1基因芯片技术的发展概况

基因芯片(genechip),又称DNA芯片,是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针,有规律地排列固定于支持物上,然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交,再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描,并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测,从而迅速得出所要的信息[1]。近年来该技术又常被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)或DNA微阵列芯片,也称为生物芯片(biologicalchiporbiochip),但生物芯片还包括正在研制的蛋白质或肽芯片、组织原位芯片等类型。从广义上讲,一切以芯片为基础的生物分析过程均可称为生物芯片技术,其中以大规模DNA杂交技术为基础的芯片技术尤为人们所瞩目。

1.1基因芯片技术产生的背景过去十余年里,随着人类基因组计划(HGP)的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展,越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定。在GenBank数据库中已含有300万个序列,总数超过22亿个碱基对,其中包括19种不同生物体的完整序列、近9000个已知功能或已推测功能的人类基因序列。目前基因序列数据库正在以前所未有的速度迅速增长。然而如何充分利用新序列信息资源,怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能,成为生命科学工作者的共同课题。已建立的诸如North-ern印迹、RNA酶保护实验、S1核酸酶分析、噬斑杂交以及狭线印迹等方法不能提供足够通量来有效地利用新的基因组学的资源。为此,必须发展高通量(highthroughout)或平行监测基因表达的新方法。基因芯片技术正是在这样的背景下应运而生。早在80年代初期,有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因大量的遗传信息进行分析和检查。但直到1994年Pease等人创造的光导原位合成(light-directedsynthesis)高密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)的制作技术问世之后,才使该设想逐步成为现实。因此可以说光导ODTA化学合成法,为DNA芯片技术奠定了基础。

在DNA芯片获得突破之后,又建立了通过高速机器人(high-speedrobotics)将cDNA定位排列到支持物上的cDNA微阵列技术,产生了基因表达芯片,成为大规模研究基因功能的强有力手段。1997年Jones建立了“重述DNA测序法”(iterativeDNAsequencingmethod),通过使用Ⅱs类限制性内切酶和含有Ⅱs类RE识别区域的接合器,突破了DNA芯片只能分析单链DNA的限制,而可同时对多条双链DNA直接进行平行测序。基因芯片的发展与双色荧光探针杂交系统(two-colorfluorescentprobehybridization)的建立有密切关系。将两个不同样品的mRNA在反转录时用不同的荧光底物进行标记。两组样品的cDNA混合后进行杂交。对同一个探针位点,在两组不同的激发光下进行检测,获得该位点上两个不同样品的杂交信号,其比值经阳性对照(外参照)比值和组成型表达基因(内参照)比值的校正后,就是该基因在两个不同样品中差异性表达的比值。这类系统可以很好地克服检测过程中某些不稳定或不确定因素带来的不利影响,使差异性表达的研究高效而可靠[2,3]。在此基础上,近年来各色荧光标记底物也已不断出现。

1.2基因芯片的主要类型基因芯片的类型视分类方法不同可分为不同的类型。

1.2.1无机片基和有机合成物片基的基因芯片以基因芯片的片基或支持物(substrateorsupportmatrix)的不同可以分为无机片基和有机合成物片基,前者主要有半导体硅片和玻璃片等,其上的探针主要以原位聚合的方法合成;后者主要有特定孔径的硝酸纤维膜和尼龙膜,其上的探针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到片基上。另有以聚丙烯膜支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位合成高密度探针序列。

1.2.2原位合成和预先合成然后点样的基因芯片以探针阵列的形式分为原位合成(insitusyn-thesis)与预先合成然后点样(off-chipDNAsynthe-sis)两种。芯片制备的原理是利用照相平板印刷技术(photolithography)将探针排列的序列即阵列图“印”到支持物上,在这些阵列点上结合上专一的化学基因。原位合成主要是指光引导合成技术,该技术是照相平板印刷技术与固相合成技术、计算机技术以及分子生物学等多学科相互渗透的结果。照相平板印刷中可用光引导形成电子线路(electricalcir-cuits),利用类似的原理可在固相支持物上同时合成出大量不同的化合物。预先合成然后点样法在多聚物的设计方面与前者相似,合成工作用传统的DNA合成仪进行。合成后再用特殊的点样装置或仪器(如美国的CartesionTechnologies公司的PixSysNQ/PA系列产品)将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经过处理的玻片上,点阵密度可达到3×104spots/cm2。

1.2.3基因表达芯片和DNA测序芯片根据芯片的功能可分为基因表达芯片或基因表达微阵列(geneexpressionmicroarry)和DNA测序芯片或重述DNA测序芯片(interativeDNAsequencingchip)两类。前者可以将克隆到的成千上万个基因特异的探针或其cDN段固定在一块DNA芯片上,对来源于不同的个体(正常人与患者)、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激(包括不同诱导、不同治疗手段)下的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测,从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断,迅速将某个或几个基因与疾病联系起来,极大地加快这些基因功能的确定,同时可进一步研究基因与基因间相互作用的关系。DNA测序芯片则是基于杂交测序(sequencingbyhybridization,SBH)发展起来的。SBH的原理是,任何线状的单链DNA或RNA序列均可分解成一系列碱基数固定、错落而重叠的寡核苷酸,又称亚序列(subsequence),如由8个核苷酸组成的8体亚序列。

