微生物的纯培养步骤范文第1篇

一、无菌检查方法验证

在张新妹老师的耐心指导下，对注射用IABEPILONE及其溶媒、CCI-779注射用浓溶液及其稀释液、头孢米诺钠、注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠（4：1）、头孢替唑钠、头孢西酮钠、注射用头孢噻肟钠、注射用头孢他啶他唑巴坦钠（6：1）、阿莫西林钠克拉维酸钾、盐酸安妥沙星氯化钠注射液等十余种注射剂及原料进行了无二、菌种保藏、传代等相关技能对117株菌株冻干粉进行了复苏、传代、保存，熟练掌握了复苏菌种冻干粉的技能；通过实验中多次的菌种接种、培养、菌液稀释操作，掌握了比浊法稀释霉菌孢子悬液，达到了操作规范、熟练，稀释菌液CFU计数相对稳定，从而保证了验证实验的顺利进行。进一步掌握了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌。

三、微生物检查、菌株分离、纯化、鉴定等技术

为了解市场上保健品的微生物质量情况，在马越老师的指导下，协助张新妹老师对市售保健品的品种进行了市场调查，设计了实验方案，并对19种保健品进行了微生物检查，采用了不同于药典的稀释液及培养基，更有利于微生物生长。对培养皿上生长的菌落挑选具有代表性的十余种典型菌落进行了分离、纯化，革兰染色、镜检以及初步鉴定，对霉菌孢子进行了涂片镜检，从形态学上初步鉴定其为曲霉属。通过上述工作，增长了知识，熟悉了操作步骤，开阔了视野。

四、微生物限度检查方法验证

对青霉素V钾片进行了微生物限度检查方法的验证。独立完成了厂家提供的英文实验资料的翻译工作，并根据厂家提供方法，参照中国药典，设计了验证实验方案，采取β-内酰胺酶法进行了三次平行验证实验。学习了中药制剂微生物限度检查方法验证的基本思路、步骤、回收率的计算以及如何根据计算结果选择微生物限度检查实验方法。掌握了微生物限度检查方法验证的实验原则、方法、步骤以及实验结果判定标准，对于以后回到本所的微生物限度检查实验工作具有重大指导意义。

五、细菌内毒素检查及干扰试验

向老师学习了细菌内毒素检查以及干扰试验操作，进行了4种不同规格的注射用头孢他啶他唑巴坦钠和盐酸安妥沙星氯化钠注射液的细菌内毒素检查实验。

通过这两个月的学习，得到很大的收获。感谢老师的指导和信任，放手让我独立完成实验，使我锻炼了思考和解决问题的能力，理论水平和业务能力大有提高。张新妹老师还在工作态度、实验中的自我保护意识以及生活、做人道理等方面给我很多指导和帮助，我在此向她表示由衷的感谢。

微生物的纯培养步骤范文第2篇

【关键词】 药物发现；,,环境基因组；,,未被纯培养微生物；,,土壤DNA文库；,生物活性物质

摘要： 土壤是微生物最重要的生境，土壤微生物具有极大的多样性。然而传统培养技术只能得到约1%的微生物纯培养，其余都是未被纯培养微生物。利用土壤环境基因组技术，可以把未被纯培养微生物的基因克隆到载体中并在宿主中进行表达，获得比已培养微生物丰富的代谢产物多样性，这为我们发现新颖结构先导化合物以及新药开辟了新的道路。本文介绍应用环境基因组技术构建土壤DNA文库的思路和方法。

关键词： 药物发现；　 环境基因组；　 未被纯培养微生物；　 土壤DNA文库； 生物活性物质

Soil metagenomics and its application for new drug discovery

ABSTRACT Soil is the most important habitat for microbes. Soil microbes are of considerable diversity. However, only about 1% of soil microbes are cultivable with traditional techniques, others are all uncultured microorganisms. The gene of uncultured microorganisms can be cloned to vectors and expressed in host by soil metagenomics. Highly diversified metabolites can be obtained than those obtained from cultured microorganisms, which pave the way of discovering lead compounds with novel structure or even new drugs. In this review, the idea and method of constructing a soil DNA library by metagenomics is introduced.KEY WORDS Drug discovery; Metagenomics; Asyet uncultured microorganisms; Soil DNA library; Bioactive substance

