细胞膜范文第1篇

在细胞膜中每一个磷脂分子头部因含有磷酸和碱基，极性强，是亲水性的；尾部的碳氢链为非极性的，具疏水性。如通过实验将磷脂加入水中，在一定浓度下，磷脂分子相互聚集，亲水性的极性头部朝向水相，而疏水的非极性尾部则避开水向内聚集，从而形成微小的球形磷脂分子团。若继续用超声波处理，则形成不易溶于水且在水相对稳定存在的磷脂双分子层结构。因此，膜中的磷脂分子正如模型中的那样排列。而磷脂分子的这种性质对于构成稳定的膜结构具有重要意义。

结构与功能相统一的观点包括两层意思：一是有一定的结构就必然有与之相对应的功能存在；二是任何功能都需要有一定的结构来完成。

细胞膜的基本结构是：①由磷脂双分子层构成细胞膜的基本支架，这种结构的存在就必然有与之相对应的功能存在——脂溶性物质能够以自由扩散的方式优先通过膜，其他不带电荷的小分子也可以以自由扩散的方式通过膜。②在磷脂双分子层中，镶嵌有蛋白质分子，这一结构的存在，也必然有与之相对应的功能存在——蛋白质可以作为物质运输的载体，从而使膜具有主动运输的功能；糖被的存在，与细胞保护、、识别等功能有关。因此，细胞膜的结构使其具有保护、物质交换、识别、分泌、排泄、免疫等功能；而细胞膜的以上这些生理功能的实现必定有一定的结构来完成，这就是细胞膜磷脂双分子层。

细胞膜的结构特点是具有一定的流动性，细胞膜的功能特性是具有选择透过性，这是两个不同而又有联系的概念。膜的流动性的存在，就既可使膜中各种成分按需要调整其组合分布而利于控制物质进出细胞，又能使细胞经受一定程度的变形不至破裂而具有了保护细胞内部的作用，从而保证了活细胞完成各种生理功能，是细胞膜具有选择透过性这一功能特性的基础；而活细胞的细胞膜具有选择透过性，是细胞生命活动的体现。这种膜可以让水分子自由通过，细胞要选择吸收的离子和小分子也可以通过，而其他的离子、小分子和大分子则不能通过。这样可保证细胞按生命活动需要吸收和排出物质；而物质选择性的透过细胞膜等各项生理功能的实施，又需要细胞膜的流动性这一结构特点来保障，这就是结构特点和功能特性的统一。

将细胞膜的结构与功能的关系概括如下图所示。

[例]有两位科学家做了以下实验（下图）：

①用红色荧光染料标记人细胞膜上的蛋白质；②用绿色荧光染料标记鼠细胞膜上的蛋白质；③把人和鼠的细胞融合，融合后的细胞，一半发红色荧光，另一半发绿色荧光。此细胞在37℃下培养40min后，两种颜色均匀分布在融合后细胞的表面。请分析：

（1）两种颜色均匀分布是由于________________的结果。

（2）这一实验结果，能证明细胞膜具有_________________性。

细胞膜范文第2篇

【摘要】 目前玻璃体视网膜手术在治疗PVR方面取得了巨大成功但是手术并不能完全阻止甚至可能刺激RPE细胞的迁移和增殖，从而导致PVR的复发。RPE细胞是参与PVR形成的一种重要细胞，因此有关药物抑制RPE细胞增殖的研究受到重视，本文综述了近年来影响RPE细胞周期药物的研究进展.展望了通过调控RPE细胞周期来抑制细胞增殖以防治PVR 的前景。

【关键词】 细胞周期

0引言

在病理情况下，视网膜色素上皮（RPE）细胞在多种生长因子、趋化因子及黏附分子等的协同作用下，移行至玻璃体腔内、视网膜下和视网膜表面，重新进入细胞周期，开始增生，分泌一系列细胞因子及细胞外基质，最终形成牵拉性膜，导致牵拉性视网膜脱离。因此，如何通过调控RPE细胞周期来抑制细胞增殖可能是防治PVR 的一种新策略。

1细胞周期及调控

1.1细胞周期 细胞周期（cell piding cycle）[1]指细胞从一次分裂结束开始生长到下一次分裂终止所经历的过程。细胞周期的概念由Howard和Pelc 1951年首次提出，并将细胞周期分为间期（G0）与分裂期，间期包括DNA合成前期（G1期），DNA合成期（S期），DNA合成后期（G2期）；分裂期（M期）又分为前期、中期、后期和末期。Lajtha还提出细胞周期中存在一个G0期，此期细胞不参加细胞增殖，适当刺激后可以重新加入细胞周期开始分裂。各种细胞的周期时间不同，差异主要在于G1期的长短不同，在离体培养条件下可通过控制外在条件使细胞分裂减慢或停止，但无论采用什么手段均停顿在G1期，这表明，细胞一旦通过G1期就注定要完成S、G2、M期。M期所持续的时间较短，一般为30～60min;分裂间期的时间跨度较长，根据细胞的类型和所处的条件不同而不同，有几小时、几天、几周或更长。细胞周期所持续的时间一般为12～32h，人的细胞周期约为24h：分裂期30min，G1期9h，S期10h，G2期4.5h。