例如,可以把序列TTAGCTCATATG分解为5个错开一个碱基而重叠7个碱基的8体亚序列(也可分为7体、9体或其他整数n体的亚序列)。假如我们能把原序列所有这些错落重叠的8体亚序列全部检测出来,就可据此重新组建出原序列。对于一个未知DNA序列,可以用人工合成的、已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与之杂交(在8体寡核苷酸中,G,C,T,A4者自由组合而成所有可能的序列共有48=65536种)。通过对杂交的检测,检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸,从而获知靶DNA中的所有8体序列,组合分析后者,即可重构靶DNA的序列。如前所述,重述DNA测序法的建立已克服了SBH只能测定单链和二级结构对SBH的限制。Affymetrix公司的测序芯片,即是将65536个8nt的寡核苷酸通过光刻的方法在芯片表面原位合成,获得一个微阵列矩阵,分辨率为50μm。而Chee等则将1.35×105个长度为15nt的寡核苷酸探针固定在芯片上,对长度为16.6kb的整个人线粒体基因组进行序列测定,每个检测位点包括一套4个探针。芯片分辨率为35μm,测序精度为99%。另外也可根据所用探针的类型不同分为cDNA微阵列(或cDNA微阵列芯片)和寡核苷酸阵列(或芯片),根据应用领域不同而制备的专用芯片如毒理学芯片(Toxchip)、病毒检测芯片(如肝炎病毒检测芯片)、P53基因检测芯片等。

1.3芯片杂交的检测方法对于以核酸杂交为原理的检测的主要过程为:首先用荧光素标记经扩增(也可用其他放大技术)的序列或样品,然后再与芯片上的探针进行杂交后冲洗。图像的分析用落射荧光显微镜(epifluorescencemicroscope),或电荷偶联装置照相机(charge-coupleddevicecamera)、非共聚焦激光扫描仪(nonconfocallaserscanner)等进行。目前应用较多的是美国GeneralScanning公司开发的基因芯片专用检测系统(ScanArray3000),采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集,由计算机处理荧光信号,并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。近期又开发出了ScanArray5000。

2在医学研究中的意义

2.1特异性相关基因的克隆寻找和鉴定疾病相关基因是从分子水平上研究疾病,揭示发病机制的一项重要基础性研究工作,利用基因芯片进行新基因克隆时,固定在芯片上的探针是某些cDNA文库内的cDN段。研究这些cDN段对应基因的差异性表达,就可能选到差异表达相关基因。如Schena等通过双色差示表达系统,研究人T淋巴细胞在热休克条件下和佛波酯作用下1046个未知序列的cDNA基因诱导表达的情况,并对诱导表达的cDNA进行测序,再与已知基因进行比较。结果发现,热休克诱导了已知的热休克蛋白基因的表达,其中包括分子伴侣和分子降解的中间体。同样,佛波酯引起了佛波酯调节基因的信号传导途径特征基因的表达,如激活细胞的磷酸酯酶和细胞因子κB1等。另外,还发现3个低表达的已知基因和4个低表达的新基因可能与该途径有关[4]。

2.2基因功能的研究研究基因功能,确定基因与基因间的相互关系,从而揭示疾病发生、发展的分子机制是医学研究的重要内容,也是基因表达芯片最重要的用途之一。Heller等采用基因表达芯片研究了类风湿关节炎、肠炎基因的特征性表达活性。分别用cyanine3(cyt3)和cyt5对类风湿关节炎组织和肠炎粘膜的cDNA进行标记后,与这两种疾病发生过程中目前已知可能起作用的基因阵列进行杂交,发现已知炎症相关基因,如肿瘤坏死因子、白介素和粒细胞集落刺激因子在组织中有表达。还发现一些以前未知的与炎症相关基因的表达,如人基质金属弹性蛋白酶(humanmatrixmetallo-elastase)和黑素瘤生长刺激因子(melanomagrowthstimulatoryfactor)。同时,与一个来自外周血基因文库的1046个cDNA克隆的阵列作这两种病变状态基因差异表达的比较,发现在类风湿关节炎组织中金属蛋白酶组织抑制物1,铁蛋白轻链和锰超氧化物歧化酶表达明显升高[5]。通过该研究,确定了许多基因与这两种病变的关系,为治疗和发病机制的研究提供了新的思路。