自从1928年Alexander Fleming发现点青霉中存在抗菌物质后，在微生物次级代谢产物中寻找药物就一直是药物发现的热点之一。传统的微生物药物筛选方法是从环境中分离培养微生物，并对纯培养进行发酵以获得特定生理条件下的次级代谢产物，最后对产物中的活性成分进行分离、纯化和表征，以获得有临床价值的先导化合物。在经历了大规模抗生素筛选的黄金时代以后，微生物药物发现进入低速发展阶段。抗生素滥用导致的耐药性问题使得人们努力从微生物中寻找新的抗生素，尤其是具有新结构的抗生素先导化合物。然而，传统分离培养方法的局限性，从环境中分离得到新类群越来越困难，即使分离得到的微生物，菌株的排重问题也难以得到解决。传统技术越来越难以增加微生物次级代谢产物的多样性，也不能满足高通量筛选的需求。决定微生物次级代谢产物多样性的因素主要有：待筛选物种数量及其多样化程度；物种的新颖性及其产生新次级代谢产物的潜力［1］。天然产物的复杂性和新颖性永远超乎人们的想象，自然环境中存在的微生物多样性也远远超出人们的常识。实际上，可培养的微生物只占整个微生物类群很小的一部分，未被纯培养微生物(asyet uncultured microorganism)蕴藏着一大批未开发的药物资源。通过环境基因组(metagenomics)的方法，即从土壤样品中提取总DNA，纯化，部分降解，把酶切片断放入载体中，在诸如大肠埃希菌等容易发酵的微生物中表达。人们已开始探索这一未知领域，并报道了由新颖序列编码的表达酶活性和抗生素活性的克隆［2］。

1 土壤中微生物的多样性

土壤微生物是最有价值的天然产物源泉之一，它们提供了许多工业上十分重要的抗生素以及生物催化剂。芽孢杆菌、丝状真菌、放线菌以及粘细菌都有惊人的产生多样化次级代谢产物的能力。Hammond估计地球上的微生物物种多达16×109，广泛分布于各种生态系统中［3］，其中，土壤无论从微生物数量和种类上都是首屈一指的生境。运用重组动力学的方法，Torsvik等估计1克土壤中约有大于4000种不同的微生物［4］，而这个数字到2002年已增长为10000种［5］。但是，运用现有的技术，只有02%～2%的土壤微生物是可培养的［6］，重复发现的机率极高，例如放线菌中抗生素重复发现的概率已达到99%［7］。对于细菌来说，现有的培养技术无法满足微生物生长需求是一个重要原因，许多微生物需要借助土壤殊的营养成分、土壤颗粒或者不同细胞间的信号来完成重要的生理功能；对于真菌，取样不足可能导致了人们对其多样性的低估。幸运的是，土壤微生物资源并未开发殆尽，人们正在努力寻找开发未被纯培养微生物或难培养微生物的方法。Button等用稀释培养的方法培养了贫营养水环境中的细菌，并证明添加营养刺激少数微生物生长的同时，抑制了绝大多数微生物的生长［8］。还有人模拟微生物的自然环境来优化离体的纯培养物分离。这些方法一定程度上证明了未被纯培养微生物的广泛存在，同时也启发了研究未被纯培养微生物的新思路。