1.2细胞周期调控 细胞之所以能够忠实的复制，依赖于细胞周期蛋白（cyclin）对细胞周期蛋白依赖性激酶CDK(cell dependent kinase)的激活和抑制物对它的抑制，以及细胞周期检查点的监控。

1.2.1细胞周期调控因子 ①CDK：CDK是一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要生物学作用是启动DNA的复制和诱发细胞的有丝分裂，以复合物形式出现，该复合物分为催化亚基和调节亚基两部分，催化亚基为CDK，调节亚基为细胞周期蛋白。CDK活性调节方式主要有3种：第1种是磷酸化和脱磷酸化调节，第2种是由调节亚基cyclin起作用，只有与cyclin结合后，CDK才有活性，第3种是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白（CKI）的调节作用。②cyclin：cyclin细胞周期蛋白是一类随着细胞不同时相而发生的蛋白质，主要有5种：A、B、C、D、E，它们能与CDK结合，根据cyclin调控细胞周期时相的不同，分为G1期和M期。G1期细胞周期蛋白包括C、D、E 3种，在G1期和G1/S交界处发挥作用，启动细胞周期并能促进DNA合成。M期细胞周期蛋白包括A、B两种，在G2/M交界处发挥作用，诱导细胞分裂。

1.2.2细胞周期调控 细胞周期通常存在2个检测点，即DNA合成开始的G1－S检测点和有丝分裂的G2-M检测点。这2个检测点可发生DNA的损伤和突变，从而将受损细胞阻滞在细胞周期相应的时相进行DNA修复，无法修复的细胞则发生凋亡或死亡[2]。G1期合成的专一蛋白称为触发蛋白（Trigger protein），触发蛋白的积累有助于细胞通过G1期R点进入S期，G1期之末是推进细胞周期的一个关键时刻，也是药物作用于细胞周期的一个敏感点。P21WAF1P27Kip1及c-myc蛋白为细胞中G1-S检测点的重要调节因子[3]，其中前两者属细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族CKI，主要通过抑制G1-S检测点中各种周期蛋白及其依赖性激酶来调节细胞周期[4]。近几年研究发现，不管cyclin、CDK和CKI，还是其他相关因子对细胞周期的作用都是通过视网膜母细胞瘤基因产物Rb蛋白来实现，Rb蛋白对细胞周期中最为关键的两个调控点Gl-S和G2-M起到一种“闸门”的作用，在G1和G2期，Rb蛋白上的多个磷酸化位点都处于非磷酸化或低磷酸化状态，与转录因子E2F结合成复合物形式，抑制与细胞周期相关基因的转录表达，发挥稳定的细胞周期抑制作用，在G1和G2末期，控制该调控点的相应细胞周期蛋白合成增加，与相应的CDK结合，使Rb蛋白磷酸化，从而导致E2F的释放，游离的E2F启动多种基因的转录表达。因此，Rb蛋白的功能状态最终决定着细胞周期的进程[5]。

2对RPE细胞周期影响的药物

近年来诸多学者以细胞周期阻滞为着眼点研究抗细胞增殖的药物，目的是通过药物作用影响细胞的DNA合成或有丝分裂的进行而调控细胞周期，将细胞阻滞在某一期，阻止细胞重新进入细胞周期，从而抑制细胞增殖的发生。

2.1将细胞周期阻滞在G0-G1期的药物 维甲酸（retinoic acid，RA），是感光细胞的中间代谢产物，也是维生素A在体内的自然衍生物。维甲酸类药物后来被发现具有抑制RPE细胞增殖的作用。其作用机制为维甲酸进入细胞后首先与细胞质内的维甲酸结合蛋白（cRABP）结合，再被转运至细胞核内，在细胞核内有3种维甲酸受体，维甲酸与其受体结合呈二聚体调节关键酶（如鸟氨酸脱羧酶及蛋白激酶C）基因的表达，可明显抑制与细胞增殖有关的c-myc、c-myb基因的异常表达，并且可以与某些靶基因序列结合进而调节某些基因的转录，抑制细胞DNA合成，从而抑制细胞增殖，促进细胞分化[6]。国内喻晓兵等[7]通过研究维甲酸对体外培养兔视网膜色素上皮合成的影响，认为维甲酸是通过抑制RPE细胞周期中S期DNA合成来抑制细胞生长，其作用浓度为10-9～10-5mol/L，并且呈量效关系。Doyle等[8]认为维甲酸对于牛兔原代培养的RPE细胞无明显的抑制作用，但在人原代培养的RPE细胞确有明显的抑制作用。维拉帕米(vera pamil，Ver)是一类能够阻断慢钙通道、减少细胞外液Ca2＋内流的药物。而Ca2+是细胞内的第二信使及细胞增殖的启动子，其浓度的升高能导致细胞有丝分裂的发生。余建洪等[9]利用MTT比色法和氚标胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine， 3H-TdR）掺入试验测定维拉帕米在一定浓度内能抑制培养的hRPE细胞的增殖和DNA合成最大抑制率为79.54%，姜彩辉等[10]试验也有类似的结果，并且发现可使兔RPE细胞更多地滞留在G1期，阻止细胞进入S期，且具有明显的浓度依赖性和时间依赖性。