2.3基因突变的检测肿瘤和遗传疾病发生的根本原因是由于遗传物质发生了改变。检测基因突变对于阐明肿瘤及遗传病的分子机制、疾病的早期诊断具有重要意义。DNA芯片技术是一项高效、准确的DNA序列分析技术,将DAN芯片用于检测分子突变,不仅可准确地确定突变位点和突变类型,更主要的是它的快速高效是目前所用的其他方法无法比拟的,它可以同时检测多个基因乃至整个基因组的突变。如Chee等[6]用含有1.35×105个长度为25nt的寡核苷酸探针,分析了16.6kb的人类线粒体基因组DNA(mtDNA),共分析了10个样本,检测出了505个多态性位点,并在Leber′s遗传性视神经疾病患者的mtDNA中检测出3个致病性突变位点。Hacia等[7]在1.28cm×1.28cm的芯片上固定了9.66×104个长度为20nt的寡核苷酸探针,用于检测乳腺癌基因BRCA1的exon11(3.45kb)中所有可能的碱基置换、插入和缺失(1～5bp)突变。针对每一个位点,共有28个独立的探针,14个针对有义链,14个针对反义链。14个探针包括2个野生型,3个碱基置换、4个插入突变、5个碱基缺失。在15例患者样品中,发现有14例有基因突变,类型包括点突变、插入及缺失等;在20例对照样品中均未检出假阳性结果。Cronin等[8]分别用两种DNA芯片检测囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)的突变,其中一个芯片包含1480个探针,检测了CFTR基因的第10和11外显子的已知突变,包括缺失、插入和单碱基置换,并分析了10个未知样品的CFTR基因,其结果与PCR-RELP的分析结果完全一致。DNA芯片还被用来检测β-地中海贫血患者的基因突变,并在β-球蛋白研究上检测出了3个突变位点。

2.4感染病毒的检测Affymetrix公司开发了HIV病毒检测芯片。国内博道公司已研制了检测丙型肝炎病毒(HCV)的基因芯片,他们选取40个HCV基因作为探针制备微阵列,对13个丙型肝炎患者血清和12个正常人血清样本进行检测,结果准确率达100%。

2.5毒理学研究Nuwaysir等[9]研制了包括涉及细胞凋亡、DNA复制和修复、氧化应激/氧化还原内稳态、过氧化物酶体增殖反应、二噁英/多环芳烃反应、雌激素反应、看家基因、癌基因和抑癌基因、细胞周期控制、转录因子、激酶、磷酸酶、热休克蛋白、受体、细胞色素P450等共2090个基因的毒理芯片(ToxChipv1.0),该芯片既可用于毒物的检测和遗传多态性的检测,又可用于受检毒物的毒作用机制的研究。最近,Holden等从人和小鼠文库中选择约600个与毒理学相关基因的cDNA克隆,制备了种属特异的毒理基因组学芯片,可研究肝脏毒性、内分泌干扰、致癌作用等毒性终点的作用机制,也可用于确定以基因表达模式为基础的化合物的毒性。

2.6药物作用机制的研究基因芯片是研究药物作用机制潜在的强有力工具。如有两项研究分别报道了高密度微阵列芯片在检测药物对模式生物酵母基因表达影响中的应用。Gray等[10]报道通过测定药物使用前后mRNA水平的变化,分析了激酶抑制剂对酵母大规模基因组的影响。而Marton等[11]报道了免疫抑制药物FK506的基因表达模式特征,与此相同的模式在携带FK506靶基因无效突变的酵母细胞中也能观察到,从而确定了一种基因功能通过遗传和药理作用消除后可导致基因表达的类似变化。Clarke等[12]用基因芯片研究了肠癌患者化疗前和治疗期间肿瘤基因表达情况,发现丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶治疗均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表达增加。该研究提示,这类研究既有助于阐明药物的作用机制,也有助于确定药物作用的靶基因,为新药研究提供线索。

3展望

尽管基因芯片发展时间不长,前几年又着重于芯片技术的发展,迄今在医学研究实际应用中的例子还不多,但由于芯片技术与传统的杂交技术相比,有检测系统微型化,对样品的需要量非常少,效率高,能同时分析数千种作为遗传、基因组研究或诊断用的DNA序列,更好地解释基因之间表达的相互关系及检测基因表达变化的灵敏度高等优点。基因芯片在医学上的应用前景无疑是非常广阔的,如中西药物的筛选、疾病的诊断、环境污染的检测、基因药物设计、疾病发生和发展机制的探讨等。1999年NatureGenetics杂志出版了增刊,邀请专家对基因芯片正朝着以下几方面发展,一是提高探针阵列的集成度,如有多家公司的芯片阵列的集成度已达1.0×104左右,这样基因数量在1.0×104以下的生物体的基因表达情况只用一块芯片即可包括,而人类的基因也可能只需10块左右芯片就可包括。二是提高检测的灵敏度,如检测系统的优化组合和采用高灵敏度的荧光标志。三是研制新的应用芯片,如1999年美国环保局(EPA)组织专家研讨会,讨论了毒理学芯片的发展策略。四是研制芯片意大利读器(检测系统)和分析软件,以充分利用生物信息。五是方法的标准化和降低成本,这是目前推广应用的主要障碍之一。就医学研究而言,从目前来看,选择什么基因固化探针是一个非常关键的问题,因为这将决定研究成果的重要程度。21世纪是生命科学的世纪,也是信息科学的世纪,作为集两者之大成的基因芯片,不久的将来可能象PCR仪一样成为生命科学研究的工具,其研究和应用将会带动学科研究的整体进步,大大推动生命科学特别是医学的发展。