2 环境基因组技术

随着基因组技术的发展，人们开始用分子生物学的方法来研究微生物间的进化关系和遗传信息的功能关系。环境基因组又称多源基因组或宏基因组，是指从环境中提取总的DNA，对其进行遗传学和功能学的研究。优点是不但可以原始地反映环境样品中所有生物的遗传多样性，避开难培养这一技术瓶颈，而且可以把细胞外的DNA一并研究。通过环境基因组的方法可以获得越来越多的DNA序列，且大都是新颖的未被纯培养微生物的序列。运用环境基因组序列不但可以使我们逐渐了解微生物群落功能的复杂性，以及微生物间的相互作用关系，而且可以使我们深入了解未被纯培养微生物的生理和生态特征［9］。研究药物发现相关的新颖基因，自然要把目标锁定在环境基因组中编码新颖次级代谢产物的基因上。在土壤总DNA中，编码次级代谢产物的基因经常是成簇存在的，与同一个次级代谢产物相关的基因的生物合成区域和调节区域经常是紧密相连的。这些相连的基因使得克隆到载体中整个次级代谢产物途径基因是一个连续的片段。在药物发现中，生物合成基因和抗性基因也是连在一个片段上的，对于有毒的代谢产物，宿主可以通过共表达的抗性基因带来的抗性机制来避免毒性［2］。这一特点不但简化了对外源片段进行剪切和修饰程序，而且使重组子的筛选更加方便，无疑为功能基因的克隆和表达提供了便利。应用土壤环境基因组技术发现药物的基本思路是：通过从土壤中的环境基因组(一般是土壤微生物总DNA)建立DNA文库［10］，将其克隆到实验室条件下可以培养的宿主(一般为通用性较强的大肠埃希菌)中，进一步研究未被纯培养微生物次级代谢产物的化学多样性(图1)。这种新方法要求必须从土壤中分离纯化DN段，并与大小合适的筛选载体和表达载体连接以实现克隆。载体在插入大片段的DNA后必须保持稳定性，才能在宿主中实现稳定和大量的表达。

3 土壤DNA的分离提取

与其他基因工程技术不同，土壤环境基因组技术所需要的DN段不是来自已知菌中已熟知的基因片段或基因簇，而是来自完全未知的土壤样品中，对其可能具有的潜在功能也并不知晓。从土壤中提取和纯化微生物的总DNA是关键性的第一步，因为DNA的纯度和片段的大小直接决定了后续基因操作能否顺利进行。从土壤中提取DNA需要体现完整的基因多样图1 土壤DNA文库的建立步骤性，其方法主要有两种：(1)对土壤样品中的原位细胞进行裂解后直接提取核酸物质，然后对DNA进行纯化［11］；(2)从土壤样品中分离细菌细胞，再对细胞进行裂解和纯化［12～14］。直接裂解提取环境总DNA的方法在以往的几十年中已经得到了应用，这种方法处理时间短，DNA的产率较高。首先通过物理、化学的方法破坏细胞壁和细胞膜。物理方法主要有珠磨匀浆、煮沸、微波、冷冻解冻循环和超声波裂解法［2］，物理方法破坏较小的细胞和孢子［15］效率很高，但同时也导致大量DNA链的断裂［16，17］；化学裂解的试剂和条件包括SDS+加热、渗压休克、NaOH、溶菌酶、蛋白酶K或肽酶等处理［2］，运用最多的还是SDS+加热，佐以螯合剂EDTA和各种Tris或磷酸缓冲液［18］。裂解后释放出来的DNA需要经过提取和纯化，这是关键性的步骤。土壤中的多酚类物质(尤其是腐殖酸)可随DNA一起纯化，抑制限制性酶的活性和PCR扩增［19］，以及改变定量杂交的信号［20］，还可使生物分子变性，因此在纯化过程中必须予以去除。有机溶剂、羟磷灰石柱、CsCl密度梯度离心都可用于去除腐殖酸，效果较好的当推聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在多数研究中，直接裂解的方法都不能产生长度<20kb的DN段，如果用于构建插入片段较长的环境基因组文库，这种方法显然不足以胜任［21］。微生物细胞提取法主要步骤：(1)土壤颗粒的悬浮；(2)根据沉降速度、密度或者两者的不同从土壤颗粒中离心获取细胞；(3)提取细胞的裂解；(4)DNA的纯化［21］。悬浮的方法主要有器皿搅拌悬浮、旋转捣碎、超声波、震荡悬浮等，以前两者的效果为佳。化学方法常与物理悬浮方法相结合，但也带来一些负作用。离心需要经过低速和高速两个阶段，前者可除去土壤碎片、真菌菌丝体和较重的土壤颗粒［22］；后者除去一些非细胞物质和土壤污染物(如腐殖酸)。提取细胞的降解方法与直接降解中所用的方法类似，氯化铯溴化乙啶平衡梯度离心的方法已成功地用于大片段DNA(>48kb)的纯化［23，24］。直接裂解获得的DNA较完整，得率高，工作量小，但DNA易被剪切，含有污染物，为胞内胞外混合的基因组。与之相比，较费时的间接降解指向特定的原核生物类群，可以获得高纯度和高分子量的DNA［21］。

