微生物培养方法范文第1篇

关键词：微藻　污水净化　生物柴油

引言

在化石燃料日益枯竭、环境污染逐渐威胁人类生存的今天，清洁的可再生能源开发成为各国研究的重点。生物质能是绿色植物通过光合作用将太阳能转化为化学能而贮存在生物质内部的能量，它是世界各国都在重点研究开发的可再生能源之一。生物柴油作为较成功的替代型燃油，目前在世界各国得到了大力发展，已成为国际上发展最快、应用最广的环保型可再生能源。然而，制约生物柴油产业化生产的主要问题是成本高，据统计生物质柴油制备成本中75％是原料成本。因此，寻求充足而廉价的原料供应及提高转化率从而降低生产成本是生物质柴油能否实用化的关键。微藻作为最低等的、自养的放氧植物，种类繁多、分布广泛。研究发现，部分微藻中含有相当可观的油脂类物质，可以直接提取微藻油，可用来生产生物柴油。与其他油料作物相比，利用微藻培养生产生物柴油占地面积最小，还可利用滩涂地、荒废地等非耕地，不会对粮食作物的生产造成威胁。因此，利用污水培养能源微藻，在净化水质的同时实现清洁能源生产，缓解人类面临的水资源短缺和环境污染问题具有重要的现实意义。

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微藻生物柴油研究现状

1.1　国外微藻生物柴油研究现状

世界上以发展生物柴油产业为目的进行大规模利用微藻制取生物柴油的研究始于20世纪70年代末。1978年，美国能源部国家可再生能源实验室(NREL)启动了利用微藻生产生物柴油的水生生物种计划项目(Aquatic Spices Program，简称ASP项目)，进行从微藻筛选、微藻生化机理分析、工程微藻制备到中试研究。该项目持续到1996年，研究人员经过多年的研究，从美国西部地区和夏威夷采集、分离到了3000株微藻，并从中筛选出300余株具备潜力的产油藻种，对其中生长速度快、油含量高的微藻，进行了中试放大，获得工程微藻，含油量达到40％～60％。从1990年～2000年，日本国际贸易和工业部启动了“地球研究更新技术计划”的项目，利用微藻进行二氧化碳生物固定，并着力开发密闭光合生物反应器技术，通过微藻吸收火力发电厂烟气中的二氧化碳来生产生物质能源，筛选出多株耐受高二氧化碳浓度、生长速度快、能形成高细胞密度的藻种，建立了光合生物反应器的技术平台以及微藻生物质能源开发的技术方案，提出了利用绿藻将二氧化碳转化为石油的设想。

进入21世纪，石油价格的大幅上扬极大的刺激了微藻生物柴油技术的研究。2006年，美国绿色能源科技公司在亚利桑那州建立了可与1040兆瓦电厂烟道气相联接的商业化系统，成功地利用烟道气的二氧化碳，大规模利用光合成培养微藻，并将微藻转化为生物柴油，其产率达到5000～10000加仑／年・英亩。2007年，由美国能源部圣地亚国家实验室联合美国国内多家实验室宣布了由国家能源局支持的“微型曼哈顿计划”，计划在2010年实现微藻制备生物柴油的工业化。同年，Shell公司与美国从事生物燃料业务的HRBiopetroleum公司组建Cellena合资公司，投资70亿美元开展微藻生物柴油技术的研究。美国第二大石油公司Chevron与美国能源部可再生能源实验室协作研究微藻生物柴油技术。美国PetroSunDrilling公司不断完善其开放池系统，计划到2010年达到年产生物柴油500万吨。美国能源局计划在各项技术全面进展的前提下，将微藻产油的成本于2015年降至2～3美元／加仑。2007年，荷兰AlgaeLink公司成功开发出了新型微藻光生物反应器系统。

1.2　国内微藻生物柴油研究现状

随着生物柴油开发的兴起，我国一些科研机构及企业也开始关注产油微藻的研究和开发，在利用微藻制备生物燃料的研究上也取得了很大进展。2004年，清华大学生物技术研究所缪晓玲教授利用异养生长(利用外加的葡萄糖生长)的产油小球藻进行了密闭培养、提油和生物柴油加工研究，在技术上证明是可行的。通过异养转化细胞工程技术获得了高脂含量的异养小球藻细胞，其脂含量高达细胞干重的55％(质量分数)，是自养藻细胞的4倍，并利用酸催化醋交换技术一步得到符合ASTM的相关标准的生物柴油。清华大学还开发了微藻异养发酵生产生物柴油技术。通过细胞控制技术获得异养小球藻，其细胞中油脂类化合物大量增加，蛋白质含量下降。实验室研究结果表明与常规制备技术相比，成本下降5～8倍，油脂质量分数达99％以上。

中国科学院所属相关单位承担过多项国家及省部级微藻育种和生产的研究，培养了一支经验丰富的微藻生物技术研发队伍。在产油微藻的研究方面，目前已有水生生物所、武汉植物园、过程工程研究所、南海海洋所、青岛海洋所等单位开展了选种、育种、大量培养、收集和提油等研究，并积极开展与我国大型石油化工企业的合作，试图开辟适合我国国情的微藻生物柴油产业化道路。目前微藻生物柴油生产正由实验室转向小规模工厂化生产。中国水产科学研究院、中科院海洋研究所等单位于2005年以来，经过2年来的努力，建立了化学法和脂肪酶法生产生物柴油关键技术与工艺路线，生物柴油的纯度达到98％以上，并对海藻油脂的制备进行了研究。此外，山东海洋工程研究院、抚顺石化研究院均已开展微藻利用的探索，在微藻筛选和培育方面进行了深入研究，目前都已取得一定的成果。闵恩泽院士近年来进人绿色化学领域，积极倡导开展微藻生物质燃料的研究，2009年，中石化与中科院的合作项目“微藻生物柴油成套技术”正式启动。阂恩泽院士指出：从微藻转化为生物柴油的过程中，微藻是基础，光反应器是转化关键，要自始至终加强战略研究。中国科学院与中国石化合作开发的微藻生物柴油技术，近期内将要完成小试研究，预计到2015年前后将要实现户外中试装置研发，远期计划将要建设万吨级工业示范装置。

