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老年大鼠术后认知功能障碍分析论文

老年大鼠术后认知功能障碍分析论文

摘要:目的探讨腹部手术操作对老年大鼠学习认知能力和海马CA1区胆碱乙酰转移酶(ChAT)阳性神经元的影响以及石杉碱甲干预的结果。方法20月龄Wistar大鼠32只,随机分为对照组、麻醉组、手术组和石杉碱甲组,石杉碱甲组手术前给予石杉碱甲灌胃3w,3w后手术组与石杉碱甲组行脾切除术。术后1、3、7d进行水迷宫测试,术后7d取脑使用免疫组织化学法观测海马CA1区ChAT的表达。结果术后1d进行水迷宫测试,与对照组比较,麻醉组、手术组潜伏期和游泳距离均延长(P<0.05);术后3d,与对照组比较,手术组、石杉碱甲组潜伏期和游泳距离进一步延长,而石杉碱甲组与手术组比较,潜伏期和游泳距离均缩短(P<0.05);术后7d,手术组与对照组比较,潜伏期和游泳距离延长程度缩小。术后7d,与对照组、石杉碱甲组比较,手术组的平台象限停滞时间百分比以及在平台象限游泳距离占总游泳距离百分比均减小(P<0.05)。术后7d,手术组海马CA1区ChAT阳性细胞数较对照组和石杉碱甲组增多(P<0.05)。结论老年大鼠脾切除术后早期可出现认知功能障碍(POCD),海马CA1区ChAT表达上调,预先给予石杉碱甲0.15mg/kg(连续3w)可以改善POCD模型大鼠学习记忆的功能。

关键词:老年大鼠;术后认知功能障碍;胆碱乙酰转移酶;海马;石杉碱甲

术后认知功能障碍(POCD)现在临床上广泛关注,老年人由于机体退行性变导致术后早期POCD的发生率大大增加,但其发生机制不甚清楚。脑内胆碱能系统在高级动物的学习记忆中起着重要作用〔1〕,但在POCD发生机制中的作用并不清楚。我们选择反应胆碱能神经的胆碱乙酰转移酶(ChAT)作为观察指标,旨在研究其与POCD发生发展的关系,探讨POCD的发生机制。另一方面,目前对POCD预防和治疗的有效性研究较少,为探讨对POCD的治疗策略,我们对脾切除术后大鼠POCD进行药物干预研究。以往研究表明石杉碱甲(HuperzineA,HupA)具有很好的抗衰老和改善学习记忆功能作用〔2〕,本文从神经生理学和组织细胞学两方面研究该药对大鼠脾切除POCD的影响。

1材料与方法

1.1药物与试剂石杉碱甲(河南竹林众生制药公司),氯胺酮(福建古田药业公司),山羊抗ChAT多克隆抗体(Cemicon)。

1.2动物分组及模型制备20月龄雄性Wistar大鼠(甘肃中医学院实验动物中心提供)经筛选剔除体重过大或过轻及在水中不游动的,共选出动物32只,体重500~550g。按体重分级,随机分成4组:对照组,麻醉组,手术组,石杉碱甲组(n=8)。其中石杉碱甲组给石杉碱甲灌胃,0.15mg·kg-1·d-1,溶于生理盐水中,连续灌3w,对照组、麻醉组、手术组均按体重给与同容量的生理盐水灌胃3w,3w后手术组和石杉碱甲组在氯胺酮腹腔注射(25mg/kg)麻醉下行脾切除手术;麻醉组仅给与氯胺酮麻醉,不行手术;对照组仅腹腔注射同容量的生理盐水。

1.3学习、记忆功能的行为学测试通过Morris水迷宫测试,将圆池内壁和平台漆成黑色,将其分为4个象限,平台置于第4象限没入水下约2cm,选择一个象限的固定位置作为大鼠入水点,通过自动图像拍摄系统记录游泳轨迹,入水至找到平台为潜伏期,其总行程为游泳距离〔3〕。术前学习5d,每天测试4次,取其平均值,术后1、3、7d分别进行测试,并于术后7d撤掉平台,记录60s内大鼠在每个象限的停滞时间和在每个象限游泳的距离。

1.4免疫组化染色

1.4.1灌注和切片大鼠行为学观察结束后,氯胺酮(25mg/kg)腹腔麻醉动物,暴露心脏,以0.9%生理盐水经升主动脉灌注冲洗后,灌注4%多聚甲醛(pH7.4)900ml,持续2h后取脑,将脑置于20%蔗糖的PBS溶液中浸置24~48h(4℃),冰冻冠状连续切片(厚度30μm),海马组织每5张取1张。

1.4.2免疫组化染色步骤切片置于0.3%Triton中浸30min,PBS液洗3次,每次15min;在稀释浓度为1∶2000的山羊抗ChAT多克隆抗体中孵育72h(4℃);PBS液漂洗后在生物素标记二抗(1∶100)中,室温下孵育1h;辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(1∶100)中,室温下孵育1h;二氨基联苯氨(DAB)反应液中成色,室温下10~20min;常规明胶裱片、脱水、DPX封片。为了计算ChAT细胞数目,采用标准网格的技术方法,在100倍的光镜下做ChAT细胞计数,以“500×400μm”为单位,结果取3个视野的平均值。