槲皮素（QUE）对多种与细胞增殖有关的酶都有抑制作用。QUE可通过抑制蛋白激酶C和线粒体琥珀酸氧化酶而抑制肿瘤细胞的增生[11]，直接与钙离子—钙调素复合物反应拮抗钙调素的作用，抑制肿瘤细胞DNA合成。QUE可直接与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-knase)的ATP结合位点结合抑制该酶的活性，并能竞争性抑制酪氨酸蛋白激酶活性，从而影响多种生长因子的信号传递，进而抑制细胞的分裂增生。国内张培霖等[12，13]在实验中发现QUE对RPE细胞DNA合成具有明显的抑制作用，其抑制效应在一定的时间和剂量范围内有时间依赖和剂量依赖关系，在进一步的实验中运用流式细胞仪测定QUE能以剂量依赖方式使RPE细胞阻抑于G1期。

二甲基亚砜(DMSO，一种细胞分化诱导剂及端粒酶抑制剂) ，作为一种细胞分化诱导剂而广泛应用于研究诱导肿瘤细胞分化来治疗各种肿瘤。研究表明，DMSO诱导细胞分化的机制主要是抑制c -myc基因表达，抑制DNA合成和降低内源性聚腺苷二磷酸核糖的水平。彭坤等[14]尝试应用DMSO作用于培养的人RPE细胞，采用流式细胞术对细胞周期的研究表明，DMSO能使细胞周期发生明显变化，随DMSO浓度增加及作用时间延长，G1期细胞明显增加，S、G2期细胞显著减少，与同等条件下MTT法检测细胞存活率下降结果相符。

地塞米松（DEX）有强大的抗炎作用和对细胞增殖的抑制作用已广泛应用于玻璃体手术的辅助治疗。刘兵等[15]检测地塞米松对培养的人视网膜色素上皮细胞的调控。实验显示，DEX浓度小于320mg/L时，DEX对培养的人RPE具有促增殖作用，并呈时间及剂量依赖性，DNA合成增加，S、G2/M期细胞数较对照组增加28.32%，相反当浓度大于320mg/L时，能明显抑制细胞的增殖，DNA合成减少，S、G2/M期细胞数显著性降低41.84%。地塞米松对细胞生长的双向作用也见于培养的皮肤成纤维细胞和结膜成纤维细胞[17]，机制尚不十分清楚。DEX具有生长因子的特性，增殖作用是由于糖皮质激素受体的激活，对一些细胞有促有丝分裂作用[16]。抑制作用可能是降低细胞膜或糖皮质激素受体的易感性[17]。

闻慧等[18]运用流式细胞仪测定组织型纤溶酶原抑制剂可通过延长或阻滞人RPE细胞于S期抑制其增殖，但抑制机制还不清楚。刘少山等[19]应用透明质酸刺激活性物作用于人视网膜色素上皮细胞，结果显示透明质酸刺激活性物作用后G1期细胞数较对照组增加7.2%，S期减少9.7%。赵宏等[20]用不同浓度的TGF-β1作用于RPE细胞后，培养的人RPE细胞在G1期细胞数明显增加，G2期和S期细胞数明显减少，因此认为TGF-β1抑制RPE细胞的增殖作用在本实验中已得到证实，它对RPE细胞的抗增殖作用机制是由于该细胞因子使RPE细胞阻滞在G1期而无法进入增殖期[21]。

2.2将细胞周期阻滞在G2/M期的药物 机制可能是药物作用于细胞骨架的微管系统，促进微管聚合并稳定微管结构，阻止其解聚成亚单位，进而影响微管聚合与解聚的动态平衡，导致细胞周期阻断在G2/M期。

在眼科领域，Wagner等[22]研究发现Ca2+和钙调素抑制剂可抑制RPE细胞增殖[23]。钙调素(camo- dulin，CaM)是细胞内Ca2＋的主要受体，在细胞增殖、运动、分化、转化，程序性死亡中起重要作用，特别是在细胞周期中，CaM可通过以下3个环节调节细胞增殖：①促进G2/S期过渡，启动DNA合成。②促进G2/M期过渡，启动有丝分裂。③促进M中期进入M后期，完成染色体分离，结束有丝分裂。钙调素抑制剂—三氟拉嗪(TFP)是一种噻吩类化合物，现在普遍认为TFP等CaM抑制剂对细胞增殖的抑制作用是通过CaM对细胞周期的调节来实现的，主要通过CaM结合蛋白及依赖CaM的蛋白激酶和磷酸酶可逆地调节胞内周期相关蛋白的磷酸化和去磷酸化以调节胞内基因表达等反应，陈君等[24]在实验中发现TFP可抑制RPE细胞生长，且呈时间剂量效应。TFP通过对RPE细胞周期各时相群体的影响，使G1期向S期，进而向G2/M期的过渡被抑制，从而抑制RPE细胞的增殖。Kang等[25]在研究丝裂霉素（MMC）对人视网膜色素上皮细胞抑增殖的机制中发现其抑制人视网膜色素上皮细胞增殖呈剂量依赖关系。10g/L的MMC对细胞有凋亡作用，1g/L的MMC可以阻滞细胞于G2/M期，MMC可能通过P21的上调引起细胞阻滞于G2/M期。