2　利用污水大规模培养微藻生产生物柴油关键技术和方法

2.1　关键技术环节及流程

利用污水大规模培养微藻生产生物柴油技术是一个复杂的系统工程，主要包括能源微藻的筛选与培养技术、藻细胞富集分离与采收技术、藻细胞破碎与油脂提取技术和微藻油脂生物柴油转化技术等四个关键技术环节。

其技术流程如下图所示：

2.2藻株分离与纯化

培养微藻，首先要从天然水体中分离出所需要的“单种”或“克隆”，研究人员根据各自的经验和习惯，创造了各式各样的藻种分离、筛选的方法，最常用的方法有微吸管分离法、水滴分离法、微细吸管法、固体培养基分离法、样品系列稀释法等。

2.2.1微细吸管法

原理：在无菌操作条件下，用极细的微吸管，在显微镜下把目标藻样从一个玻片移到另一个玻片，采用同样的方法反复操作，直到镜检水滴中只有目标单种为止。微吸管分离法容易找到特定的藻种，设备比较简单，但操作技术难度较大，适于分离个体较大或丝状的藻类，如螺旋藻、骨条藻等。

操作过程：在微吸管的顶端套一条长约8cm的医用乳胶管，分离操作时，用手指压紧乳胶管以控制吸取动作。将分离的水样置于载玻片上，在显微镜下把微吸管口对准要分离的藻细胞，放松手指，藻细胞被吸入微吸管；接着把吸出的水滴放在另一载玻片上，显微镜检查水滴中是否只吸到藻细胞，经过如此再反复操作，直至达到单种分离的目的。然后把分离出的藻细胞冲入预先装有培养液的试管内，放在适宜的光照下培养，试管有藻色后镜检，培养为单种的试管，其他不合格的弃掉。

2.2.2水滴分离法

原理：在无菌操作的条件下，把要分离的藻样用微吸管在玻片上滴成大小合适的小水滴，镜检水滴中只有一个要分离的单种，即可冲入试管培养。该分离法的关键是藻样稀释要适宜(稀释至每个水滴约有1―2藻细胞)，水滴大小适宜，以在低倍镜下能看到水滴全部或大部分为宜，并且观察要准确、迅速。

操作过程：用小烧杯装稀释的藻样，将微吸管插入藻样中，提取微吸管，让多余的藻液滴出，然后把管口与消毒过的载玻片接触，即有一个小水滴留在载玻片上。一个载玻片滴3―4滴，间隔一定距离，然后在显微镜下观察。若一个水滴中只有一个需要分离的藻细胞(无其他生物混杂)，即用移液管吸取培养液把该水滴冲入试管中，试管口塞上棉塞，放在适宜的条件下培养。

2.2.3平板分离法

平板分离法也就是固体培养基分离法，作为微藻分离用的固体培养基，是在常规的液体培养基中加入一定量的琼脂(1.0％-2.0％)，并且使其溶解和高温高压灭菌后，通过适当的方法，把要分离的藻样接种在培养基上，通过一定时间的培养，在培养基上长出单个的藻落而达到分离的目的。用琼脂做的固体培养基的分离方法并不适合所有的微藻，大多数的绿藻都可以在这种培养基上生长，从而达到单种分离的目的，但有的微藻在琼脂培养基上生长较差，甚至不能生长。固体培养基分离法工作较繁琐，工作量大，但分离单种成功的几率较高。

根据接种方法的不同又可分成划线法、喷雾法。划线法是把接种环在酒精灯上灭菌后，蘸取藻样轻轻在培养基平面上做第一次划线3-4条，把培养皿转动约70°角，并把接种环在酒精灯上灭菌，通过第一次划线区做第二次划线。用同样的方法做第三、第四次划线。由于第一次划线接种环上的藻细胞比较多，在第一划区藻细胞可能密集不能分离开，但通过后面的划线可能分离出单独的藻类群落。喷雾法是首先用把要分离的藻样进行适当的稀释，然后装入消毒过的医用喉头喷雾器中，打开培养皿盖，把藻样喷射到培养基平面上，使藻样在培养基表面上形成分散均匀的一层薄水珠。培养基上接种好之后，放在适宜的光照、温度下进行培养，经过一段时间的培养，在培养基上长出藻类群落，通过显微镜检查后，用纤细的解剖针把单个的目标藻落连同一小块培养基取出，移入装有培养液的试管中培养，待试管中有藻色后镜检，如无其他生物混杂，达到了单种分离的目的。

2.2微藻的规模化培养

2.2.1影响因素

微藻能源利用是以大量的微藻原料的获得为前提的。高密度、高效率、低成本、易放大的培养系统是微藻能源领域的研究重点之一。微藻生长受到非生物因素(包括营养、O2浓度、CO2浓度、光照、温度、pH、盐分、培养液中的有毒成分等)、生物因素(包括真菌、细菌、病毒、及其他生物等的污染)以及操作因素(包括搅拌产生的剪切力、收获方式等)的影响。因此，微藻培养系统的设计，需要充分考虑微藻的生长条件、气候条件(光照、温度、湿度等)、资源情况(土地、水等)、投资成本、运行成本等各种因素。

