1材料与方法

1.1试验材料

本试验于2010年12月至2012年10月在金陵科技学院幕府校区试验站进行。穴盘育苗至3～5片真叶时定植到田间,正常栽培管理,翌年3月植株开始抽薹后进行取材。

1.2试验方法

1.2.1取材和染色处理

于晴天上午10:00左右取完整花序。根据花蕾形态特征,将处于不同发育时期的花蕾分为以下5等级:小于<1.49mm,1.50～1.99mm,2.00～2.49mm,2.50～3.0mm,>3.00mm等5个级别。取不同级别的花蕾,用卡诺氏液固定24h,70%酒精中保存备用。利用稀释3倍的爱氏苏木精整体染色,用蒸馏水进行还蓝处理1～2d。

1.2.2石蜡切片法参考

方法并改进,用30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→纯乙醇处理各3～5min,最后用吸水纸吸干多余的乙醇。透明处理为等量无水乙醇及二甲苯1～2h,二甲苯1～2h。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min,再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20～30min。将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡,一起倒入容器内,然后立放入包埋机中,使其立刻凝固成蜡块。调整厚度调节器到所需的切片厚度为8μm,用电脑快速冷冻石蜡两用切进行切片。取1片清洁的载玻片,滴1滴粘片剂于玻片中央,然后用洗净的手指加以涂抹,便成均匀薄层,滴1～2滴的蒸馏水于已涂粘片剂的载玻片上。用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带,放在水面上,注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上,然后放在展片机上烘干,温度为75°C左右。石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5～10min,然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3～5min。用阿拉伯树胶封存并使用显微镜镜检拍照记录。

2结果与分析

2.1普通白菜花蕾长与花粉发育时期的关系

此时适宜取材进行花药或小孢子培养。当花蕾长在2.50～3.00mm时,夏绿2号中90%的花粉处于单核期,其余花粉处于第一次分裂时期或双核期;夏浪中95%的花粉处于单核期,其余花粉处于第一次分裂时期或双核期;京冠1号处于单核期花粉为98%,其余花粉处于第一次分裂时期或双核期。此时是最适宜进行花药或小孢子培养的时期。当花蕾长>3.00mm时,小孢子进入双核期和三核的成熟花粉粒时期,单核期花粉低于10%,此时已经不适宜进行花药或小孢子培养。

2.2菜薹花蕾长与花粉发育时期的关系

日本甜脆的单核花粉百分率在2.50～3.00mm的时候最高;而50天油绿菜心和80天油绿菜心的单核花粉百分率在1.50～2.49mm的时候最高。由此可得:日本甜脆取材的最佳时期在花蕾长为2.50～3.00mm;50天油绿菜心取材的最佳时期在花蕾长为1.50～2.49mm;80天油绿菜心取材的最佳时期在花蕾长为1.50～2.49mm,而在花蕾长为3.50～4.00mm的时候则都不适合取材。

3结论与讨论

3.1花粉各发育时期特征

普通白菜和菜薹的花粉发育的各个时期与其他十字花科植物相似。单核靠边期,细胞壁加厚成三裂状,细胞核至细胞壁的一侧;双核期,细胞逐渐成椭圆形,形成两个大小不同的细胞,体积大的为营养细胞,体积小的为生殖细胞;三核期,花粉内可看到3个核,即1个营养核和2个精核。三核期内有大量花粉积累,成为成熟花粉粒。由此得出,通过对花粉细胞各个发育期细胞特有形态特征的观察,可以快速判断出花蕾中花粉细胞所处的时期,如小孢子表现为正圆性状,细胞核被挤到细胞边缘,即为单核靠边期的特征标志。

3.2花蕾长度与花粉发育时期的关系

花蕾大小与小孢子发育阶段关系密切,因此根据花蕾长度取材是一种快捷、准确地用于花药或游离小孢子培养选择花蕾的方法。本试验认为,花蕾长度在2.00～3.00mm时,花粉基本处于单核后期和双核早期。对于普通白菜,2.50～3.00mm长的花蕾绝大多数花粉处于单核靠边期和双核早期,是进行花药或小孢子培养的适宜取材时期;对于菜薹而言,1.50～3.00mm长的花蕾绝大多数花粉处于单核靠边期和双核早期,是进行花药或小孢子培养的适宜取材时期。2.00～3.00mm长的花蕾适宜进行花药或小孢子培养,这与青花菜[5]雄配子体的动态发育过程结果较为一致。

3.3石蜡切片法的特点

石蜡切片法是植物组织学和发育生物学研究中常用的实验方法,通过使用石蜡包埋所需观察的组织(如叶片组织、花芽分化组织等),经切片得到的制片可进一步用于细胞学研究。同其他方法如薄片切片法等相比,石蜡切片法能包埋较大块的材料,可观察的细胞视野也较全,适合观察组织整体的连续发育过程。虽然石蜡切片的制作过程并不复杂,但影响切片质量的因素较多,如脱水时间、包埋温度、染色液的选择等,因此要制备1张高质量的石蜡切片,每一个操作步骤都非常关键。本试验采用石蜡切片法,对白菜不同变种‘普通白菜’和‘菜薹’的花蕾进行组织包埋、固定和切片,鉴定出花粉细胞发育的各个时期,并根据外观长度大小找出单核靠边期的花蕾特征,以期为白菜花药或小孢子培养提供取材依据。

作者：王倩曾靖陶琪何静雯徐宜霞崔群香朱丽梅单位：金陵科技学院园艺学院