康军等[26]在实验中发现苏拉明可以剂量依赖性的抑制PDGF和IL-1β的促增殖作用，在适当浓度时无细胞形态的明显变化，说明苏拉明抑制细胞增殖的能力并非毒性反应。

Yoon等[27]在实验中发现染料木黄酮对RPE细胞的抑制作用呈现剂量时间依赖关系[28]。10mm染料木黄酮未引起细胞凋亡，将细胞阻滞在G0/G1，使S期的细胞在24～48h内不占比例；而50μmol/L的浓度使RPE细胞阻滞在G2/M期并引起了随之而来的细胞凋亡。与Krott等和国内王海燕等的研究结果类似。发生机制是诱导G2/M期细胞阻滞的CDC2 Kinase的洛氨酸残基干扰了磷酸化和去磷酸化，进入S期和由G2进入M期与PP34cdc2的磷酸化和去磷酸化有关，而且络氨酸磷酸酶刺激物诱导了短时的G2/M期细胞的阻滞。但关于染料木黄酮诱导细胞凋亡的机制，目前尚未完全明了，可能通过抑制PTK和DNA拓扑异构酶II干扰细胞周期，使细胞生长的重要蛋白质其络氨酸残基不能发生磷酸化以及复制、转录受到抑制，扰乱细胞的分化，从而诱导细胞凋亡。

3问题与展望

通过调控RPE细胞的细胞周期来防治PVR可能是一条有效的途径，因此进一步研究开发对RPE细胞无细胞毒作用，只作用于异常增殖的细胞，且其调控作用有可逆性的药物将会为临床防治PVR提供很大帮助。

【参考文献】

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10 姜彩辉，张卯年，张鲲，周春喜，黄靖香，顾铮.维拉帕米对血清诱导的兔视网膜色素上皮细胞增殖调节作用的研究. 医学研究生学报，2003，13(3):171-173

11 Murray AW，Kirschner MW.Dominoes and clocks:the union of two views of the cell cycle. Science ，1989;246:614-618

12 张培霖，罗清礼，陈立新.槲皮素对培养人视网膜色素上皮细胞增生及DNA合成的影响. 中华眼底病杂志，1999;15(1):27-29

13 张培霖，罗清礼，陈立新. 槲皮素对培养人视网膜色素上皮细胞细胞周期的影响.泸州医学院学报，1999;22(2):106-109

14 彭坤，邢怡桥，项奕，叶美红，艾明，杨安怀，杨燕宁. 二甲基亚砜对培养人视网膜色素上皮细胞增殖的影响. 眼科新进展.2004;24(2):91-92

15 刘兵，惠延年，王雨生. 地塞米松对培养的人视网膜色素上皮细胞生长的调控. 空军总医院学报，2001;17(3):147-149

16 Blumenkrans MS，Claflin A，Hajek AS.Selection of therapeutic agents for intraocular proliferative disease cell culture evaluation. Arch Opththalmol ，1984;102:598-604

17 He SK，Wang HM，Ye J. Dexam ethasone induced proliferation of cultured retinal pigment epithelial cells. Curr Eye Res ，1994;13:257-261

18 闻慧，阴正勤，王一，祝枚东.组织型纤溶酶原激活剂对人视网膜色素上皮细胞的抑制.眼科学报，2001;17:122-125

19 刘少山，惠延年，王雨生，王强.透明质酸刺激活性物对人视网膜色素上皮细胞的抑制.中华眼底病杂志，1999;15(2):72-74

20 赵宏，曾水清，刘苏冰，左志高. 转化生长因子抑制视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究.武警医学，2001;12(12):709-711

21 Datto MB， Li Y， Panus JF. Transforming growth factor induce the cyclin-dependen inhibitor P21 through a P53-independent mechanism. Proc Natl Acad Sci USA ，1995;92:5545-5549

22 Wager M， Benson MT， Rennie IG， MacNeil S. Effects of pharmacological modulation of intracellular signalling systems on retinal pigment epithelial cell attachment to extracellular matrix proteins. Curr Eye Res ，1995;14:373

23侯旭，惠延年，韩泉洪，张晓光，王建洲，郭长梅.机械牵拉对培养人视网膜色素上皮细胞内钙离子的影响.国际眼科杂志，2005;5(1):50-54

24陈珺，喻晓兵，吴景天.钙调素抑制剂对视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用的研究.中国实用眼科杂志，2000;18(4):218－220

