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浅谈痘病毒克隆技术的研究

发布时间:2013/11/11 10:11:51   阅读:

1材料与方法

下游引物P,下划线处分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。上述引物由大连宝生物工程有限公司合成。L基因的克隆与鉴定以绵羊痘病毒基因组DNA为模板,采用50μL体系进行PCR扩增。将纯化的PCR产物与mple克隆载体连接,并将连接产物转化至DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆培养后小量制备质粒进行酶切鉴定,并测序。绵羊痘病毒E3蛋白的生物信息学分析将测序结果应用NCBI数据库ORFfinder程序推导出相应的氨基酸序列,并应用Weblab服务器中法对SPPVE3蛋白和VVE3蛋白的核苷酸和氨基酸序列进行比对。二级结构、蛋白质柔性区域分析分别使用软件的法和法进行预测。蛋白中氨基末端和羧基末端2个功能域的三级结构使用SWI服务器进行预测。重组载体的构建及重组蛋白的诱导表达、纯化E3L重组载体和表达载体pGEX4T-1分别用酶切后,经琼脂糖凝胶电泳检测后用凝胶回收试剂盒回收目的条带,16℃连接过夜,并转化至DH5α感受态细胞。毒株绵羊痘病毒古浪株由中国农业科学院家畜疫病病原生物学国家重点实验室分子免疫与环境控制课题组分离、鉴定和保存。主要试剂TaqDNA聚合酶、载体、大肠杆菌菌株连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ均购自大连宝生物工程有限公司;pGEX4T-1表达载体表达菌、GST结合树脂和硝酸纤维素膜购自公司;氨苄青霉素、IPTG、弗氏佐剂和辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗山羊IgG购自Sigma公司;HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自公司;化学发光底物购自公司;X光底片、显影及定影液均购自柯达公司;其他试剂均为进口分析纯。引物的设计与合成根据GenBank中登录号为的基因组序列,利用软件设计了1对引物,预期扩增产物的大小为534bp。上游引物P,挑取阳性克隆培养后小量制备质粒进行酶切鉴定,并测序。将鉴定正确的重组载体转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞,37℃振荡培养至时,加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导培养离心10min收集菌体,处理后进行检测。用裂解缓冲液重悬诱导表达的菌体,在冰浴条件下进行超声破碎(超声5s,停8s)至溶液澄清,离心,分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE,分析重组蛋白SPPVE3的可溶性。重组蛋白使用Novagen公司的GST结合树脂进行纯化。重组蛋白鼠抗血清的制备及分析选取周龄的BALB/c小鼠进行免疫:初次免疫时,用纯化后的重组蛋白SPPVE3与等量弗氏完全佐剂混合,经乳化后皮下多点注射;第14天,用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合,乳化后加强免疫。二免后第14天采血,分离血清,用纯化的重组蛋白SPPVE3包被ELISA板,进行间接ELISA试验,测定血清效价。

2SPPVE3L基因的序列分析与结构预测经测序分析

SPPVE3L基因全长534bp,编码177位氨基酸,分子质量约为。使用法分析,基因与VVE3L基因的核苷酸序列具有50.8%的一致性,在氨基酸水平上具有34.9%的一致性(50.0%的相似性。从功能结构域的氨基酸序列分析蛋白的氨基酸末端序列与E3蛋白ZDBD相比具有28.2%的一致性(47.4%的相似性),而羧基末端与DRBD相比具有41.9%的一致性(52.7%的相似性)使用法预测蛋白的二级结构,发现α-螺旋主要存在于位氨基酸;β-折叠主要分布于位氨基酸;利用法预测蛋白质柔性,结果表明较大的柔性区域分布于位氨基酸。根蛋白结构预测服务器,对SPPVE3蛋白的氨基末端和羧基末端2个潜在的功能结构域氨基酸序列进行蛋白三级结构的同源建模。构建的氨基酸区域分别为3~71和102~173位氨基酸,参考模板分别为E3蛋白的Z-DNA结合域和PKR的dsRNA结合域。序列一致性分别为40.58%和26.027%,E值分别为E-21和1.8E-16,表明模型构建可靠。重组质粒的鉴定及重组蛋白的诱导表达与纯化经酶切鉴定(见图6)及测序鉴定,表明E3L重组载体构建正确。含有重组载体的BL21(DE3)pLysS重组菌在浓度为1mmol/L条件下诱导4h后,经E电泳分析,显示在46ku处表达出一条明显的条带,分子质量与预期大小一致。经可溶性分析,表明重组蛋白主要以可溶形式存在于菌体中,经GST结合琼脂可纯化出目的条带重组蛋白SPPVE3鼠抗血清的制备分析用绵羊痘病毒标准阳性血清和制备的鼠抗血清对SPPVE3蛋白进行分析,结果显示所制备的鼠抗血清可以与重组蛋白发生反应。对制备的重组蛋白SPPVE3鼠抗血清进行间接ELISA检测,其效价为。

3讨论

蛋白是痘苗病毒中重要的免疫逃避因子,主要由位于氨基酸末端的ZDBD和羧基末端的DRBD两个关键的功能结构域组成。其中,E3蛋白的羧基末端能够通过其dsRNA结合域阻断病毒复制周期中产生的dsRNA,抑制了Toll样受体、人视黄酸诱导基因/RIG样受体以及细胞内PKR和OAS等各类抗病毒信号通路和抗病毒分子的活性,病毒得以正常复制。目前,除了VV外,E3蛋白的同源蛋白在羊口疮病毒(ORFV)中已进行了较为深入的研究,结果显示在体外细胞试验中,ORFVE3蛋白取代VVE3蛋白后构建的重组病毒VV/ORFVE3与野生型VV致病性并无明显差别,但在动物试验中,的致病性显著降低。等报道SPPV基因组的第34号开放阅读框编码VVE3蛋白的同源蛋白,表明SPPV可能编码类似VVE3蛋白的免疫逃避因子。SPPV主要引起感染绵羊全身皮肤(特别是身体无毛部分)出现典型的痘疮,造成家畜产奶量下降、体重减轻、流产率增加以及对肺炎和皮毛蝇蛆病的易感性增加,同时也会造成直接死亡。本试验中,笔者以绵羊痘病毒甘肃古浪株为模板克隆出绵羊痘病毒E3L同源基因,基因全长534bp,编码177个氨基酸。经过序列比对,SPPVE3蛋白与VVE3蛋白核苷酸序列的一致性达到50.8%,而氨基酸序列一致性为34.9%(相似性为50.0%)。从功能结构域角度分析,SPPVE3蛋白与VVE3蛋白ZDBD的一致性只有28.2%(相似性为47.4%);而DRBD一致性虽然高达41.9%(相似性为52.7%),但在决定dsRNA结合活性的和A174氨基酸残基中,第174位氨基酸残基中A→S的突变可能使其dsRNA结合活性大大降低,推测SPPVE3蛋白对干扰素的抑制效应将会减弱。在本研究中,以pGEX4T-1为载体,表达出大小为46ku左右的重组蛋白。利用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠获得鼠抗血清,经间接ELISA测定效价为。利用制备的抗体能够分析SPPV在感染细胞后E3蛋白的表达情况以及对PKR等抗病毒分子的影响,为阐明羊痘病毒的致病机理奠定了基础。

作者:于少雄颜新敏吴国华赵志荀单位:中国农业科学院

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