4 土壤DNA文库的构建

用限制性内切酶部分降解从土壤中纯化后的环境基因组DNA。典型大小片断的选择是通过脉冲场凝胶电泳完成，待酶切的DN段大小需要比插入片段至少长3倍，即如果需要较大的插入片段(>100kb)，就需要几百kb的DNA，但如此长的DNA极易断裂，所以需要不断的使用修饰的方法来减少降解过程的步骤。Quaiser等用钝化末端克隆的方法在载体pEpiFOS中建立了一个土壤环境基因组文库，文库中有25×104个克隆，随即插入片段长度从325kb到435kb不等［2］。由于编码次级代谢产物合成的基因通常成簇存在，大小从十几kb至上百kb不等，所选用的载体也不同。克隆土壤环境基因组DNA的载体包括质粒、粘粒和人工染色体(BAC或YAC)。质粒和粘粒适合插入长度适中的片断(38～52kb)，其克隆效率较高。克隆大片段DNA必须选用BAC作为载体，虽然效率较前者低，但可携带>100kb的DN段，并在宿主细胞中稳定保持1～2个拷贝。一个运用比较成功的BAC载体是pBeloBAC11，它具有2个选择性克隆标记：基于颜色的重组体筛选基因Lac Z和氯霉素抗性基因。此外，它有三个独特的克隆位点，位于T7和SP6启动子的侧面，NotⅠ切割位点的两侧。pBeloBAC11的调节基因包括oriS和repE，它们可以介导F因子的单向复制，parA和parB保持每个细胞中的拷贝数为1～2。通过电穿孔转化大肠埃希菌，人们已成功的用这一载体构建了土壤环境基因组文库［25］。大多数环境基因组文库选择大肠埃希菌作为克隆和表达的宿主，优点在于具有较高的转化效率，产生的初级代谢产物简单，不会对异源次级代谢产物的表达产生影响，易于扩大发酵规模。应用最广泛的是一类称为DH10B的大肠埃希菌突变株［26］；BAC用于原核生物中异源基因的表达也有报道。用革兰阳性菌蜡状芽孢杆菌的基因组DNA在大肠埃希菌构建BAC文库。纯培养的蜡状芽孢杆菌产生的次级代谢产物中检测到具有10种生物活性，在大肠埃希菌BAC文库里发现其中的6种，包括脂肪酶、氨苄西林抗性、淀粉水解和橙色素的分泌［27］；其他宿主如链霉菌和芽孢杆菌的研究近年也有报道［28］，提示开发可以在大肠埃希菌和其他宿主之间穿梭的载体，无疑为扩大宿主系统和代谢背景，增加药物发现的几率创造了条件。

5 土壤环境基因组文库的筛选方法

从环境基因组文库中筛选具有生产新颖化合物潜力的重组子主要有2种策略：基于功能的筛选和基于序列的筛选。基于功能的筛选需要借助自动取液和滴液机器人，应用高通量筛选技术对重组子产生的代谢产物生物活性进行测定。迄今，人们已在土壤环境基因组文库检测到了2种生物活性：酶活性和抗生素活性，分离到的异源基因产物有：indirubin［29］、violacein［7］、dexyviolacein［7］、tyrosine derivatives［7］和turbomycins A/B［7］(图2)。应用高通量筛选进行的功能筛选检出率不高，几千个克隆中只能检测出不到10个阳性克隆［30～32］，其原因除了检测手段的灵敏度之外，更重要的是异源表达的障碍使得转录、翻译以及蛋白包装和分泌难以在宿主中进行。这一问题将随着更优的载体和宿主的获得以及更灵敏的检测手段的开发而得以解决。

