调，冲击传统的一夫一妻制度。

4.克隆技术可能被滥用

克隆技术如果被滥用，值得我们注意的有两个方面的问题。一方面，克隆什么样的人值得商榷，有些人利用克隆技术来克隆希特勒，试想如果希特勒“复活”大开杀戒，在科技发展的今天必定会造成全人类的灾难。另一方面，克隆人类成功以后，克隆技术的发展会很迅速，如果技术被滥用，每个人都有可能被复制，造成社会秩序的混乱，如果有人带有特殊的目的进行克隆，使克隆人成为自己的工具，则会出现很多棘手的社会问题，比如，对罪犯的辨认难度加大。

5.克隆人破坏了人类基因的多样性

众所周知，基因的多样性是人类存在的理由，但是克隆拥有选择优秀基因的便利，这就等于承认基因有优劣之分，激发优生思潮。优生过后，原本多样性的人类基因库将无法保证。在动物的克隆实验中，克隆牛本来是想促进优良品种的培育，但是由于基因单一，导致了疯牛病的产生。人类的存在依托基因的多样性，基因单一性可选择会导致物种的退化，产生一些意想不到的疾病，甚至微小病毒就能导致人的死亡。

二、关于克隆人的思考

第一，克隆人的心理健康状况会对人类产生影响

如果克隆人在现实生活中大量“生产”，那么人们很有可能会用一些手段来区分人类和克隆人，甚至戴着有色眼镜来看待克隆人，这样一来可能会产生基因歧视，基因歧视比种族歧视还要可怕，更容易造成社会矛盾与分裂。克隆人在成长的过程中遭到不公正对待，由此产生一系列的心理问题，可能会危害人类的安全。

第二，问题的实质是违背人的自然本质

人类的世代繁衍都是通过自然的手段来完成的，通过男女正常结合来繁衍下一代，克隆使人在流水线上生产，违背自然的本质，损害人的独特性。个体的价值和尊严是由于每个个体都是独特的，在一个生命出现的过程中，如果是由一个人通过技术力量，把一个个体生命安放于一个不存在的人的身上，剥夺了这个人的自由，失掉了个体原本的独特性，这是对人的尊严的践踏和价值的否定。

三、对于克隆人的建议

首先，要倡导世界范围内严禁克隆人实验，达成严禁克隆人类胚胎的协议，从政治、伦理、法律等方面来探讨克隆人可能会引发的社会及家庭问题，慎重使用克隆技术。各国应实施严格的法律监督，使克隆技术的不利因素降至最低，让其充分发挥优势作用。国际社会完善相关国际法，同时各国根据国际法制定相应法律，并建立各级监控机构。

其次，提高科技工作者的科学道德水平和社会责任感。科学的社会应用虽不取决于科学家，但却要通过科学家之手，这是一个重要的责任环节。科学家要有高度的科学责任感和社会责任感，要为全人类的发展着想，在进行研究的过程中要牢记自己的社会责任，为人类的发展负责。

最后，加强伦理学研究和宣传，建立现代人的伦理规范和社会规范，将克隆技术规范在合理范围之内。对于克隆人，伦理学学者要进行一个明确范围的界定，并且协助法律建设起一套关于使用克隆技术的法律法规，对克隆技术的使用控制在一个合理范围之内，防止克隆技术的滥用。

参考文献：

[1]夏青. 伦理视域下的基因技术问题研究[D].渤海大学，2013.

[2]刘承俊. 现代医疗技术的伦理道德思考[D].成都理工大学，2010.

[3]吕成楷. 现代生物科技的伦理困境及其对策探究[D].中共广东省委党校，2011.

生物克隆技术范文第4篇

内容提要: 克隆人是现代生命科技发展带给人类社会的一个挑战。从技术应用的目的上看，克隆可以被划分为治疗性克隆与生殖性克隆。在有关克隆人是否具有犯罪性以及刑法应否禁止克隆人的问题上，存在着“肯定论”与“否定论”两种截然相反的观点。站在刑法的视域下，生殖性克隆人是一种完全不同于治疗性克隆人的行为，它无法摆脱伦理上的非难性，已经超出了社会可承受的范围，其本质是一种反社会的犯罪行为，对于这种行为，刑法应当将其入罪化，并配设适宜的刑事责任。当前我国现行立法中已经对生殖性克隆人作出了明令禁止，但却未就从事生殖性克隆人研究的刑事责任作出任何规定，也未出台有关克隆技术规范的专门立法。为此，需要制定一部《克隆技术管理法》，并修改现行刑法的规定，增设“非法从事生殖性人体克隆研究罪”。

生命科学技术的飞速发展是人类当代社会发展的最显著特征之一。伴随着以基因技术为核心的现代生命科学技术的快速进步，一系列伦理与法律问题相继而生。克隆人的法律规范问题便是其中之一。作为一个有可能对人类社会未来发展产生根本性影响的重大伦理及法律问题，克隆人问题的提出给当代立法带来了严峻挑战。从学理上探讨如何正确应对这一挑战，已成为当代法学理论研究的一个重大难题。本文拟从克隆及其技术分类入手，立足于刑法的视域对克隆人的法律规制问题浅陈拙见，以求为我国相关的立法完善提供一些参考建议！