2.2.2培养方式

目前藻类培养主要包括自养和异养两种方式。微藻的自养培养系统大致可分为两种：即利用开放式户外池塘或封闭式光生物反应器。这两种培养方式的比较如表1所示。开放式户外池塘可以分为跑道式、圆池式和斜坡式等。封闭式光生物反应器包括柱式、管式、板式及一些其它特殊类型。循环跑道式户外池塘是当前微藻商业化养殖最主要的培养系统。

微藻异养培养，可采用传统的发酵装置进行培养，不需要光照，生长速度快，可缩短培养周期。但异养培养微藻不仅不能固定CO2，反而会排放出CO2，还需要外加有机碳源，培养成本高，失去了自养培养的优点，难以在实际生产中获得竞争优势。

2.3微藻的分离采收

微藻采收是微藻规模化培养和工业化应用的重要环节，然而，由于微藻及其培养液的特殊性，传统的固液分离技术都无法直接用于微藻采收。因此，国内外针对微藻的采收一般都先对藻液进行预处理，而后再进行富集分离。

2.3.1藻液预处理

微生物培养方法范文第2篇

【关键词】

微生物限度检查法；验证试验

板车消炎颗粒由板蓝根、车前草等中药制成，具有清热解毒功效，用于病毒性感冒、扁桃腺炎、流行性腮腺炎等。《中国药典》2010年版规定，建立药品的微生物限度检查法，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。本文按《中国药典》2010年版的要求就板车消炎颗粒的微生物限度检查法进行验证试验。

1 仪器与试药

SW-CJ-1F净化工作台(苏州净化设备厂)；电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；大肠埃希菌［CMCC(B)44 102］，金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］，枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63 501］，白色念珠菌［CMCC(F)98 001］，黑曲霉［CMCC(F)98 003］(中国药品生物制品检定所)；营养肉汤培养基，改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，胆盐乳糖培养基，4-甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基，营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基(北京三药科技开发公司)；蛋白胨(广东光华化学厂有限公司)；氯化钠(广东台山市新宁制药厂)；磷酸氢二钠(广州化学试剂厂)；磷酸二氢钾(广东台山粤侨试剂塑料有限公司)；聚山梨酯80(北京市海淀会友精细化工厂)；板车消炎颗粒(本院制剂室，批号：20101018，规格：每袋10 g)。

对细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基和控制菌检查用的培养基进行了适用性检查，均符合规定。

2 方法与结果

2.1 供试液制备 取本品10 g，加pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 ml，振摇，制成1：10供试液。

2.2 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30℃~35℃培养24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1 ml含菌数为50~100 cfu的菌悬液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，20℃~25℃培养48 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1 ml含菌数为50~100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7 d，加入5 ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1 ml含孢子数为50~100 cfu的孢子悬液。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.3.1 试验组 取供试液1 ml,加入到1个平皿中,平行制备10个平皿,分别加入已制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1 ml(含50~100 cfu),每种菌平行制备2个平皿,含金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的平皿倾注营养琼脂培养基,置30℃~35℃培养3 d,计数；含白色念珠菌、黑曲霉的平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23℃~28℃培养5 d，计数。

2.3.2 菌液组 分别取已制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1 ml(含50~100 cfu),加入到1个平皿中,各制备2个平皿。培养基、培养时间、温度、计数同2.3.1。

2.3.3 供试品对照组 取供试液1 ml,加入到平皿中,平行制备4个平皿。2个平皿倾注营养琼脂培养基，另2个平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基。培养时间、温度、计数同2.3.1。

2.3.4 稀释剂对照组 取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1 ml，加入到1个平皿中,平行制备10个平皿,分别加入已制备好金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1 ml(含50~100 cfu),每种菌平行制备2个平皿。培养基、培养时间、温度、计数同2.3.1。

各试验菌分别进行3次独立的平行试验，计算每次试验的回收率。稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分数)和试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分数)均应不低于70%。结果见表1。

2.4 控制菌检查方法的验证 取供试液10 ml及1 ml已制备好的大肠埃希菌菌液(含50~100 cfu)加入100 ml胆盐乳糖培养基中，置于30℃~35℃培养18~24 h,按大肠埃希菌微生物限度检查法进行检查［1］。共进行3次独立的平行试验，结果见表2。

3 讨论

板车消炎颗粒微生物限度检查的验证试验显示其可按常规法进行检查。

《中国药典》从2005年版起增加了微生物限度检查方法验证试验的要求，本文按《中国药典》2010年版的规定进行验证。微生物试验的结果易受试验条件的影响，在进行微生物限度检查时，应保证在检验条件下的药品浓度不足以抑制污染微生物的生长，因此任何药品的微生物限度检查法均需验证，确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查［2］。