产物的结构式 基于序列的筛选着眼于能够编码有价值性状的新颖基因。全序列测定和随机序列测定对发现新基因都是有意义的，但前者用于研究微生物群落的生态关系意义更大，而后者则具有更强的针对性。例如最近人们应用鸟枪法研究萨加索海域的环境基因组，不但深入研究小生境的基因组结构，也发现了很多有价值的生物合成基因［33］。通过DNA微阵列技术寻找环境基因组序列中的有用片段也是一种全新的筛选技术，它可以快速有效的识别和描述许多菌落的特征，并可应用于大量保守基因的分离［34］。通过序列分析，人们可以发现许多新颖的序列，这些序列为我们发现结构特殊的次级代谢产物、乃至药物创造了条件。例如编码Ⅰ型或者Ⅱ型聚酮类物质的酶基因就是链霉菌合成聚酮类抗生素的关键基因［35，36］。

6 展望土壤环境基因组技术用于药物发现研究，可以建立一系列有应用价值的DNA文库。迄今为止，已经从环境基因组中发现了大量的编码生物技术中有用的酶基因甚至是整个生物合成途径基因。将来的工作将集中于如何将这些新颖基因及其产物整合到生物合成过程中去，以达到优化原有代谢途径或者创造全新的代谢途径。然而，环境基因组中新颖基因的大量发现也导致了一些技术瓶颈的出现。如何在保证基因片段长度的同时增加总DNA的得率和纯度，如何提高目的基因在异源宿主系统中的表达效率，如何开发除大肠埃希菌之外的其他原核和真核宿主都是亟待解决的问题。用环境基因组技术研究药物发现具有相当广阔的前景，但面对众多的的未被纯培养微生物资源，探索其遗传信息需要更加高效和快速的研究手段和技术。相信随着微生物学、基因组学、化学和检测技术的发展，环境基因组技术会为现代药物发现开辟出一条崭新的道路。

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微生物的纯培养步骤范文第3篇

【关键词】环境工程微生物学 实验教学 探索

环境工程微生物学是环境工程专业的专业基础必修课。它是生命科学和环境科学与工程的交叉学科,具有极强的实践性和应用性。环境工程微生物学实验是加深学生对理论知识的理解,培养学生实验技能、实验思维和动手能力的一个重要途径。同时,该实验又是一门操作性很强的课程,需要大量的实验仪器,以及老师手把手传授实验技能,如果没有先进的教学方法做支持,掌握其中的操作技术是很困难的。下面提出几点心得体会,将有利于提高实验教学的质量,深化学生对微生物的认识。

1 让学生参与实验准备的全过程

实验室的前期准备工作是很重要,工作量要比实验课程多许多。老师除了要认真备课外,还需要对培养皿、试管、镊子等消毒灭菌,配制各种试剂,最好还要进行预实验,不但更加熟悉实验步骤,而且能保证实验课程的顺利进行。

通过让学生参与实验准备过程,可以让学生学习到完整微生物实验操作技术,这样一个完整流程学生完全参与下来,不但让学生体会到实验过程的艰辛,进而更加珍惜来之不易的实验课程,还可以培养学生科研思维,提高科研能力,使他们在课堂上学到的知识在实验操作中体会得更形象、更具体、更全面,从而激发他们学习兴趣。在巩固专业知识的同时,还培养了其发现问题、综合分析和解决问题的能力。这些对于提高学生的实际动手能力都有很大的帮助。