一、克隆人的技术分类

克隆是英文Clone的音译，意指生物通过细胞分裂进行无性繁殖，形成基因型完全一致的后代种群，因此更为科学的术语称为“无性繁殖”。在科学界，根据克隆技术所应用目的之不同，通常将克隆分为治疗性克隆和生殖性克隆。所谓治疗性克隆，是指从需要治疗的病人身上提取一些细胞，然后将该细胞的遗传物质置入一个去除了细胞核的卵细胞之中，重组的卵细胞通过化学或物理方法刺激之后，开始自行分裂增殖，直至形成一个早期胚胎。从这个早期胚胎中可以提取到对生命成长发育起主要作用的细胞—干细胞。胚胎干细胞经过相应的定向诱导发育的处理，便可以发育成病人需要的各种组织，由于再造的细胞及组织的基因与病人的基因相同，因而以往在器官移植中经常出现的排异反应的难题便得到了彻底的解决。由于从早期人类胚胎中提取的干细胞拥有形成所有270多种人体细胞类型的能力，因而它有可能成为21世纪最重要和最理想的人体器官替代或修复的原料，这项技术的成功应用将是再生医学上划时代的进步。所谓生殖性克隆，起始的步骤完全相同于治疗性克隆，即从某一供体身上提取少许细胞，然后将该细胞的遗传物质置入一个去除了细胞核的卵细胞之中，经过刺激后，重组的卵细胞开始自行分裂，直至形成一个早期胚胎。如果将早期胚胎植入受体的子宫内，完成受孕、发育和产子过程，就达到了生殖性克隆的目的{1}。以克隆技术的以上分类为基点，克隆人也可以被划分为两类，即治疗性克隆人与生殖性克隆人，前者是指以治疗为目的而进行的人体克隆，而后者则是以“造人”本身为目的的人体克隆。

二、有关克隆人的犯罪性及其刑事责任的学理争论

“克隆”一词最早于20世纪初被引入园艺学，以后又逐步应用于植物学、动物学和医学等方面{1}105 。 1997年世界上首例克隆羊“多莉”的诞生，震撼了整个世界，因为它的问世标志着又一项重大科技成果—人体的克隆（即克隆人）将极有可能很快问世。于是，针对人类可否克隆自身的问题，在全球范围内展开了一项大讨论，其影响深远，迄今余波犹在。在这场旷日持久的大讨论中，法学家也参与了其中，并就克隆人的犯罪性以及法律（尤其是刑法）应否禁止克隆人等进行了激烈争辩，形成了“肯定论”与“否定论”两种针锋相对的观点。

“肯定论”认为，克隆人是一种典型的犯罪，因为克隆不仅使得克隆者与被克隆者有着相同的基因构成，而且使克隆者总是生活在被克隆者的阴影之下，而这种阴影使他对自己的独立性和自我的感觉受到了限制{2}。不仅如此，克隆人也严重冲击了人类的伦理道德，威胁着现存的社会秩序。正如有学者所指出的，“我们为了保持人类社会特有的秩序，就应该防止有害因素的侵袭，原子弹只消灭物质，而克隆人毁灭伦理规范、精神和道德”{3}，“生殖性克隆人行为已经对人类的公共利益和群体利益造成了损害和威胁，是具有严重社会危害性的行为”{4}。以此为基点，对于复制人类自身的做法，法律应当坚决禁止，并应当在刑法中增设“克隆人罪”{5}，或者应当订立一部禁止克隆人的单行刑事法{6}。从犯罪控制论的立场来看，“只禁止人类生殖克隆技术是不够的，……只有确保违禁行为将受到双重制裁，禁令才具有意义：一方面是由已有国际人权法院（如欧洲人权法院、美洲人权法院或未来的非洲人权法院）或有待创建的国际人权法院在其他地区或联合国内部针对国家的违禁行为宣判的制裁措施；另一方面是由本国或国际司法机制根据反人类罪宣判的刑事制裁。”{7}

与“肯定论”针锋相对的是“否定论”。这一学说认为，发现和发明是科学发展的动力，人类最终将会承认创设人的生命的方式不止有性繁殖一种，应该允许无性繁殖作为一种补充方式。两种方式所创造出来的都是人的生命，同样是神圣的{8}。所以，克隆人的犯罪性尚待商榷，立法对待克隆人这一新生事物不能简单地一禁了事。“对克隆技术的禁止是违背人文主义的精神追求的，法律应宽容地看待克隆技术。……对任何新技术采取拒绝的态度和回避的立场不是人文主义者对待新技术的方法。我们在对新技术作反思性审视的同时，应对人的理性和经验抱以充分的信任。……技术本身引发的问题最终还是要靠科技本身的发展来解决，这是我们对待克隆技术应采取的态度。”{9}“现代法律是以理性与人道主义为基础的，它应具有更多的开放性与包容性，一方面，对现行占主导地位的人类价值观和伦理道德、生命观加以保护但不僵化与绝对化；另一方面，对于伴随新科学新技术而出现的新的生命现象伦理变化及价值观的变化，应该持一种宽容的、理性的、通达的态度，适当规范可能的不良后果，方可使法律始终适应生产力及生产关系发展的需要，并促进生产力的发展和社会的进步。盲目地、绝对地禁止克隆人，是不可取的，也是禁止不了的，只能导致人类社会僵化、保守和偏狭心理的炽燃，或者促使人们公然违法肆无忌惮地克隆人，扰乱社会。理性的办法应该是制定严密的法律，疏通、引导、规范克隆人的技术活动，使克隆人技术为人类谋福利，而不是把克隆人视为洪水猛兽，围追堵截。”{10}以此为立足点，对于克隆人，“我国法律应对此进行积极干预，而不是消极回避或绝对禁止”{10}12。

三、对克隆人犯罪加以刑法规制的必要性分析

笔者以为，由于克隆人在生命科学上可以被划分为治疗性克隆人与生殖性克隆人两种，而这两种克隆人的社会危害性又存在着明显差别，因此，对于克隆人犯罪性的评价应当分别加以讨论，并分别采取不同的立法对策。换言之，“制订任何反对克隆人类可能性的法规必须谨慎从事，以保证好的研究不至于被粗心大意地弃之不顾”{11}。具体来说：