25 Kang SG， Chung H， Yoo YD， Lee JG， Choi YI， Yu YS. Mechanism of growth inhibitory of Mitomycin-C on cultured human retinal pigment epithelial cells.Apoptoses and cell cycle arrest. Curr Eye Res ，2001;22(3):174-181

26康军，崔志利，海欧，安洁，高丹宇.细胞因子及苏拉明对视网膜色素上皮细胞增殖的影响.国际眼科杂志，2005;5(4):655-658

细胞膜范文第3篇

破解细菌生物膜

细菌在大多数时候并非以单个游离状态存在，而是聚集粘结在一起，形成团块。细菌本身只占不到1/3的体积，余下空间由细菌分泌的一种黏性物质占据。科学家们将这种黏性物质以及被其黏结而成的细菌团块称为“生物膜”。

生物膜能保护细菌对抗外来危险，比如增强它们耐受抗生素的能力，但也是出了名地难分解。生物膜能生长在各种生物和非生物的表面，包括水下岩石、食物、牙齿（形成牙菌斑）、医用生物移植材料（如膝盖和髋关节等）。细菌生物膜会引起尿道炎、前列腺炎、肾结石、龋齿等多种疾病，往往还会反复发作，极难彻底治愈。

领导这项研究的是美国德州农工大学化学工程系教授托马斯?伍德和阿鲁尔?杰亚拉曼等人。他们利用细菌之间发送和接收的特殊信号来引发生物膜的形成与分解。他们把一段取自绿脓杆菌的基因插入到埃希氏菌中，使这些埃希氏菌能持续不断地发出一种化学信号。正常情况下，埃希氏菌是不能制造这种信号的。他们还在埃希氏菌中插入了接收机制和一种开关，让这种信号能持续不 断地广播。

然后他们把转基因细菌插入到环境中的生物膜里，这些已有的生物膜也被改造得能接受这种化学信号。伍德解释说，一旦接受这种信号，其中的细菌就会打破生物膜离开该处环境，从而有效破解这些生物膜。

“以前还从未有研究小组发现过一种蛋白质能破解生物膜，并将它们用在合成路线中。我们利用了细胞间的‘交谈’信号，对生物膜的控制达到了前所未及的程度。”伍德说。

尽管生物膜会给健康带来严重威胁，但在工业中却非常有用，比如制造替代燃料。伍德解释说，生物膜坚固的特性让它们成为制作生物反应器的理想材料，生物膜反应器可用来生产多种化学产品，如丙醇和丁醇。由于膜内细菌以葡萄糖为食，还能潜在地帮助改变生态。

让细菌工厂代替化工厂

“我们的最终目标，是用细菌造出化工厂里能造出来的所有产品。”伍德说，“要实现这一目标，未来的反应器是一种生物膜反应器。一旦有什么意外情况，比如操作反应器的人突然咳嗽起来，也不会造成太大影响。当pH值降低时，生物膜仍能保持坚固，细胞也不会死。如果细胞不在生物膜内而是独立生长，反应器内一有什么变化，你就可能失去所有的细胞和它们的产品。”

但要想把这种技术落实到实际应用中，必须能控制多种与膜有关的变量：反应器中能生长多少膜？需要多长时间？不同生物膜的比例是多少？

“我们开发出一种新的生物膜反应器的缩微模型，能精确控制哪种细菌正在扩张，处在什么时期，以及它们在生长过程中放出了哪种信号。”杰亚拉曼解释说，“除了能控制反应器，这种技术还让我们能以一种高流量的方式研究一些实验条件，这对优化生物反应过程非常重要。”研究人员能操控细菌以更高密度生长，或者按某种特殊比例来培养它们。通过控制生物膜的形成和破解，还能让反应器在限定时间内，从生产一种产品转换为生产另一种，实现有效准确地生产、加工和提纯，持续不断地造出合乎要求的化学产品。

细胞膜范文第4篇

【关键词】 抗原递呈细胞 角膜上皮细胞 外周血单个核细胞 共同刺激通路

the immunological character of corneal epithelial cells

wang fan.

university eye hospital hamburg?eppendorf,university of hamburg,hamburg 20246,germany

［abstract］objective:to investigate the capability of corneal cells to stimulate lymphocyte proliferation and the expression of costimulatory molecules on primary human corneal epithelial cells.methods:human corneal epithelial cells were cocultivated with peripheral blood mononuclear cells(pbmc). expression of hla class ⅱ antigens, cd40, cd154, cd80 and cd86 was measured by immunohistochemical staining,and the expression of such molecules above on rejected corneal grafts was contrastingly assessed. activation of lymphocytes was determined by measuring upregulation of cd69 by facs analysis.results:hlaⅱ expression was detectable on human primary corneal epithelial cells,and furthermore, upregualtion of costimulatory molecules cd40 and cd80 were also found after induction with γ?interferon. both of hla and cd40 were expressed on rejected corneal grafts. t lymphocytes were activated by epithelial cells in the coculture system.conclusion:human corneal epithelial cells are involved in rejection process of the corneal transplantation. the immunological reaction is triggered by epithelial cells,and endothelial cells suffer as the targets.