2 更新实验教学内容, 加大新知识和新技术的传授

微生物学和环境科学知识的更新推动着环境工程微生物学这门新兴的边缘学科不断向前发展。特别是日新月异的分子生物学技术已渗透到环境工程应用的各个领域。为了紧跟时代和学科发展的步伐, 培养高质量人才,让学生熟悉和掌握学科前沿新的理论知识和操作技术, 为他们将来工作研究或是硕士博士阶段的深造打下良好的基础。

例如,过去研究环境中微生物的方法是建立在平板分离基础上的,但迄今为止利用这种方法培养出的微生物只占总微生物种类的0.1％～10％。固体培养基其实是人类为微生物创造的人工培养环境,与微生物的实际生存环境有很大差异,用它来培养环境中的微生物相当于是对自然微生物群落进行了一次强制的人工筛选。所以,用平板分离的方法来研究自然环境的微生物生态时,往往不能准确反映微生物群落的实际组成和存在状态。分子生物学、基因组学和生物信息学等学科的发展及其向微生物学领域的渗透,形成一个新的交叉学科分支——微生物分子生态学 (molecular microbial ecology),它为我们全面客观地研究微生物生态系统提供了新的技术手段。微生物分子生态学是以微生物基因组dna的序列信息为依据,通过分析环境样品中dna分子的种类、数量和分布特征来反映微生物区系组成和群落结构[2,3]。所以,这项技术就需要研究者掌握dna提取及纯化技术、dna琼脂糖凝胶电泳技术和pcr基因扩增技术。针对这一点,我们就可以给学生设计一个微生物大实验,以活性污泥为样品,从dna的提取、纯化,凝胶电泳检测,到细菌16s rdna基因扩增,都让学生自己操作一遍。通过这一实验的学习,使学生对当今环境工程微生物学的前沿技术都有一定的了解和掌握。

3 增强不同实验间的连贯性,以及实验和理论知识的连贯性

3.1 增强各实验间的连贯性

过去实验内容多为孤立、连贯性不强的项目,各实验之间的内容重复较多,学生难以系统地把握微生物学实验,既浪费了有限的实验学时,又不利于培养学生的科学素养。对此,我们调整了实验内容,将原来独立设置的实验内容整合到一起,形成一个综合实验,通过一个综合实验就能使学生学到以前3-4个实验项目的实验技能。

3.2 增强实验和理论知识的连贯性

环境工程微生物学是一门实践性很强的学科,涉及到的内容覆盖面广,要学好这门课,仅仅依靠理论教学是远远不够的,实验教学可以弥补理论教学的不足,将微生物学的基础理论在实验教学中延伸、深化,并通过实验,加强基本技能的训练。

4 实现多媒体实验教学,更直观展现实验内容

环境工程微生物学实验中的各种微生物需要在光学显微镜甚至电子显微镜下放大才能看到。由于环境样品中微生物的复杂性和多样性,应用传统的实验教学方法不便于更好的展示微生物的形态结构、动态变化过程,多媒体教学与传统教学相比,能更加生动形象、栩栩如生的展现微生物的特点,提高学生的学习兴趣和参与度,从而使学生更好的掌握实验知识。

首先,可以在多媒体课件中放入大量彩色的宏观及微观图片、flas,从而更直观的反应微生物的形态特征,利于学生对新知识的吸收掌握,有了这些认识,才能在自己动手实验中达到很好的实验结果。

其次,也可以使用录像教学。教学录像具有较强的直观性,它可以通过屏幕清晰形象准确地展现每一个步骤,使学生掌握实验操作技能的关键所在。同时节约时间,提高实验教学的效率。如配置培养基实验,称量-溶化-调ph-过滤-分装-加塞-包扎-灭菌-搁置斜面-无菌检查等步骤,如果没有录像,需要老师反复强调实验顺序及注意要点,才能保证大部分学生配好正确的培养基。但是,如果有录像,老师只需要先播放一遍录像,从旁作简单介绍,播放完后再讲一下原理及注意要点,然后再播放一遍录像,学生就可以开始实验了。