首先，对于治疗性克隆人来说，由于其终极目的并不在于“造人”，而是要通过“造人”来获取医学治疗所必须的干细胞，因此，其本质实际上是以牺牲一个个体来拯救另外一个或一群个体，在这一点上，它与器官移植有着类似的伦理基础。在生命科学发展尚无其他更优方案可以替代的情况下，治疗性克隆人作为一种次优方案在伦理上具有一定的合理性。也正是由于这一原因，治疗性克隆人获得了世界上很多国家的认可。站在犯罪学的立场上看，犯罪是其社会危害性已经超出了社会的承受度从而需要由刑法来加以防范和惩治的行为，而治疗性克隆人则是一种尽管具有社会危害性但其社会危害性尚在社会承受范围之内的行为。以此为基点，笔者认为，治疗性克隆人并不具有犯罪性，对于治疗性克隆人，刑法不宜将之作为犯罪处理。[1]

其次，对于生殖性克隆人来说，笔者认为，这是一种具有严重社会危害性的行为，应当被刑法入罪化。这是因为人的生命复制或无性生殖问题不同于克隆技术在医学、农业等领域的运用，它将使人类面临巨大的伦理和法律危机。具体而言，主要表现在：(1)从法律上讲，每个人都有自己的尊严和价值，如果允许用克隆的方法在实验室内去复制人或大批复制同一个人，实际上是在认同人类可以被作为产品而在实验室里加以生产，这势必会贬损人的尊严与整体性社会价值。(2）从社会关系与家庭关系的角度来看，人的诞生都会在其家庭关系乃至社会关系中具有明确的法律身份和地位，但克隆人则完全改变了这一点，一旦其降生，则不论是社会还是其本人都无法界定其在伦理及法律上的身份和地位，这势必会造成其社会异类的身份，使其本人陷入被歧视甚至无法为社会认同和接受的窘境，并导致无法定位自我以致处于自我怀疑、自我否定的状态之中。不仅如此，人的复制完全违背了人类生育和人类亲亲关系的基本准则。它不仅完全改变了人类自然的、通过男女有性结合才能完成的生育方式，也使作为传统社会关系的亲亲关系发生了动摇。[2](3)从克隆人自身的立场上来说，一个生理性状被控制的人，如果为某种目的而再生产，就会有自身被沦为“社会工具”的悲观心理和宿命感，势必会激发其对科学与未来社会的报复感或对抗情绪。而一旦这种技术被用来控制人的性别、人种或生产人体器官，则其后果更难想象。(4）人的死亡是一个法律事实。人一旦死亡，其生命便不复存在。但克隆人却产生了这样一个问题，即死人是可以被复制的，而死人的复制则会使正常的或法律上的生死概念发生颠覆性的动摇与混乱。(5)从技术的角度上来说，克隆技术相对粗糙，克隆人的质量难以保障。克隆人是单性生殖，从进化论的角度看，它是一个粗糙的过程。克隆羊“多利”的成功率是1/227，而克隆人的成功率即使乐观估计也只有2－3%，而且克隆生物个体易产生畸形、死胎、流产、胎儿过大、早衰等情况{12}。综上所述，生殖性克隆人技术给在整个人类社会带来的弊是远大于利的，“如果复制技术被某些不负责任的人滥用，世界将因人类科技进步而陷入噩梦般的境地”{13}。以此为基点，笔者认为，生殖性克隆人是一种完全不同于治疗性克隆人的行为，它无法摆脱伦理上的非难性，已经超出了社会可承受的范围，其本质是一种反社会的犯罪行为。对于这种行为，刑法应当将其入罪化，并配设适宜的刑事责任。

至于“否定论”所主张的“应对人的理性和经验抱以充分的信任”和“技术本身引发的问题最终还是要靠科技本身的发展来解决”，笔者认为，这些论证根本就是站不住脚的。首先，就前者而言，人类社会的发展已经不止一次地证明，科技的产生、发展和应用给人类带来的福与祸，从来都不是以人的善良意志为转移的。“科学提高了人类控制大自然的能力，因此很可能会增加人类的快乐和富足。这种情形只能建立在理性基础上，但事实上，人类总是被激情和本能所束缚。”{14}因此，我们切不可对人类的理性和经验抱以过高期望，而应当更多地寄希望于法律，因为法律才是人类高度理性的产物，其“对人的行为进行规范，基于对该行为的全面评价”{15}。其次，就后者而言，人类科学发展的历史表明，“科技发展是不问人的生存意义与尊严的，它隐含着无法预料的后果，而且科技不能体现对人类的终极关怀，它无法消除人类与科技的对立和冲突”{16}。为此，科技的意义深化应该被带入伦理、道德乃至法律的揭示中，“在科学的发展过程中，我们确实需要不时地停一停脚步，确保所发展的技术的确安全，然后重新上路”{16}10。而这也正是科技伦理学、科技法学以及生命伦理学、生命法学等一批新学科诞生的最主要原因。易言之，科技本身所引发的问题是不可能完全依靠科技本身的发展来解决的，在科技发展的过程中，为了保障科技的健康发展，法律的介入甚至是刑法的介入在多数情况下是必不可少的。