［key words］antigen presenting cells(apc)；corneal epithelial cells；peripheral blood mononuclear cells(pbmc)；costimulatory pathway

预防和治疗同种移植排斥反应仍然是当今角膜移植术最具有挑战性的领域。几十年来利用动物模型研究已证实：角膜移植排斥反应像其他的器官移植一样，是个t淋巴细胞介导的免疫过程。同其他的移植组织一样，角膜移植排斥反应主要依赖于t细胞介导的同种异体反应［1］。人类白细胞抗原(hla)是免疫反应中第一信号的主要靶分子，特别是hla ⅱ类抗原在免疫细胞之间的反应中发挥着重要的调节作用［2］。有证据表明hla ⅱ类抗原仅限于角膜朗格罕氏细胞和血管内皮细胞。 但是，hla ⅱ类抗原也表达在同种移植排斥反应后的其他角膜细胞上［3］。除了t细胞活化，一个有效的免疫应答的发展也要求第二信号或共同刺激信号，对于t细胞的增生和细胞因子的分泌，它是非特异性的［4］。这个共同刺激信号是由b7?1(cd80)或b7?2(cd86)与t细胞表面它们的受体cd28和ctla4之间的反应所介导的。其他的t细胞表面分子，像cd154(cd40的受体)、cd2、lfa1和icam1构成了第二信号。角膜移植实验模型研究证明，阻断cd80/86?cd28和ctla4?ig之间的反应延迟了免疫反应，ctla4?ig结合抗cd154抗体或者可的松治疗进一步推迟了鼠类角膜移植排斥反应的启动［5］。排斥反应的组织学研究表明，淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞已经被确认为优势的免疫细胞，导致了角膜组织细胞与浸润的淋巴细胞之间的免疫反应参与角膜移植排斥反应机制的假想［6］。但是，角膜细胞导致t淋巴细胞增生的过程尚未明了。本实验中，我们假设在角膜移植排斥反应过程中，角膜上皮细胞同样作为抗原递呈细胞参与了免疫反应。

1 材料与方法

1.1 角膜上皮细胞的培养

角膜上皮细胞来自内皮细胞数量不足、不适于角膜移植术的人供体角膜，或角膜移植术的角巩膜环。细胞培养于0.5 ml的培养液ham’s f12/dmem(gibco invitrogen)，添加10%胎牛血清fcs(gibco invitrogen)，10 ng/ml鼠上皮生长因子(biochrom)，5 μg/ml牛胰岛素(sigma)，0.1 μg/ml霍乱毒素(sigma)，5 mg/l转铁蛋白(sigma)，0.18 mmol/l腺嘌呤(sigma)，0.4 mg/l水合可的松(sigma)，2 nmol/l三碘甲状腺氨酸(sigma)，4 mmol/l谷氨酸(biochrom)和抗生素［7，8］。每周更换2次培养液。

1.2 提取外周血单个核细胞（pbmc）

从健康志愿者采集大约15 ml的新鲜血液，10 ml的histopaque?1077缓慢加入10 ml的新鲜血液表面，400 g离心5分钟。将离心后中间的透明相转入另一个干净的离心管，pbs冲洗，细胞悬液250 g离心10分钟。细胞沉淀再次溶解于rpmi1640培养液(gibco invitrogen)，添加2 mmol/l l?谷氨酸，1 mmol/l hepes液(gibco)，10%胎牛血清(gibco invitrogen)和抗生素。每次提纯细胞，应用台盼兰染色排除试验测定细胞的完整性和细胞数量。

1.3 共同培养角膜细胞与外周血单个核细胞

2×104人角膜上皮细胞培养于8孔培养板，部分细胞加入1 000 u/ml γ?干扰素。3天后，新鲜提纯的pbmc(1×106/孔)和抗cd28单克隆抗体(1 μg/ml)加于角膜上皮细胞培养板中，继续进行无γ?干扰素的培养。pbmc与预先固定的抗cd3抗体（4 μg/ml）和抗cd28抗体(1 μg/ml)作为阳性对照，培养无任何添加物的pbmc作为阴性对照。所有共同培养物保持培养在rpmi1640添加10%胎牛血清培养液中，继续培养2天。共同培养系统中的细胞悬液收集后用于荧光辅助细胞筛选分析，用70%甘氨酸乙醇缓冲液固定附着于培养板表面的角膜细胞和pbmc，或者10%的福尔马林固定做免疫组织化学分析。

1.4 免疫组织化学染色

1.4.1 培养2×104人角膜上皮细胞，生长至细胞融合状态后固定于70%甘氨酸乙醇缓冲液或10%的福尔马林。细胞分别与抗hla?dp、?dq、?dr(dakocytomation)、cd40(acris)的单克隆抗体孵育。稀释抗体于1∶100室温下孵育30分钟。根据说明书操作步骤应用lsab?2试剂盒(dakocytomation)检测已结合的抗体：孵育生物素结合的链接抗体10分钟，碱性磷酸酶标记的链霉抗生物素蛋白孵育10分钟，再伴随10分钟的底物色原溶液反应。苏木精对比染色，干燥后水溶性封片剂(merck)封片。相对染色强度分类为：-（阴性），+（弱阳性，<25%），?（中度，25%～50%），?（强,50%～75%），?（极强，75%～100%）。