参 考 文 献

微生物培养方法范文第3篇

传统的功能微生物鉴定方法是在含有特定碳源培养基上对目标微生物进行富集、分离与纯化，由于实验室可培养的微生物只占微生物总数的0.1~1%[1]，因此以纯培养技术为代表的鉴定方法存在很大局限性。20世纪后半叶，以分子生物学为特色的现代土壤微生物研究方法取得突破性进展，包括以磷脂脂肪酸（PLFA）技术为代表的生物化学方法，以BIOLOG技术为代表的生理学方法和基于DNA多态性的微生物群落结构和功能多样性的分子生态学技术，如变性梯度凝胶电泳（DGGE）、限制性片段长度多态性（RFLP）、末端限制性酶切片段长度多态性分析（T-RFLP）和实时荧光定量PCR技术（RT-PCR）等。上述技术提高了人们对土壤微生物群落结构组成的认识，但仍难提供有关微生物间相互作用及代谢功能微生物的直接信息[1-2]。例如，DGGE和T-RFLP等分子指纹图谱方法只能检测环境样品中的优势微生物群落，但具有特定生态和环境功能的微生物通常在数量上并不占优势[3]。因此，功能微生物很难被这些分子指纹图谱方法所鉴别[2]。据估算，每克土壤含有约100亿个微生物个体，包括100万种不同的微生物种群。利用上述技术，从这些难以计数的土壤微生物中原位鉴别特定生态过程的微生物驱动者是难以想象的[4]。近年来得到广泛关注的稳定性同位素探针技术与现代分子生物学相结合，可以在相对未受干扰的环境样品中培养功能微生物，利用稳定性同位素示踪复杂环境中的功能微生物核酸（DNA/RNA）或PLFA[5]，在分子水平鉴定生态系统重要过程的微生物驱动者。其基本原理是在土壤中添加含有稳定性同位素标记的代谢底物，土壤中利用该标记底物的微生物细胞在其生长繁殖过程中同化合成含标记元素的生物标志物。通过对生物标志物进行提取、分离、鉴定和比对分析，鉴别土壤中驱动特定生态过程的功能微生物。该方法可以准确获得功能微生物的目的基因，避免了从浩瀚基因库里一个个筛选目的基因的烦劳工作，已成为原位鉴定功能微生物的重要手段。 1土壤功能微生物SIP鉴定技术流程 SIP技术是耦合微生物遗传多样性与代谢多样性最有力的工具之一，该技术以复杂的原位或微宇宙土壤样品为研究对象，采用稳定性同位素原位标记土壤样品定微生物的DNA、RNA或PLFA。目前绝大多数研究采用13C标记底物培养土壤，利用13C-底物的微生物细胞不断分裂、生长、繁殖，合成含13C标记的DNA或RNA等生物标志物。提取土壤样品中13C-核酸和12C-核酸总混合物，用超高速离心技术将13C-核酸与12C-核酸分离，利用分子生物学手段对生物标志物进行分析，以鉴别土壤功能微生物。近年来，以15N和18O为基础的SIP技术也被成功应用于微生物驱动的土壤生态过程研究[6]。 1.1土壤SIP技术前处理方法选择 SIP技术前处理包括标记底物的培养和特定微生物核酸或磷脂脂肪酸提取两个步骤。培养方式主要包括添加营养液富集培养和仅添加标记底物培养等方式。添加营养液富集培养法可以为微生物生长提供相对稳定的环境，并促进微生物的生长，以获得足够的核酸或磷脂脂肪酸提取量[7]。土壤DNA/RNA的提取方法主要包括试剂盒提取法和液氮研磨法等。试剂盒法操作简单，提取纯度高，但提取量较低，费用高。液氮研磨法可以较好保证DNA/RNA的完整性，提取量相对较高，且操作费用低，时间短，但需纯化后才能满足RT-PCR等后续分子生物学要求[8]。土壤PLFAs提取方法主要为两种：一种是PLFAs法，即先通过氯仿-甲醇单相萃取浸提土壤微生物脂肪酸，再经硅胶柱纯化以及酯化作用得到活体细胞膜结合态FAME，提取的脂肪酸种类仅有El-脂肪酸，多为细菌所特有。另一种是TSFAMEs法，即通过碱甲醇分解法提取总土壤FAMEs。提取的脂肪酸种类包括酯连接和非酯连接PLFAs，多为真菌所特有[9]。 1.2土壤SIP技术中生物标志物的选择 土壤SIP技术定微生物的生物标志物为PLFA、DNA和RNA3种。PLFA-SIP法是将PLFA从重稳定性同位素（如13C）标记过的环境样品中提取出来，通过PLFA图谱分析微生物群落的结构和多样性，再通过气相色谱-燃烧-同位素比率质谱联用法测定各种PLFA中13C的丰度[7]。PLFA-SIP的标记底物浓度要求较低，灵敏度较高，但存在一些缺点：（1）对于未知PLFA分子图式的不可培养微生物，或者土壤中的某种特殊脂肪酸无法与特定种类的微生物相对应，该方法就无法鉴定功能微生物。（2）该方法在很大程度上依赖于标记脂肪酸来确定土壤微生物群落结构，标记上的变动将导致群落估算上的偏差。（3）细菌和真菌生长条件的改变或环境胁迫都能导致脂肪酸类型的改变[9]。同PLFA-SIP法相比，DNA-或RNA-SIP可获得更直接的功能微生物遗传信息。DNA-SIP的优点是：标记的13C-DNA一定来自新产生的子代微生物细胞，是证明微生物原位生长并驱动生态过程的最直接证据。另外，DNA完美的双链结构保证了遗传物质的稳定[10]。DNA-SIP的缺点是：自然环境中能被微生物利用的底物浓度通常很低，微生物大量分裂繁殖的可能性低，常需使用较高浓度的标记底物来刺激目标微生物的分裂繁殖，可能导致研究结果与原位自然环境的实际情况不相吻合[6,11]。RNA-SIP在一定程度上能克服上述缺点。