此外，“否定论”所主张的刑法宽容并不意味着刑法对生殖性克隆人的纵容。刑法宽容作为刑法谦抑品性所体现出来的一种外在素质，是指刑法应当对负面影响尚在人类社会控制和承受范围之内的一般反社会行为网开一面，不将之作为犯罪来追究刑事责任；而不是指刑法应当对那些社会危害已经超出了社会承受度的犯罪置若罔闻。现代基因科技发展过程中引发了大量的法律问题，这些问题中的绝大多数都还在社会的承受范围之内，依靠一般法律手段甚至是伦理道德手段就可以解决，但有些问题则由于已经远远超出了人类社会的承受范围且也超出了一般法律手段与伦理道德手段的调整领域而必须要由刑法来加以控制。笔者以为，人体的生殖性克隆便在其中。人体生殖性克隆所带来的克隆人之社会地位的无法认定，使得这一行为具有不可抹杀的伦理非难性，假如刑法放任这一行为自流，则势必会严重冲击维系人类社会存续的现行伦理秩序，从而危及人类社会存续的基础。不仅如此，从刑法哲学的立场上来看，为了防控基因技术发展所引发的各种负面效应，在基因研究与基因技术的应用方面，刑法应当设置某些“禁区”，而设置禁区是“为了维护人类的利益而采取的手段，而不是目的”{17}。正如我国某些学者所指出的：“……设置禁区并不是永远不许涉足该领域，而是指在条件不成熟或后果暂时无法控制的情况下，通过评价其潜在的风险而采取的一种特殊措施；当各种条件允许时，原先的禁区也将不再是禁区，而成为科学研究的‘富矿’。”{18}良好的刑法防控制度，不仅是基因研究健康开展与基因技术理性应用的保障，而且也是基因科技最终造福于人类的根本保障。而生殖性克隆人作为一种严重危及当代社会伦理秩序乃至社会秩序的反社会行为，就是刑法应当在基因研究方面设置的一个必要禁区。

基于以上分析，笔者认为，刑法应当禁止生殖性克隆人，并应当为擅自从事生殖性克隆人研究的行为配设一定的刑事责任。但是，另一方面，我们也必须明确：克隆人的出现是生命科学技术发展必然会出现的结果之一，法律对克隆人的禁止并不能够阻止克隆人的最终出现，它只是在一定程度上延缓了克隆人出现的时间。而法律尤其是刑法之所以要禁止克隆人，并不在于立法者看不到克隆技术发展的这一最终趋势，而更多地在于通过在一定时期内禁止克隆人，给人类生命伦理提供一个必要的缓冲期，以便尽可能地减少克隆人给社会带来的根本性冲击，维护社会的稳定，保证社会的健康发展。实际上，刑法中很多犯罪的设置都是为了给人类社会更好地承受各种反社会行为的冲击赢得缓冲期。这一点我们可以从各国刑法中的很多犯罪之变迁上得到很好的诠释。以各国刑法对堕胎罪的规制为例，自1821年美国康涅格州制定了美国国内第一个《堕胎罪法》之后，一直到1950年代末，各国的法律一直都将堕胎行为视为犯罪而给予重罚。但随着工业发展所导致的大量畸形胎儿的涌现、堕胎术的逐渐成熟以及公众对堕胎的日益宽容，自1960年代起，美国很多州（如加利福尼亚州、北卡罗来纳州等）先后通过了允许堕胎的法律，而在其他很多国家，堕胎罪也逐渐由刑法明文规定的一种犯罪转化为一种合法的行为。时至今日，尽管堕胎罪在很多国家都已如历史的尘埃而被尘封在了各国的刑法教科书中，但其为确保人类在胎儿生命处理问题上实现社会观念和意识的平稳过渡以维护当时人类生命伦理秩序的稳定进而维系社会秩序的稳定发挥了不可抹杀的重要作用。而我国1979年《刑法》将流氓罪、寻衅滋事罪、投机倒把罪等诸多犯罪明文规定为犯罪来予以惩治，并在我国由计划经济到有计划的商品经济过渡的过程中乃至社会主义市场经济初期依然在刑法中保留这些犯罪，实际上也是为了给我国社会最终认同、接受和适应市场经济及与之相适应的各种社会现象赢得缓冲期。“从这个意义上来说，法律对克隆人的禁止与其说是对克隆人的彻底否定，不如说是为人类社会乃至法律自身应对克隆人所带来的各种挑战并最终认可和接受克隆人赢得缓冲时间。”{1}14尽管随着社会的发展所必然带来的克隆人的最终出现以及人们对克隆人的认同和接受都将会成为一种事实，但当前刑法禁止克隆人对社会稳健发展所起到的作用以及该罪在维护社会秩序方面的时代价值是不容抹杀的。

四、域外克隆人犯罪的刑法规范

在现代生物技术的整个体系中，“克隆人是目前争议最大、波及范围最广的一项生物技术”{19}。由于克隆人的出现将极有可能从根本上改变人类自然的生存繁衍方式，并会对人类传统的生命伦理观念带来毁灭性冲击，因此，动用刑法的力量对生殖性克隆人加以规范，便成为各个国家或地区乃至整个国际社会在发展生命科学技术过程中均须仔细权衡和认真考量的一个基本问题。在此背景下，一大批旨在禁止人类自我克隆技术研究与应用的立法开始出现，它们在保障基因技术健康发展方面发挥了不可抹杀的重要作用。而从比较法学的角度来看，分析这些立法，对于探究我国刑法应对人体克隆技术所带来的挑战，完善我国克隆技术的刑法防范策略，无疑具有不言自明的重要意义。

