本文作者：吕琦1吴峰1，2林洁1谭仲夏3秦西云3夏振远3莫笑晗3马岚2作者单位：1云南大学2清华大学3云南省烟草农业科学研究院

抗原的制备

经工程菌BL21诱导表达并纯化所得的rTMV－CP－F蛋白经过SDS－PAGE电泳分析，rTMV－CP－F蛋白相对分子质量为31ku(图3)，符合目的蛋白的大小，最终所得的rTMV－CP－F蛋白纯度为95%，满足免疫实验要求．

免疫小鼠抗血清分析

4只Balb/c免疫小鼠的血清抗体滴度都在10－5～10－6间，表明免疫效果比较好．

单抗细胞株的制备

4只免疫小鼠分2次进行细胞融合，融合细胞经筛选培养、有限稀释法单克隆化筛选培养后，共获得14株能稳定分泌抗体的细胞株．用质量浓度5mg/L的rTMV－CP和5mg/L的TMV病毒颗粒分别包被酶标检测板，并用脱毒烟叶提取液包被作为阴性对照，间接ELISA法检测14株细胞的培养上清液，结果表明这14株细胞所分泌抗体与rTMV－CP和TMV病毒颗粒均有特异性反应，与脱毒烟叶提取液无特异性反应(图4)．

抗体的亚类及轻链型

获得的14株细胞所分泌的抗体都经间接法ELISA分析后，抗体亚类都为IgG1、轻链型都为κ型(表1)．

抗体制备和鉴定

将14株细胞进行腹水制备和抗体纯化，腹水的抗体滴度都在1∶106～1∶107范围内，腹水经ProteinA一步法纯化后，抗体纯度在80%以上，其相对分子质量在150～160ku．

抗体的特异性分析

选取感染TMV烟叶的提取物作为阳性对照，表观正常的土壤培育植株及其土壤样本、实验室脱毒的植株及其培养物样本作为阴性对照，同样用间接ELISA的方法来检测抗体的特异性，包被浓度为1∶500．用质量浓度5mg/L的ToMV包板，检测其与抗TMV抗体的交叉反应．14株抗体与染毒烟叶都有特异反应．在阴性对照中，田间土壤栽培烟叶提取物、实验室栽培的脱毒烟叶提取物与12株TMV单克隆抗体无特异反应，只有2对抗体(3D7a、3D7b)有微弱的反应．14株抗体与ToMV无交叉反应(图5)．

讨论

TMV－CP在引起烟草花叶中起决定性的作用，感染TMV的烟草叶绿体中存在大量的TMV－CP［16］，因此将TMV－CP作为免疫原制备抗TMV抗体对于提高其准确性和特异性都具有重要意义．rTMV－CP和天然TMV病毒颗粒存在类似的表位［17］，但是由于rTMV－CP的原核表达导致其构象多样，在单独免疫小鼠时会造成表位的混乱，导致抗体不能识别天然TMV病毒颗粒，因此本研究采用将2种抗原混合后共同免疫，再用2种抗原同时筛选所得抗体，这样所得到的抗体即能同时识别TMV－CP和天然TMV病毒颗粒．通过将TMV－CP和天然TMV病毒颗粒混合免疫，最终得到14株可以稳定分泌抗TMV抗体的杂交瘤细胞．所制备腹水经ProteinA一步法亲和层析纯化所得抗体，抗体效价在1∶106～1∶107范围，抗体纯度在80%以上．14株抗体均与TMV－CP重组蛋白和TMV病毒有良好特异反应．同时，针对将来抗体的应用范围选取了测试抗体特异性的实验．所制备的抗体的特异性高与ToMV无交叉反应，为下一步研制免疫检测试剂盒提供了重要材料．