1.5统计学方法计量资料以x±s表示,用SPSS12.0统计软件,组间比较采用单因素方差分析。

2结果

2.1水迷宫测试结果术后1d麻醉组、手术组的逃避潜伏期和游泳距离延长,与对照组相比均有统计学意义(P<0.05);术后3d仅手术组,石杉碱甲组与对照组比较有统计学意义(P<0.05),且数值达高峰;术后7d手术组与对照组比较有差异(P<0.05),但差距已明显缩小;术后石杉碱甲组与手术组比较均有差异(P<0.05)。石杉碱甲组术前的逃避潜伏期和游泳路程较对照组有明显差异(P<0.05),见表1。与对照组(26.5%)、麻醉组(26.3%)、石杉碱甲组(26.5%)比较,术后7d在60s内手术组(24.1%)的平台象限停滞时间百分比减小(P<0.05),与对照组(24.5%)、麻醉组(24.2%)、石杉碱甲组(24.7%)比较,术后7d在60s内手术组(22.8%)的平台象限游泳距离占总游泳距离百分比减小(P<0.05)。这些结果说明脾切除术后大鼠在水迷宫测试中的空间认知能力受到损害,单次使用氯胺酮仅引起极短期的认知减退,而石杉碱甲组减弱了脾切除术后大鼠在水迷宫测试中学习记忆能力的损害。表1各组大鼠的逃避潜伏时间、游泳路程1)与对照组比较,2)与手术组比较:P<0.05

2.2免疫组织化学结果术后7d水迷宫测试后,海马CA1区ChAT免疫反应阳性神经元在对照组、手术组和石杉碱甲组的表达率分别是(68.17±3.02)、(80.15±2.18)和(70.31±2.56),手术组海马CA1区ChAT阳性细胞数较对照组、麻醉组(69.04±2.37)和石杉碱甲组都增多(P<0.05),而对照组、麻醉组和石杉碱甲组的ChAT阳性细胞数相当,见图1。

3讨论

Moller对1218例60岁以上的老年患者进行了POCD的调查研究〔4〕,发现25.8%的患者在术后1w出现了POCD,术后3个月9.9%的患者出现POCD,而相近年龄对照组患者的发生率分别为3.4%和2.8%,POCD对大多数患者来说是可逆的,但仍有少数患者存在长期甚至永久的认知功能障碍〔5〕。

脾切除手术对大鼠的机体影响较小,术后大鼠可以如期进行水迷宫测试。术前水迷宫测试成绩石杉碱甲组明显好于其他组,说明石杉碱甲可以改善大鼠的认知功能,与以往的文献报道相符〔4〕。术后1d,麻醉组、手术组空间记忆力低于对照组,石杉碱甲组不低于对照组,但呈下降趋势,表明手术组学习记忆功能下降;术后3d,麻醉组记忆力恢复,手术组、石杉碱甲组进一步减退,石杉碱甲组也低于对照组,但石杉碱甲组与手术组有统计学差异,提示石杉碱甲具有改善POCD模型大鼠学习记忆的功能;术后7d,仅手术组与对照组的差异明显缩小,提示老年大鼠的学习记忆能力正在恢复。麻醉组单纯应用氯胺酮,记忆力仅术后一天较低,以后恢复。文献报道反复应用小剂量氯胺酮可引起认知功能障碍〔5〕,单次使用可能仅引起极短期的认知减退。

研究表明中枢胆碱能神经系统在学习和记忆功能中起主要作用,分布于海马结构中的胆碱能纤维与学习和记忆密切相关〔6〕,许多年龄相关的认知障碍都有海马胆碱能系统活力下降,ChAT是中枢神经系统合成Ach过程中重要的酶,研究中采用免疫组化技术观测了海马CA1区ChAT的变化,结果发现POCD模型大鼠海马CA1区ChAT阳性细胞数目增多,而研究表明海马ChAT阳性神经元减少与大鼠痴呆发生密切相关〔7〕。造成此结果有两种可能因素,一是由于机体为防止轻度认知功能障碍加重并转化为永久性痴呆而导致海马CA1区ChAT活性上调〔8〕。另一种因素,可能是POCD大鼠的胆碱能神经进行了代偿性机能上调,但这种变化与认知功能的具体关系机制还有待进一步研究。

石杉碱甲生物碱是从蛇足石杉中分离得到的一种新生物碱,是一种高效可逆的胆碱酯酶抑制剂,其改善、促进学习、记忆过程的作用已有定论〔2〕。研究〔9〕表明,石杉碱甲对成年、老年啮齿类动物及老年猴有促智作用,石杉碱甲改善学习、记忆的作用呈典型的钟形量效关系,剂量过大则损害记忆功能。给予石杉碱甲0.01~0.50mg·kg-1·d-1,均能明显增强实验动物的学习、记忆功能。因此选择石杉碱甲灌胃,0.15mg·kg-1·d-1,为确保疗效连续用药3w〔10〕。超级秘书网

乙酰胆碱是脑内广泛分布的重要神经递质,主要参与记忆与认知功能。老年大鼠的皮层胆碱能神经网络密度降低,在非病理性老化中都不同程度存在脑中乙酰胆碱生成和释放的减少,因此全麻手术后早期谵妄好发于老年大鼠。本实验结果提示石杉碱甲的干预稳定了海马胆碱能系统,改善了POCD模型大鼠的学习记忆的功能。

综上所述,老年大鼠脾切除手术后早期可发生认知功能障碍,并在术后3d左右达高峰,以后逐渐恢复,单次使用氯胺酮仅引起极短期的认知减退,预先给予石杉碱甲能够减轻大鼠学习记忆能力的损害。

【参考文献】

1SchmidtRH,ScholtenKJ,〔J〕.Neurotrauma,1999;16:113947.

2TangXC.HuperzineA(shuangyiping);apromisingdrugforAlzheimer′disease〔J〕.ActaPharmacologicaSinica,1996;17(6):481.

3胡镜清,温泽淮,赖世隆.Morris水迷宫检测的记忆属性与方法学初探〔J〕.广州中医药大学学报,2000;17:1179.