自然环境定功能微生物发挥作用的同时，即使没有大量增殖生长，但具功能基因得到表达并在核糖体内合成蛋白质，获得标记的13C-RNA则表明微生物可能具有较强的活性。因此，RNA-SIP能够采用更低的标记底物浓度培养环境样品，研究结果更接近原位状况[12]。但因mRNA半衰期短、降解速度快，mRNA-SIP的实际应用仍存在较大的技术难度[13]。DNA-SIP和RNA-SIP的结合将会大大提升SIP技术的潜力。 1.3土壤SIP分离后的分析方法 13C-核酸与12C-核酸分离后，可以利用分子生物学手段对功能微生物的DNA/RNA进行分析，以鉴别土壤中重要生态过程的微生物驱动者。目前的主要分析方法包括分子指纹图谱法、实时定量PCR法和454高通量测序法等。（1）分子指纹图谱法是目前进行功能微生物的DNA/RNA分析的广泛使用的快捷方法，但分子指纹图谱分析方法的灵敏度较低。环境样品中微生物通常数以百万计，采用古菌或细菌通用引物的DGGE和T-RFLP只能检测环境样品中数量上占优势的微生物[14]。具有较为重要的生态和环境功能目标微生物通常在数量上不占优势。因此，目标微生物同化利用13C-底物后发生的微小变化很难被分子指纹图谱法所鉴别。（2）实时定量PCR法直接针对目标微生物的功能基因，采用高度灵敏的实时定量PCR测定不同密度层级中目标微生物的数量，显著提高了SIP技术的可靠性。然而，采用特异引物定量研究目标微生物存在一定难度。土壤中数量众多的微生物基因组DNA可能被13C标记，很难采用单一的功能基因或16SrRNA基因特异引物，同时研究众多目标微生物在不同密度层级中的分布规律。我们无从得知哪一种微生物可能利用稳定性同位素标记底物，无法设计特异的功能引物，只能通过选择性定量目标微生物，明确目标微生物在不同密度层级中的分布规律，同时判定SIP技术的可靠性[13，15]。（3）454高通量测序法是通过检测各浮力密度层中微生物16SrRNA基因组成，分析目标标记微生物占该层总微生物的比例，从而鉴别前所未知的重要功能微生物。该技术可规避PCR扩增，直接对标记13C-RNA测序，每次分析可获得大约100万16SrRNA基因序列，显著增强了重浮力密度层中13C-标记微生物DNA序列的检测灵敏度。高通量测序可全面分析微生物群体的物种、基因功能组成，最大程度地认识未培养微生物的遗传组成和生命活动，是目前最准确的方法[16]。但该方法目前测试费用较高，后续数据处理复杂，但随着技术发展必将成为功能基因组学研究的主流技术。#p#分页标题#e# 1.4构建克隆文库 超高速密度梯度离心分离并鉴别13C-DNA/RNA后，通常采用建立基因克隆文库，构建遗传系统发育树的方法分析13C-RNA和12C-RNA的微生物群落组成，并比较二者的差别，鉴定被13C底物所标记的微生物群落。 2SIP技术在土壤功能微生物鉴定中的应用 目前SIP技术在土壤分子生态学研究领域主要应用在原位鉴定介导有机污染物生物降解和碳氮循环过程的功能微生物方面。有机污染物生物降解研究多集中于单环芳烃、PAHs和PCBs的研究，碳氮循环研究多集中于植物-微生物相互作用对陆地生态系统中碳氮转化、土壤中碳氮周转速率、稻田产甲烷机理及产甲烷菌的研究。 2.1SIP技术在土壤有机污染物生物降解研究中应用 在有机污染物生物降解的微生物生态学研究中，SIP技术可以帮助了解在复杂原位土壤环境中，参与各个降解过程和途径中功能微生物种类。Hanson等首次使用PLFA-SIP技术研究甲苯的生物降解，总共提取发现的59种PLFAs中有16种出现13C标记[17]。Christopher等在对农田土壤中苯酚降解菌的研究中，对13C标记苯酚的DNA进行18S-28S内转录间隔区的PCR扩增，T-RFLP分析，成功分离出一种白色细状的真菌，并证实该真菌能加速苯酚的降解[18]。Sueoka等[19]利用RNA-SIP技术对13C标记苯酚的RNA反转录PCR和T-RFLP分析，新发现了3种苯酚降解菌。罗春玲、Xie等[20-22]利用DNA-SIP技术研究了甲苯、苯和间二甲苯的降解菌，对分离出的13C-DNA进行T-RFLP分析、克隆文库的构建，获得了相应的降解菌，并首次报道了TM7门对甲苯具有降解作用。Woods等使用H218O-DNA-SIP技术鉴定甲苯退化细菌，鉴定出一株已知的甲苯降解菌RHA1[23]。Padmanabhan等在Collamer地区的田间试验中，向受试的粉砂壤土供应13C标记的葡萄糖、咖啡因、萘和苯酚，通过GC/MS监控土壤中释放的13CO2浓度，以此估测底物降解速率，并将分离得到13C-DNA用通用引物对16SrRNA基因进行PCR扩增，最终得到29个完整的DNA序列[24]。Maiysha等利用DNA-SIP技术，研究了土壤中具有降解萘、菲和芘等6种多环芳烃功能的微生物群落，将13C作为标记元素，构建13C-DNA的16SrRNA克隆文库和RT-PCR分析，结果表明不可培养菌PG2不仅可以降解芘，还能降解荧蒽和苯并[A]蒽，从而说明PG2菌对四环PAHs有着良好的降解效果[6]。Tillmann等设计了一个PLFA-SIP微宇宙实验，将PCBs高度污染土壤暴露于13C-2,-2′-二氯联苯中，采用GC-C-IRMS测定不同PLFA13C的丰度，结果表明非优势菌在PCBs好氧降解过程中的主导作用[25]。