最后,还可以利用电视显微镜进行教学。老师将样品放在显微镜下,找到微生物个体,让学生先有感性认识,然后再观察自己的样品。该方法既明确了实验目标,又能让全班学生同时看到老师显微镜里样品的特点,避免了以往同学们一个个排队去老师显微镜目镜里观察样品,提高了教学效率。

环境工程微生物学是一门来自实践的科学,学生掌握了它之后也最终要应用于实践。所以,实验教学是培养学生具备从事科学实验能力和严谨求实的科学素质的重要途径,许多问题还需要我们不断探索、实施和进一步完善。

参考文献

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[2] watanabe k,kodama y.molecular characterization of bacterial populations in petroleum-contaminated groundwaterdischarged from underground crude oil storage cavities [j].applied and environmental microbiology,2000,66: 4803-4809.

微生物的纯培养步骤范文第4篇

[关键词]执业资格 环境工程 环境微生物实验 创新能力

[中图分类号] G642.423 [文献标识码] A [文章编号] 2095-3437（2014）18-0151-02

目前，环境工程行业已有注册环保工程师、环境影响评价工程师等执业资格制度，环境工程专业从业人员取得相应的执业资格已逐步成为就业的重要因素和依据。[1] [2]而当前高校中原来的课程设置服务于学术型学士培养，专业课程存在重理论、偏实践等问题，面对科学技术的飞速发展和人才竞争的日趋激烈，原有的教学模式和方法也已经不能满足该执业资格体系下培养高级应用型技术人才的需要。[3]“环境工程微生物学实验”是环境工程行业执业资格体系中一门非常重要的专业理论与实践课程，其教学质量高低直接关系到本专业学生的综合理论知识水平和实践技能。因此，我们拟在多年实验教学实践的基础上，结合环境工程行业现行的执业资格制度，从培养计划和教学大纲入手，对该课程的教学内容、教学方法和考核方式等进行改革探索和实践尝试，以强化对学生工程素质与评判思维能力的培养。

一、国内环境微生物实验教学现状

（一）实验内容彼此孤立，知识难以融会贯通

环境微生物学实验安排往往彼此孤立，各个实验之间没有连贯性，且内容重复较多，学生对所做实验缺乏系统综合的概念。虽然能够掌握各个实验的操作过程和细节，但是由于环境问题的解决需要一系列知识点的串联，而导致理论知识和实际问题出现脱节，所学知识也难以融会贯通，无益于学生充分开发应用微生物技术解决环境问题的思路。[4]

（二）灌输式教学方式为主，验证性实验居多

事实上，国内许多环境工程专业本科生培养计划将环境微生物学实验作为课内实验，存在学分少，内容简单、重复等问题，这就形成传统的实验教学方式，即演示式和灌输式实验教学，即先由教师演示并讲解本次实验的目的、原理、所需材料、操作步骤及注意事项等，然后学生分组按操作步骤进行实验，所做实验基本上都是验证性的。另外，由于实验课时少，大部分教师在实验开始前会将样品、灭菌及实验材料都准备好，这样做既不益于培养学生的动手能力，又会降低实验的完整性，整个过程缺少教师和学生的互动，学生在实验过程中没有进行独立思考，这无疑无益于学生创新能力的培养。[4] [5]

（三）教学内容陈旧，跟不上现代微生物技术日新月异的发展速度

在现代微生物技术日益进步、日益发展的今天，很多高校的实验教材却数十年如一日，没有及时更新，甚至有些实验方法和设备已遭淘汰，无法满足学生的求知欲，也无益于拓宽学生的知识面和激发学生的学习兴趣。[6]

（四）缺乏强有力的考核机制

多数高校的实验课都是以撰写报告的形式来确定学生的成绩。由于实验课受课时和师资紧张的影响，缺乏人人动手的机会，因此，学生往往对实验课的积极性不高，通常会出现“一人动手大家看”的现象。最后各个小组成员的实验报告互相抄袭，数据处理和实验结果与讨论也没有经过仔细推敲和独立思考，不利于培养学生科学的严谨作风和独立发现问题及解决问题的能力。[7]