首先，就国际层面来看，尽管人们对克隆人的法律后果在理论上还存在诸多争议，但在实践中，有关国际组织及各国在生殖性克隆人这一问题上的立场却是非常明确的，即对生殖性克隆人基本上都持否定态度，反对甚至明文禁止生殖性克隆人。1997年11月12日，联合国教科文组织在巴黎通过的指导基因研究的道德准则性文件《世界人类基因组与人权宣言》中，就要求禁止克隆人等“损害人类权利和尊严的科研行为”。而在日内瓦举行的第55届世界卫生大会也通过决议指出，运用无性繁殖技术复制人类“违背人的尊严和道德，因而必须严格禁止”。世界卫生组织表示，利用克隆技术复制人在伦理上是不能接受的，这种试验违背医学要保护人类尊严和从遗传角度保证人类安全的基本准则。1998年1月12日，法国、丹麦、芬兰等19个欧洲国家在巴黎签署了《禁止克隆人协议》，规定禁止用任何技术创造与任何生者或死者基因相同的人{8}345。

其次，就各国国内立法层面来看，很多国家和地区都出台了禁止或限制生殖性克隆人技术的专门立法，有些国家甚至在刑法典中明确规定了生殖性克隆人犯罪。作为世界上首个成功培育出克隆羊的国家，英国国会于2001年通过了一项应急法案—《人类生殖性克隆法案》，将生殖性克隆人作为一种新的犯罪，并可判处最高达10年的监禁，以弥补其1990年《人类授精与胚胎移植法案》未明确规定禁止生殖性克隆人的缺陷{20}。澳大利亚2002年就专门出台了《禁止克隆人法案》，将故意克隆人类胚胎、进口或出口克隆的人类胚胎的行为明确列为犯罪行为，并规定这类犯罪的最高量刑可达到15年有期徒刑。不仅如此，该法案还将通过受精以外的方式生产或培养人类胚胎、非以妇女受孕为目的创造人类胚胎以及创造或培养包含有多于两人提供的基因内容的人类胚胎等明文规定为犯罪，并规定这类犯罪的最高量刑为有期徒刑10年{21}。日本2001年4月开始实施的《克隆技术限制法》全面禁止制造有损于人类尊严的克隆人，违者将被处10年以下劳役或1000万日元以下罚款{22} 。 2004年9月新加坡国会通过的一项法律也明文规定禁止在本国克隆人，违反这一法律者最高将被处以10万新元的罚款和10年监禁{23}。而美国国会也于2001年7月31日通过了全面禁止克隆人的法律，规定对违反法律规定者最高可处以10年监禁和100万美元罚款{22}。我国台湾地区2007年颁布的《人工生殖法》中也对从事生殖性克隆人作出了禁止性规定，依据该法，以无性生殖方式为人工生殖的，处其行为人5年以下有期徒刑，得并科新台币150万元以下罚金。[3]除以上国家和地区之外，法国、德国等也都制定了本国有关禁止克隆人的立法，并对非法从事生殖性克隆人的行为追究一定的刑罚。例如，法国对违反禁止克隆人法的行为处以20年以下徒刑，德国处以5年以下徒刑，英国则根据克隆手段的不同分别处以2-10年劳役和监禁{9}63。西班牙则将生殖性克隆人这一犯罪明文规定在其刑法典中，《西班牙刑法典》第161条第2款规定：“用克隆的方法进行人类繁殖和进行其他人种选择的活动的，处1年以上5年以下徒刑，并剥夺其担任公职、从事职业及担当任务6至10年的权利。”{24}国际社会以及各个国家和地区对克隆人技术的刑法规范不仅表明了人类在对待克隆人技术问题上的谨慎态度，而且通过刑法的力量阻止或至少是延缓了克隆人的产生，在一定程度上为人类社会应对生殖性克隆人所带来的冲击赢得了缓冲期。

五、我国应对克隆人技术的刑法对策思考

从法哲学的角度来说，克隆技术与法律的关系，就好似剑与剑鞘的关系。一把锋利无比的剑可以帮助人们披荆斩棘，但同时也可能会伤害用剑者自身，而剑鞘则可以帮助人们在不用剑的时候有效遮蔽剑的锋锐，防止造成不应有的伤害，克隆技术与法律的关系也是如此。克隆技术具有明显的双刃性，其健康发展与正当应用会极大地增进人类社会的福祉，而其滥用则可能会给人类带来灭顶之灾。为此，需要立法者采取适宜的对策，以便利用好法律尤其是刑法这一剑鞘，将克隆技术所引发的负面问题限制在最小限度内。对于克隆技术发展所潜藏的各种负面效应，理论上存在3种应对策略，即事前防范、事时制止以及事后惩戒。古人云：“先其未然谓之防，发而止之谓之救，行而责之谓之戒”，而“防为上，救次之，戒为下”（《申鉴·杂言》）；换言之，事先防范是避免风险发生并避免或减少损害的最有效策略。以此为立足点，尽管从理论上来说，“社会和个体一样，无法在所有风险问题上都保持高度警惕”{25}，但每一个社会与个人却都必须选择特定的风险加以关注以便实现其生存与发展，使克隆技术发展过程中所潜藏的巨大风险成为社会与个人通过法律来加以防范的基本风险之一。在此背景下，制定专门规范克隆技术的立法并在刑法中增加有关人体克隆方面的犯罪及其刑事责任的规定，无疑应当成为我国在防范克隆人技术所引发的社会风险方面所应肩负的一项基本使命。