Shahid等在对五氯酚降解菌的研究中，比较了DNA/RNA-DGGE和DNA/RNA-SIP-DGGE技术的鉴定效果，结果表明RNA-SIP技术可以更好反映功能微生物群落的变化趋势[11]。Sul等将DNA-SIP和宏基因组技术结合，对13C-联苯-DNA中芳烃双加氧酶基因片段PCR扩增，得到两串与bphA相似的序列组，构建1568粘粒克隆文库，发现除含bphAE基因外，还含有属于γ-变形菌纲的未知基因片段，该片段的G+C含量和bphAE相近，可能由于bphAE基因水平转移而形成的[26]。 2.2SIP技术在土壤C循环中的应用 土壤C转化是微生物主导的生物地球化学过程，SIP技术能够很好地将微生物群落与其功能联系起来，加深人们对陆地生态系统重要C循环过程的认识。Boschker等最先使用PLFA-SIP技术进行甲烷营养菌的研究[7]，随后，DNA-SIP技术被用于研究土壤中甲烷氧化菌的活种群。Hutchens等在微宇宙中用13CH4对取自罗马尼亚MovileCave地下水系统的样品进行短期培养，以DNA-SIP技术为前提确定了3类含有编码甲烷单氧化酶基因的甲烷营养菌，并通过与非甲烷营养菌比对证明了交叉取食的存在[27]。Cebron等在研究养分添加对甲烷营养菌多样性的影响时，人工添加养分在一定程度上可避免交叉取食，改进了DNA-SIP方法[28]。Bengtson等研究了松树林土壤中的甲烷营养菌群落结构组成与CH4氧化率的联系，并简短讨论了DNA/RNA-SIP的局限性[29]。Borodina等用DNA-SIP法考查了英国不同陆地生态系统土壤中氯化甲烷营养菌的多样性，通过与培养分离法的结果比较，揭示出土壤中仍存在大量不可培养的卤化甲烷营养菌，并将卤化甲烷的全球循环同一组目前已知的卤化甲烷营养菌特征群联系了起来[30]。Radajewski等最先使用DNA-SIP技术进行甲醇营养菌的研究，通过13CH3OH培养森林土壤，证明被13C标记的细菌16SrRNA基因序列与已知可培养的甲醇营养菌及嗜酸甲烷氧化菌相似，首次表明此类细菌还存在于森林土壤中[6]。Feng等利用DNA-SIP技术证明了稻田土壤中，甲酸盐中的C首先被光营养的初级和次级生产者利用，随后产生的有机物被其他微生物利用[31]。陆雅海等用13CO2对水稻进行脉冲标记培养，利用RNA-SIP技术与T-RFLP分析，获得水稻根际的产甲烷菌，并通过厌氧和好氧条件的对比，表明根际环境和降解过程的多相性[32，13]。该团队还利用PLFA-SIP描述了水稻根际微生物活性的空间变化，提出在根际革兰氏阴性菌和真核微生物在同化根派生碳过程中最活跃，同时描述了围绕根际的活性群落的空间系统变化[9]。 2.3SIP技术在土壤N循环中的应用 15N作为生物体内大分子合成的组成元素，可结合SIP技术研究土壤中氮循环过程的各类微生物功能群及其相互作用。Georg等利用标记和未标记的N进行纯微生物培养，结果显示15N-DNA-SIP技术是可行的，但存在一定局限性，如可视条带需要大量的DNA，15N-DNA的理想丰度要求大于50%等[33]。Buckley等通过改变基因G+C含量来增加15N-DNA的浮密度，增加了15N-DNA的分离强度，为原位追踪利用N的微生物群落提供了新的研究方法，并采用15N2-DNA-SIP原位鉴定了独立生存的固氮微生物，通过分析15N标记DNA的16SrRNA，发现了3组新固氮微生物[34-35]。贾仲君等采用SIP技术示踪农田土壤氨氧化微生物DNA，发现相对于古菌，细菌是土壤硝化过程的主要驱动者[36]。贺纪正等对农田土壤生态系统中氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）进行一系列研究，得出二者在根际土壤中的丰度、组成对环境的响应占主导作用[37]，并发现土壤中硝化作用伴随着古菌amoA的基因丰度和多样性变化，进一步证明了氨氧化古菌可同化CO2，属于自养型微生物[38]。Jennifer等结合RNA-SIP和DNA-SIP技术，再次证明AOA可通过两种途径固定CO2，并在泉古菌（Crenarchaeota）中得到验证，进而强调了AOA在硝化和CO2固定过程中的重要性[39]。Karen等以北美黄松林为研究对象，应用H218O-SIP技术调查土壤中氨氧化微生物的生长与死亡情况，发现人工添加氨可刺激AOB的生长，与此同时AOA的死亡数量增加，而AOB则不受影响[40]。Ishii等在研究N2O在水稻土中的消减过程时，用13C标记的琥珀酸盐作为电子供体，鉴定了同化琥珀酸盐的微生物，指出大多数N2O消减微生物属于草螺菌属和固氮螺菌属。并证明前者消减速度大于后者，在水稻土N2O的减少过程中发挥重要作用[41]。#p#分页标题#e# 3研究展望 SIP技术能有效降低环境微生物群落分析的复杂度，获得功能微生物的目的基因，已成为原位分离功能微生物的重要手段。随着新一代454高通量测序技术的发展，SIP技术可最大程度地认识不可培养微生物的遗传组成和生命活动，获取其功能基因，优化并人工合成在原位环境中具有高效同化或降解作用的新基因。结合土壤化学等方面知识，共同探讨土壤环境中功能微生物的代谢途径和同化过程，挖掘微生物基因资源，鉴别土壤关键元素循环的微生物驱动机制等，将是未来研究发展的热点和重点。