1.4.2 γ?干扰素刺激的角膜细胞和pbmc共同培养系统实验也同法固定，分析cd80、cd86和cd154共同刺激分子通路表达。另外，检测共计15个来自穿通性角膜移植术患者的角膜植片。其中，10个角膜诊断为角膜内皮功能失代偿，5个角膜诊断为圆锥角膜。角膜植片固定于4%的福尔马林，石蜡包埋切片，检测hla?dp、?dq、?dr、cd40和cd154的表达。

1.5 荧光辅助细胞筛选分析（facs）

荧光辅助细胞筛选分析仪(becton?dickinson facs?calibur)进行双色分析。在pbmc与γ?干扰素刺激的人角膜上皮细胞共同培养体系中，用抗cd3fitc（t淋巴细胞）和抗cd69pe单克隆抗体(活化的t淋巴细胞)来定量分析活化的t淋巴细胞的百分比。细胞分别和饱和浓度(1 μg/106 cells)的抗cd3fitc、抗cd69pe抗体以及阴性对照抗体在暗处4℃孵育30分钟。facs分析之前10分钟加propidium iodide(sigma)入样本，至最终浓度为1 mg/ml，根据前向角散射（forward scatter, fsc）的形态特征和propidium iodide的染色来分类淋巴细胞和单核细胞。应用cellquest软件(becton dickinson)进行数据分析。

2 结果

2.1 角膜排斥反应植片

圆锥角膜切片显示角膜各层无炎性细胞和hla ⅱ类分子，而排斥的角膜移植片展示强阳性的hla ⅱ类抗原表达。阳性细胞特别表达在角膜上皮的基底层，甚至在内皮层。在角膜实质层，阳性细胞临近于新生血管区域，另外一些阳性细胞位于血管内皮，还有一些散布于实质层各处，见图1。在植片边缘增生和血管化的结膜组织上，也有强烈的hla ⅱ类抗原阳性细胞。10个排斥反应的植片中有5个显示cd40阳性细胞位于角膜上皮层的表层。角膜各层细胞未见cd154阳性细胞。所有的圆锥角膜均为cd40和cd154阴性。

2.2 角膜上皮细胞的hla、cd40、cd80和cd86表达

无γ?干扰素刺激的超过50%的培养的人角膜上皮细胞呈现hla ⅱ类抗原阳性，γ?干扰素诱导以后的细胞显示了明显的表达上调，几乎100%的角膜上皮细胞为阳性染色，在样本中，可观察到阳性细胞或在细胞表面或在细胞浆中，见图2。无γ?干扰素刺激下，所有的角膜上皮细胞为cd40阳性，γ?干扰素处理后进一步提高了阳性表达。无论γ?干扰素诱导与否，超过50%的角膜上皮细胞显示cd80阳性，而cd86为阴性，见表1。表1 免疫组化分析hla?dp、dq、dr(人类白细胞抗原)、cd40、cd80和cd86在角膜上皮细胞的表达（略）

2.3 共同培养系统的cd80、cd86和cd154表达

cd80/cd86、cd40和它的受体cd154是hla信号系统之外的第二信号系统，是t细胞增生和细胞因子分泌所必需的条件。在共同培养系统中，cd80和cd86均可被观察到阳性表达，却无cd154阳性细胞，见表2。表2 角膜上皮细胞和pbmc共同培养体系中的cd80、cd86和cd154的表达（略）

2.4 荧光辅助细胞筛选分析（facs）

cd69作为活化的t淋巴细胞的标记物，在pbmc和角膜上皮细胞共同培养之后被测定。最高水平的应答反应在pbmc与γ?干扰素预先诱导的角膜上皮细胞共同孵育系统中被检测到，见图3。

3 讨论

临床上，角膜移植的排斥反应多数被认定为角膜内皮功能的失代偿。在此研究中，我们探讨了角膜上皮细胞的培养以确定它们在体外作为潜在的抗原递呈细胞的分子表达和能力。至今，尚缺乏对这些细胞的功能和免疫学特性的定义。

第一信号：hla ⅱ类抗原。我们发现hla ⅱ类抗原表达在未受诱导的人角膜上皮细胞上，且能够被γ?干扰素提高其表达。实验性鼠角膜移植模型显示可诱导新生血管化和淋巴排泄通道发展的外界刺激也可以提高淋巴细胞的活化［9］。本研究中，我们发现排斥反应的移植片增厚，同时有新生血管长入，并有hla ⅱ类抗原表达阳性的细胞浸润。免疫淋巴细胞可以沿着这些新形成的血管从淋巴结循环至角膜并破坏免疫赦免状态，从而导致移植失败，植片被排斥。