（一）我国目前有关克隆技术规范的立法现状

在克隆技术的控制方面，我国目前尚未制定专门立法。但在已经出台的个别行政规章中却已经明文涉及了克隆人的问题。2003年12月由科技部与卫生部联合的《人胚胎干细胞伦理指导原则》第4条明文规定：“禁止进行生殖性克隆人的任何研究。”不仅如此，该《指导原则》还就从事治疗性克隆人研究（亦即人体胚胎干细胞研究）的条件与程序等作了明文规定。此外，在卫生部2003年8月颁布的《人类辅助生殖技术规范》中，也对实施辅助生殖技术人员之行为准则作了规定，其中第15项明文规定：“禁止克隆人”。就此来看，我国在人体克隆技术方面的立场是明确的，即绝对不允许从事生殖性克隆人方面的研究，但对于治疗性克隆人技术的研发则给予支持。[4]然而，另一方面，我国有关人体克隆技术规范的现行立法还存在明显缺憾，无论是《人胚胎干细胞伦理指导原则》，还是《人类辅助生殖技术规范》，都还存在着立法效力层次过低且刚性不足的严重弊端，而且在以上两部规章中都没有关于从事生殖性克隆人研究所应当承担的法律责任尤其是刑事责任的任何规定。这就使得我国现行立法对生殖性克隆人的禁止显得苍白无力，一旦实践中有人从事生殖性克隆人方面的研究，以上两部规章根本就无法发挥其应有的规制作用。在克隆技术，尤其是以治疗为目的的干细胞技术飞速发展，而滥用该技术从事生殖性克隆人研究的威胁又随时可能成为现实的背景下，这显然已经成为我国现行立法的一个不足。

（二）我国应对人体克隆的刑法对策建议

以上文对国外有关人体克隆技术刑法规制的分析为视角，并结合我国刑法“惩罚犯罪，保护人民”的庄严承诺，笔者认为，我国现行立法尤其是刑法在规制人体克隆技术方面还存在明显的缺陷，具体而言，现行法律尤其是刑法尚未针对非法人体实验配设相应的刑事责任制度。针对这一立法缺位以及我国克隆技术发展所必然带来的相关立法需求的日益强烈，我国应当制定一部专门引导和规范克隆技术研究与应用的《克隆技术管理法》，将我国在克隆技术发展方面的基本政策转化为法律予以推行，以保障克隆技术在我国的健康发展。在这样一部立法中，应当明确规定指导我国克隆技术发展的基本原则与基本制度，并明确规定相关不规范操作的一般法律责任以及刑事法律责任。[5]同时，为了使该法与刑法保持衔接以更好地防范生殖性克隆人犯罪的发生，应当及时修改现行刑法的规定，增加“非法从事生殖性人体克隆研究罪”这样一项罪名。在法治已经成为我国当代社会主旋律而罪刑法定的理念亦已深入人心的情势下，这显然已成为我国应对克隆技术发展所带来之挑战并弥补现行立法缺憾的内在需要。

【注释】

[1]当然，这并不意味着刑法将完全放任治疗性克隆人，而仅仅表明，刑法不应将治疗性克隆人做人罪化处理。假如治疗性克隆违背了法定的操作规程，造成了严重危害社会的后果，刑法依旧要将相关的行为作为犯罪来处理，并依法追究相关行为人的刑事责任。

[2]社会学的研究表明，家庭作为人类社会的基本构件、人类关系的基本单元，并不是某个或某些人随随便便发明创造所产生的，而是人类历史在漫长的自我探索与选择的进程中结出的文明成果。历史上曾有过取代家庭的实验，但未真正取得成功。而双亲家庭又是最有益于儿童身心发育、形成健全的人格和成熟的自主性及完美的爱的情感体验，从而避免罹患认知与情绪上的心理障碍的环境。相反，在丧失父母一方的家庭中的儿童，由于无法体验完整的父母之爱，其人格发展也难以达到健全的水平，心理失常、行为不轨的几率要远远高于双亲家庭中的同龄人。现实社会中，由于父母离异所造成的对子女的伤害已经是一种很大的不幸，但这些子女至少还是拥有他们的父母，至少还曾经拥有过完整的双亲家庭。而通过克隆技术使单身男女生殖后代的行为，则不仅使作为后代的当事人应当享有的惟一性、独特性的权利天然丧失，而且使得他应当享有的如其基因供体（即单身贵族）一般曾经享有过的拥有父母双亲的权利先天地被剥夺了，他从存在之时起便被先天地打入无父或无母的单亲家庭之列，这对于克隆人来讲，显然是不公平的，甚至可以说是一种伤害。而这种不公平和种种显而易见的对克隆人的身心伤害足以构成对法律禁止生殖性克隆人的强有力的理由。（参见：谭家宝，张绪治．论生殖性克隆人犯罪—对生殖性克隆人的犯罪学评价[J]．英才高职论坛，2006，（1):10）

[3]参见我国台湾地区《人工生殖法》第16条及第30条。

[4]当然，这种支持是建立在相关研究须严格遵守《人胚胎干细胞伦理指导原则》所规定的条件和程序之基础上。

[5]在《克隆技术管理法》中明确规定克隆技术不规范操作的刑事法律责任，并不是要求该法对克隆技术操作方面的罪名和罪状作出规定，而是要求该法设置一些涉及克隆技术操作的刑事指引条款，以便为刑法介入对这类操作的规范提供立法支持。

生物克隆技术范文第5篇

【关键词】 基因；克隆细胞；基因，病毒

value of in-fusion cloning techhique on routine vector construction　lin chao?gui　fan lin　chen liang?longdepartment of cardiology，union hospital，fujian medical university，fuzhou，fujian，350001，

abstract：objective:to introduce a simple method for the cloning of pcr products.methods:the in-fusion cloning technique was described by constructing a recombinant lentivirus vector (pgcfu) with surviving ＆ egfp fusion gene as a sample.the survivin cdna was amplified with survivin gene?specific primers with 15 bp extensions homologous to the pgcfu ends.by the action of the in-fusion enzyme at room temperature for 30 minutes，the single-stranded pcr fragment and vector ends were fused due to the 15 bp homology.finally，clones derived from transformation were chosen randomly and identified.results:about 103 positive clones for inserts were obtained after transformation with 2 μl of exchanging products，and the ratio of the positive colonies was more than 90%.after 24 h the p-gcfu-survivin was transfected into 293t eukaryotic cells，the expression of the survivin ＆ egfp fusion gene can be confirmed with fluorescence microscope.conclusion:the ligation?independent property makes the in-fusion pcr cloning technique rapid，reliable and higher cost-effective，avoiding the need for multiple sub?cloning steps.