微生物培养方法范文第4篇

关键词：药品；微生物限度检验；误差

在药品微生物限度检验工作中，由于受到药物自身性质、操作环境的影响，因此误差几乎是不可避免的，其中单因素占百分之二十五，多因素占百分之七十五，因此加强检验环境管理，降低`差率的发生，是相关研究人员应该考虑的问题，本文将立足于药品微生物限度检验的要求，深入研究影响药品微生物限度检验的因素，以供相关从业人员借鉴学习。

1 培养基的影响与控制方法

培养基是药品微生物限度检验的重要环节，因此会对药品微生物限度检验结果产生一定的影响，如果培养基的质量不稳定，或者没有按照使用条件进行配制与存放，都会导致药品微生物限度检验的误差，因此，为了确保药品微生物限度检验的准确性，需要加强培养基的质量检验，在灵敏性与有效性上评估培养基的使用效果。

1.1 已知菌对照试验

使用已知菌对照试验，是对初购的培养基进行质量检验的重要方式，一方面，已知菌对照试验，能够直观的检测出培养基的灵敏度。其次，已知菌对照试验的使用灵活，可以检验要求，使用不同的已知菌进行对照试验，从而通过培养基的反应结果，测定培养基是否适合进行药品微生物限度检验，减少药品微生物限度检验误差的产生。[1]

1.2 酸碱度测定

酸碱度测定也是减少培养基不良影响的重要方法，药品微生物限度检验的项目非常多，这是因为不同的细菌适宜生长的环境有所差异，因此为了确保培养基能够满足药品微生物限度检验的要求，必须对其进行酸碱度测验，可以使用盐酸来测验培养基内的PH值，如果培养基的PH值显示弱碱性，需要使用氢氧化钠进行调节，才能确保培养基的使用效果。此外，相关工作人员在调节过程中，需要耐心的操作，逐渐加氢氧化钠，以防止过量的情况发生。在进行培养基实验之前，相关研究人员也应该测试培养基的酸碱度，以防培养基内的酸碱度低于药品微生物限度检验最终要求。

1.3 制备后应该及时灭菌

此外，为了提高药品微生物限度检验的准确性，相关研究人员应该按照相关规定，对培养基进行灭菌工作，以免影响到后续的微生物限度检验工作。许多研究人员为了方便，对所有的实验对象都进行低温处理，从而达到灭菌的效果，虽然低温灭菌是一种高效的灭菌方式，并且在大多数的实验中都适用，但还是由部分细菌在低温时还能存活，因此研究人员应该在灭菌之前，先增加培养基内的酸碱度，然后用供试品稀释，确保培养基内的细菌都能受损或者致死，在实验之前，相关工作人员也应该使用高倍显示镜，来观察培养基内的情况，确保培养基内的环境适合药品微生物限度检验。[2]

2 设备的影响以及控制方法

在药品微生物限度检验过程中，使用到的设备较多，包括温度计、玻璃容器、培养箱、容量仪器，因此加强设备的管理，是减少药品微生物限度检验的重要途径。

2.1 计数误差

计数误差是药品微生物限度检验误差最常见的形式，造成这种现象，有主观原因，也有客观原因。主观原因是相关研究人员的疏忽，或者违规操作造成的，在细菌鉴别的过程中，需要按照一定的流程进行操作，并且为确保实验环境的纯净，需要事先对玻璃容器与容量容器进行消毒处理，确保容器内没有抑菌物质，由于专业素质的不足，经常会发生实验流程上的失误，从而导致计量误差，对药品微生物限度检验结果产生了不良影响。客观原因是因为菌落生长小而密集，这在一定程度上给计数工作提出了一定的难度，同时，随着培养时间的延长，菌落还会在边缘生长，这些客观原因都会导致计数误差的产生。[3]

2.2 控制方法

为了方便微生物菌落的鉴别，可以通过增加稀释液的方式，这样不仅有利于菌落的计数，还有利于菌落的对照试验。对于一些难以计数的菌落，相关研究人员可以适当的延长培养时间，从而增加细菌菌落，为了防止菌落沿着培养基的边缘生长，可以加入TTC营养琼脂，从而保证菌落与培养皿中的颗粒、沉淀物分开鉴别。

3 无菌室方面造成的误差

药品微生物限度检验通常在无菌室进行，一方面，是为了减少不可控因素的影响，提高药品微生物限度检验的准确性。另一方面，无菌室内部的洁净情况，还会直接影响到灭菌消毒的有效性，因此加强无菌室的检查，能够有效的减少药品微生物限度检验中的误差。

3.1 定期检查无菌室的空气质量是否达标

为了保证无菌室的洁净性，通常都采用臭氧消毒器来消毒，虽然臭氧消毒器具有良好的消毒效果，但还是难以保证无菌室的空气状况，因此相关工作人员应该定期检查无菌室的空气情况。[4]

3.2 严格无菌操作

在药品微生物限度检验操作之前，相关研究人员应该使用琼脂培养基放置在工作面的周围，并观察培养基内的情况，如果培养基显示无菌室的空气质量不达标，应该立即停止实验，待无菌室内部的情况满足药品微生物限度检验的要求。

4 结束语

综上所述，要减少药品微生物限度检验中的误差，需要从培养基、设备、无菌室三个方面入手，并采取有效的控制方法，使药品微生物限度检验安全、有序的进行。

参考文献

[1]陈伟盛，关倩明，朱荣峰，等.药品微生物限度检查中微生物污染的鉴定和溯源分析[J].药物分析杂志，2014，01：58-63.

[2]廖晓玲，张贞良，范积平，等.“《医疗机构制剂许可证》验收标准”有关条款难点探讨[J].中国药房，2016，13：964-966.

[3]张新妹，胡昌勤，王淑兰.欧洲药典附录2.6.12非无菌产品的微生物限度检查之一（有活力的需氧菌总数的计数）[J].中国药品标准，20

微生物培养方法范文第5篇

【关键词】无菌检查；试验；策略

无菌检查法系指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一种方法[1-2]。无菌 （asepsis） 物体中无活的微生物存在，称为无菌。我国开展药品无菌检查和微生物限度检查已有数十年的历史。新中国第一部药典（1953年版）收载了无菌检查法，以后每部进行了不断的修订和完善，从样品的取样量到培养时间的变化都更加的科学，合理[3-4]。本文对无菌检查试验的存在的问题进行介绍并提出应对策略。