第二信号：共同刺激通路。cd154：cd40通路在细胞介导的免疫反应的生成中是重要的，并且被认为是t细胞活化过程中的关键通路［10］。cd40被发现是抗原递呈细胞和间叶细胞的变种，包括b淋巴细胞、树枝状细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞和上皮细胞［11?14］。cd154是cd40的配体(cd40l)，是肿瘤坏死因子(tnf)家族成员。cd154和cd40结合诱导了信号通道的开启，从而导致cd80和cd86的表达升高［15?17］。动物实验模型显示，阻断cd40：cd154通路足以诱导th1介导的接触性超敏反应耐受， 从而有效地延长植片的存活率［18?22］。

两条证据强调了在移植排斥过程中，t细胞共同刺激通路中b7：cd28通路的任务。首先，体外药物阻断b7和cd28分子之间的反应，可诱导t细胞递呈同种抗原长时间持续的无反应性应答。其次，在血管化的器官移植后，b7分子可在24小时之内被诱导在血管内皮上，意味着t 细胞能够通过移植的器官本身接受共同刺激信号［23］。实验证明同种角膜移植术后结合抗cd80和抗cd86单克隆抗体治疗可有效地延长角膜移植片的存活［24］。这些结果说明了cd80和cd86共同刺激分子在角膜移植排斥反应中的重要作用。

角膜各层的排斥反应可各层独立发生，也可同时混合发生［25］。 通过共同培养研究得出结论，pbmc和角膜上皮细胞之间的接触可促进共同刺激分子在角膜细胞上的表达。荧光辅助细胞筛选分析和免疫组织化学染色显示人角膜上皮细胞刺激t淋巴细胞表达高水平的cd69。t细胞受体识别角膜上皮细胞上的hla/多肽复合体得到信号1，同时， 提供cd28抗体以结合角膜细胞上的cd80或cd86分子，得到信号2。信号1和信号2导致了t细胞活化和增生的阳性刺激。同理作用于cd40?cd154第二通路。本研究阐述了角膜移植排斥反应的机理以及角膜上皮细胞作为潜在抗原递呈细胞的功能，供体角膜上皮细胞和受体t淋巴细胞的接触触发了移植片的同种免疫性反应，最终作用于角膜内皮细胞，导致内皮水肿，功能失代偿，移植失败。

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细胞膜范文第5篇

一、教学目标的确定

体验制备细胞膜的方法，需要掌握临时装片的制作和显微镜的熟练操作，因此本节的知识和技能目标确定为“体验制备细胞膜的方法”，进而了解“细胞膜的组成成分与功能”。通过参与问题的探讨和对实验结果的分析，来认同细胞膜作为细胞生命系统边界的作用及其重要意义，体会生命的精致与完美。

二、教学重点难点

细胞膜组成成分与其功能的相适应特点是理解细胞膜作为系统的边界的基础，因此本节的教学重点确定为：（1）细胞膜的成分与功能；（2）体会细胞膜 作为细胞生命系统边界的重要意义。为后面把细胞作为一个活系统来研究做了一个起点示范，是一个重要却相对难理解的知识点。要让学生从实验中体会科学探究的思路和方法，培养进行生物学研究的能力，需要考虑学生在实验中可能遇到的困难，因此教学难点为：（1）用哺乳动物的红细胞制备细胞膜的方法；（2）细胞膜对于细胞这个生命系统的重要意义。

三、教学方法与手段

通过教师引导、学案辅助、资料分析与多媒体运用，帮助学生体验实验过程，让学生感知细胞膜的存在， 将细胞的物质组成与功能有机地联系起来， 使学生对细胞形成系统的认识，也为“生物膜的流动镶嵌模型”的学习奠定基础。在多媒体实验室进行教学，既可以开展实验，也可以利用多媒体进行辅助教学。

四、课前准备

多媒体课件，学案。

五、教学过程

见下面列表。

六、教学反思

本节课的教学内容是在学习使用高倍镜观察几种细胞和组成细胞的分子的基础上进行的，所以学好本节内容既能帮助学生巩固前面的知识，又能为学生学习第4章 作好铺垫，因此本节课在教材中起着承上启下的桥梁作用。

按照《课程标准》的要求，结合教材内容和学生的实际情况，基本上能够按照《课程标准》的要求进行教学，收到了较好的教学效果，学生能主动参与到教学过程中来，课堂气氛比较活跃。教学目标严格按照新课程“三位一体”的目标体系来设计，充分体现了学生学习方式的转变，符合学生学习的特点。在教学过程中很好地贯彻了教学目标， 体现了学生的主体地位。

不足之处是由于安排了学生实验，课堂教学时间显得仓促。

板书设计：

细胞膜——系统的边界

一、细胞膜的制备

1.选材：哺乳动物成熟的红细胞

2.原理：红细胞吸水涨破

二、细胞膜的成分

三、细胞膜的功能

1.将细胞与外界环境分隔开

2.控制物质进出细胞

3.进行细胞间的信息交流

四、细胞壁