key words：genes;clone cells;genes,viral

传统的聚合酶链式反应（pcr）产物克隆技术包括补平末端克隆、ta克隆以及连接酶依赖性克隆等。这些方法的共同特点是在实际操作过程中需要用多种不同的酶（如t4连接酶、磷酸酶等）对pcr产物和/或载体进行处理 [1～3]。虽然大多数情况下使用这些方法能够成功构建目的基因重组载体，但酶切连接过程本身费时费力，并且常常出现克隆失败现象。同时这些方法自身局限性使之难以满足某些特定条件下的基因克隆：（1）酶切位点的选择受到载体和目的基因的双重限制；（2） pcr引物设计时在两端引入酶切位点，由于部分限制性内切酶在酶切过程中需要在识别位点两端留有一定长度的碱基序列，而这些序列可能会显著影响酶切效率，同时由于pcr产物两端的酶切只是减少了几个碱基，酶切成功和完全与否很难用常规电泳检测出来。因此，寻求一种快速、高效、简便的克隆技术对后续基因功能研究极为必要。本研究通过运用in-fusion克隆技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白（survivin ＆ egfp）融合基因慢病毒表达载体，观察其在真核细胞中的表达情况，对in-fusion克隆技术在常规载体构建中的应用进行了初步的探讨。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞、质粒：菌株为大肠杆菌dh5a，由福建医科大学感染与肿瘤重点实验室林旭教授惠赠；293t/17细胞购于atcc公司；puc18-survivin质粒（含人survivin全长cdna序列）由美国内布拉斯加州医学中心杨静博士惠赠，并经测序鉴定；p-gcfu（慢病毒表达载体）购于上海吉凯基因化学技术有限公司。

1.1.2 主要分子生物学试剂：胰蛋白胨、酵母提取物购于英国oxoid公司；高保真taq酶和脂质体 2000购于invitrogen公司；dntp购于promega公司；质粒大量抽提试剂盒购于qiagene公司；in-fusion pcr克隆试剂盒购于takara公司；胶回收试剂盒购于stratagene公司；质粒小量抽提试剂盒购于上海中科开瑞公司；胎牛血清、dmem（高糖/低糖）细胞培养基、0.25%胰酶以及左旋谷胺酰氨购于gibco公司；hepes游离酸（高超纯）购于amersco公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计、合成与基因测序：根据in-fusion技术原理，克隆引物设计时，在针对survivin基因序列的上下游引物的外侧分别引入经age i线性化的p-gcfu两端各15个碱基，使克隆引物外侧的15个碱基与线性化载体两端的15个碱基序列同源，其中下游引物去除终止密码的三个碱基，使其与egfp基因形成融合基因。pcr鉴定引物根据survivin和载体设计，其中上游引物位于survivin，下游引物位于载体，且下游引物也用于后续阳性克隆的测序鉴定。引物合成和基因测序均由上海英骏生物技术有限公司完成，具体引物序列与产物片段长度见表1。表1 引物名称及序列（略）

1.2.2 survivin基因cdna的获取：以puc18-survivin质粒为模版，使用高保真taq酶进行survivin基因全长cdna的扩增，上游引物为age i-f，下游引物为age i-r。扩增采用热启动方式，即反应先经预变性5min，待温度上升至80℃后加入聚合酶，随后进入循环，循环条件为94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 45s，共30个循环。

1.2.3 pcr产物回收和p-gcfu慢病毒表达载体的酶切：取10μl pcr扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下将pcr产物的琼脂糖凝胶切下，以胶回收试剂盒回收获得人survivin cdna 溶液，具体步骤按质粒小量抽提试剂盒说明进行。同时，将一定量的p-gcfu以age i限制性内切酶进行酶切，反应条件为37℃ 1 h。酶切产物经过0.75%琼脂糖凝胶电泳后回收，方法同前，并溶于50μl灭菌双蒸水中。

1.2.4 survivin ＆ egfp融合基因重组慢病毒载体（p-gcfu-survivin）的构建：将上述处理过的pcr产物与载体用in-fusion pcr克隆试剂盒将pcr产物与酶切后质粒dna溶液进行交换反应，反应条件为室温30min，制备克隆交换液。

1.2.5 感受态细胞制备及转化：采用cacl2法[4]制备大肠杆菌dh5a感受态细胞。用冷却的无菌吸头取200 μl感受态细胞悬液转移到无菌的微量离心管中，加2 μl 交换液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min；将管放到预加温到42℃热激90秒后快速将管转移到冰浴l～2 min，每管加入800 μl lb培养基；然后将管转移到37℃摇床上振荡培养（250rpm）45min使细菌复苏；将100 μl已转化的感受态细胞均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的 lb固体培养基表面；倒置平皿，于37℃培养16 h；随机挑取若干单菌落置于含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃振荡培养过夜（16h）以备后续pcr、酶切和测序鉴定。主要流程见图1。