1.无菌检查试验的先天缺陷

1.1采样

由于没有从统计学的角度考虑采样，使无菌检查试验检测污染物的能力受到限制，出现错误结果的可能性很大。有学者从统计学角度分析发现污染率越低对污染物漏检的可能性越大。由于不可能对一批成品的每一包装单位进行检测，所以药品生产者必须遵守GMP进行生产。无菌生产工艺的验证、良好厂房设计、员工的培训，才能取得高水平的无菌保障[5]。

1.2培养条件

研究表明，药典规定的微生物培养条件并不是许多细菌和真菌的最适生长条件[6]。细菌生长在二十五摄氏度到四十摄氏度之间，真菌生长在二十五摄氏度到三十摄氏度之间，而药典规定在二十摄氏度到二十五摄氏度下培养。 药典对温度规定的目的是检测环境中的污染菌。美国药典无菌试验专家委员会推荐25～30℃为细菌、酵母菌和霉菌的培养温度[6]。用不同的培养基检查不同的细菌、酵母菌和霉菌，结果发现， 二十六摄氏度培养真菌和酵母菌10天后，胰酪胨大豆胨肉汤培养基的效率不及蛋白胨肝消化肉汤等培养基[6]。硫乙醇酸盐流体培养基也不适用于苛求厌氧菌的恢复培养[7]。胰酪胨大豆胨肉汤培养基不适用于对苛求微生物的培养。

2.西方国家相应的对策

2.1美国

2012年修订的美国联邦法规21CFR610.12，规定了一个不同于药典描述的无菌检查方法。FDA修订该法规的目的是为了确保生物制品的安全性。21CFR61O.12取消了微生物、培养时间、培养温度、培养基、取样量和采样计划等内容并允许使用非培养的检测方法。

2.2欧洲

欧洲药典的非强制章节“5.1.9无菌试验使用指南”指出，无菌试验合格结果的保证水平取决于批次的均一性、生产条件、采样方法等的有效性；对于最终灭菌产品提供灭菌过程的证据比无菌试验更重要。2007年新载入欧洲药典的“细胞产品的微生物控制”中指的方法可代替无菌检查。

2.3澳大利亚

在2006年的《治疗产品无菌检查指南》中提出了控制无菌检查试验的附加试验一停滞试验。停滞试验目的是要证明使用的培养基在整个培养期是否具有支持生长的能力。《治疗产品无菌检查指南》的原理部分指出：统计学考虑也是无菌检验成功的重要一环；药典无没有对所使用的培养基作具体要求，只是从原则上菌检查方法不利于对低水平污染的检出。

3.对规范我国药品标准中无菌检查试验的思考

3.1应对无菌检查试验做出充分的解释

我国少数药品生产企业的部分从业人员对药品无菌检查试验的原理理解不深，导致无菌检查试验方法不规范。药品监督管理部门对生产企业加强监管的同时，应制订与欧洲药典“无菌试验使用指南”相类似的文件，促进我国药品质量的提高。我国药典没有对无菌检查试验的原理、所起作用等做详细的解释说明。这样导致了部分企业重无菌检查结果，轻质量管理。我国药典或相关法规应以适当方式提示至少注意以下几点：对于最终灭菌的产品提供灭菌过程的证据比无菌检查试验更重要；没有绝对的无菌保证，通过验证很重要；即使整个批次均一，能检测出低水平污染的可能性也是非常小的。

3.2无菌检查方法的制订要考虑生物制品的特殊性

美国、欧洲、澳大利亚的药典或其它法规中，对生物制品的无菌检查方法都另有专门的规定[8-10]。生物制品因为其原料、生产过程、内含成份、具有生物活性等特点，使用单一的无菌检查方法会存在风险[11]。我国也应对生物制品的无菌检查做专门规定，特别在使用培养基和相应培养条件等方面。

3.3抽样方案

国药典规定了不同药物产品的原液、半成品、成品最少抽验数量，没有对抽样方式做具体规定。我国应参考欧洲、美国、澳大利亚的相关规定并结合自身特点，增加对抽样方式的规定。

3.4对培养基的规定

中国药典无菌检查法规定使用2个培养基：硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，用两个培养基完全覆盖所有需要无菌检查的药品并不现实。欧洲药典“细胞产品微生物控制”没有指定培养基，但规定了更严格的培养基促生长性能检查法和基于实践中最可能污染微生物的方法验证。中国应对于某些特殊药品应允许使用经验证的替代培养基。

3.5微生物检验的新技术

应用微生物检验的新技术如生物发光技术、电化学技术、比浊法、固相细胞计数法、流式细胞计数法、脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。微生物检验的新技术与传统的检验方法比较，具有检验简便，速度快的特点，有实时或近实时监控的潜力，能够对生产过程的关键工艺环节作出及时的微生物质量评价，因此在医药行业完全有必要也有可能使用微生物检验的替代方法。采用非药典规定的替代方法进行微生物检验时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。 [科]

【参考文献】

[1]陈秀勤，刘炳茹，乙静平.常见抗生素的无菌检查法最佳冲洗条件的考察[J].中国药品标准，2004（04）.

[2]罗书香.药品微生物限度检查方法验证资料分析[J].中国药事，2007（07）.

[3]许华玉，杜鹃，汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005（04）.

[4]李汶.局部给药制剂的控制菌检查方法概况[J].中国药品标准，2007（03）.

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[8]European Pharm acopoeia 7.0。Volume 1. 2.6.27 M icrobio logical Control of Cellular Products Is].2011：19-192.

[9]Code of Federal Regulations，21CFR610.1 2 Sterility [BE/OL].[2012―04 01].http：//accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/cfrsearch.

[10]Australian Government，Departm ent of Health and Ageing，Therapeutic Goods Administration （TGA）.TGA Guide―lines for Sterility Testing of Therapeutic Goods[BE/（）I ].[2014―2―20]http：//tga.gov.au/docs/html/sterilit.htm.