1.2.6 重组克隆筛选：采用碱裂解法制备质粒dna，具体按试剂盒说明书进行操作。以获取的质粒dna为模版，进行pcr扩增反应，同时设立两个阴性对照，模板分别为等体积的高压灭菌双蒸水和p-gcfu空载体。上游引物为seq-f，下游引物为seq-r，循环条件为94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 45s，共30个循环。取经pcr初步鉴定正确质粒dna 5μl，以age i限制性内切酶于37℃进行酶切反应1 h后，将酶切产物进行0.75%琼脂糖凝胶电泳。再将经酶切鉴定的阳性克隆10μl冻存的菌液，加入3ml含氨苄抗性的lb培养基的试管中剧烈振摇过夜，取1.5ml菌液送上海英骏生物技术有限公司进行基因测序以确保所筛选克隆碱基序列完全正确。

1.2.7 survivin＆egfp融合基因重组慢病毒载体转染293t细胞：细胞于转染前一天以2×105/孔的细胞数接种于24孔培养板，使转染时细胞融合率达到70%～80%；将1μg survivin＆egfp融合基因慢病毒表达质粒与50 μl 无血清培养基混合。取2.5 μl 脂质体2000试剂在另一管中与50 μl 无血清培养基混合后室温孵育5min。把稀释后的融合蛋白质粒与稀释后的脂质体2000轻轻混匀后室温孵育20 min；将此混合液加入培养细胞，将培养板置于37℃ co2培养箱中培养6 h后，换为新鲜培养基（含10%胎牛血清)继续培养。24 h后在相差荧光显微镜下观察survivin＆egfp融合蛋白的表达情况。同时以空载体作为阳性对照、以未转染细胞作为阴性对照。

2 结 果

2.1 survivin基因的亚克隆

通过pcr反应成功获得survivin基因全长cdna（见图2）以及利用age i酶切使p-fugw慢病毒表达载体线性化（见图3）。用2μl交换液转化后获得阳性克隆数约为103个，随机挑取7个克隆进行pcr鉴定，仅一个克隆为假阳性，其余克隆的扩增片段大小与预期大小一致为541bp，而阴性对照经1.5%琼脂糖电泳检测未见扩增条带（见图4）。重复上述实验，克隆数稳定于103的数量级，pcr鉴定阳性率大于90%。随机挑取任一pcr初步鉴定的阳性克隆经age i酶切后，清晰地见到两条条带，大片段约10kb与线性化载体条带位置一致，小片段约为430bp（见图3）。该克隆测序结果与人survivin基因序列完全相符（基因号refnm_001168.2）。

2.2 survivin ＆ egfp融合基因重组慢病毒表达载体直接转染荧光检测

用重组p-gcfu-survivin和对照质粒p-gcfu分别转染293t细胞，24h后相差荧光显微镜检测样品和阳性对照均产生绿色荧光，但前者蛋白定位于细胞浆，而未转染的细胞未观察到绿色荧光（图5，见封三）。

3 讨 论

in-fusion技术是近年来新兴的一种克隆技术，已逐渐应用于基因突变、长片段克隆及多基因融合等研究[5]。berrow等[6]利用这一技术进行高通量载体构建时发现克隆效率超过90%，明显高于gateway重组技术（79%）[7]和经典的限制性酶切连接技术（87%）[8]。运用该技术进行基因克隆时不需要借助连接酶或者磷酸化和补平末端等手段，其技术核心是根据线性化载体两端序列，在pcr引物设计中分别引入15个碱基的载体末端序列，使pcr引物外侧带有的15个碱基序列分别与线性化载体两端相同，然后在反应体系中加入in-fusion交换酶，室温反应30 min，pcr产物即可与线性化载体两端的序列进行定向交换从而使目的基因精确的克隆至目的载体。

本研究应用该技术所构建的survivin＆egfp融合基因重组慢病毒表达载体经过pcr、酶切和测序鉴定证实survivin基因被成功插入到载体启动子之后并与egfp形成survivin＆egfp融合基因，进一步地瞬时转染实验证实了该融合基因能够在293t细胞中正确表达。经重复实验发现使用该方法时2μl交换液转化大肠杆菌感受态细胞可稳定产生约103个克隆、重组效率达90%以上。与传统基因克隆技术相比，in-fusion技术具有独特地优势：（1）无须对pcr产物进行酶切处理，克隆过程中也不需要使用连接酶和磷酸化酶等，简化了实验步骤并节约了实验时间和经费；（2）不受基因序列及载体酶切位点的限制，在质粒载体无合适酶切位点的情况下，将传统克隆技术不可能或难以实现的基因克隆变为可能；（3）在引物设计时无须引入保护性碱基，避免了这些碱基对酶切效率的影响，从而降低了克隆失败的几率。

尽管in-fusion克隆技术具有诸多优点，但目前基因克隆实验中仍多采用传统的基因克隆技术。本研究以构建survivin＆egfp融合基因慢病毒表达载体为例，对in-fusion克隆技术在常规载体构建中应用进行了初步的探讨，结果证实这一技术高效、稳定、便捷，并且可以用于任何载体的基因克隆。更为重要的是，该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术，因此如果应用于多基因融合克隆和复杂载体构建，可能为心血管疾病的治疗和机制研究提供有力手段。致谢：感谢福建医科大学感染与肿瘤重点实验室林旭教授悉心的技术指导，感谢美国内布拉斯加州医学中心杨静博士惠赠含全长survivin cdna的puc-18质粒。

【参考文献】

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[2]ichihara y，kurosawa y. construction of new t vectors for direct cloning of pcr products［j］. gene，1993，130(1):153-154.

[3]tsang tc，harris dt，akporiaye et，et al. simple method for adapting dna fragments and pcr products to all of the commonly used restriction sites［j］. biotechniques，1996，20(1):51-52.