二、培养计划和教学大纲的修订

目前，对复合型强，涉及面广的环境微生物学实验进行重新设计，提升为探究性、综合性实验，并作为独立课程列入培养计划和教学大纲，有依据地规范操作，将成为专业应用实验教学层次水平提升的重要步骤。

为了适应执业资格体系下环境工程专业大学生创新人才培养模式，我们在环境工程专业本科生新的培养计划和教学大纲中增设了环境微生物学独立实验课程，在适量增加总学时数的情况下对内容进一步拓展，重新编制实验讲义，其涵盖微生物学实验教学体系既包括“环境中微生物样品的采集与分离、形态结构观察”等基础实验，又包括“细菌总数的测定、大肠菌群的检测、菌胶团的观察及活性鉴定”等环境微生物鉴定与评价技术，使环境微生物实验内容与理论教学内容相辅相成，结构更加完善、合理。

三、教学内容和方法的改革

（一）建设集“基础验证性实验、综合设计性实验及探究性实验”为一体的教学体系

针对传统微生物学实验内容安排彼此孤立，内容重复的缺点，我们将环境微生物学实验课建设为集“基础验证性实验、综合设计性实验及探究性实验”为一体的实验教学体系。如传统的环境微生物学实验一般开设若干个小实验：光学显微镜的操作及细菌个体形态的观察、微生物染色、培养基的制备和灭菌、细菌纯种分离培养和接种技术，这些小实验大都为内容连贯性不强的操作性实验。新的实验体系包括如“原核微生物和真核微生物类群个体形态观察”，重点培养学生最基本的操作技能；“活性污泥中微生物分离、纯化与培养”综合设计实验是在微生物学实验基础上设置的强化学生实验技能、提高学生自主创新与综合能力的实验；而“河水、生活污水中的生物检测与评价”探究性实验着重体现工科环境微生物学课重基础、重操作、重分析、重总结的主题思想。新的教学体系使学生从感性认识到理性认识，从单项技术到密集技术，从简单应用到复合应用，以至完成工程师初步训练的教育过程。

（二）建立开放性实验室，强化工程素质培养

为了充分调动学生的主观能动性，我们拟开展设计性实验并建立开放性实验室。将一些应用性、综合性和学生感兴趣的实验课题作为备选实验，供感兴趣的学生通过查阅相关资料、综合运用不同实验技术，设计实验方案，最后通过教师指导和小组讨论确定方案并加以实施。在这过程中，设计性实验的开展往往需要开放性实验室的支持，学生可以以小组为单位，在开放性实验室中根据实验方案进行实验，处理数据并分析实验结果，并撰写实验报告或科创论文。担任实验教学的老师在这一过程中只起到一个启发者、指导者和帮助者的身份，仅对学生的实验方法和实验条件提供必要的支持。

（三）合理运用多媒体教学手段，了解现代微生物学技术前沿

为使实验教学更加生动活泼，传达信息量更大、更新，应充分利用网络资源，收集大量微生物的相关图片和新闻报道、Flash和工程实例，并结合多媒体和投影仪等的应用，向学生展示实验的基本过程，使实验具有较强的直观性，加强学生对微生物的实验规程和操作技巧的理解。例如：器皿包扎、细菌纯种分离和接种技术等基本操作可通过网络视频播放学习，再结合教师在实验过程中的讲授和示范加以掌握，有利于学生在脑海里建立每一种实验操作的标准和规范；另外，在观察活性污泥中的菌胶团及微型原生动物和后生动物时，可以结合投影仪的使用；还可通过播放现代微生物学技术最新研究进展的视频，拓宽学生的知识面，也可弥补实验方法和设备陈旧的不足。

（四）建立科学的考评制度，注重考查学生的主动性、创新性和评判思维能力

我们将更注重考察学生的主动性、创新性和评判思维能力。报告内容不仅要求包括基本的理论知识，如实验的目的、实验原理、仪器材料、实验步骤和实验结果（数据和图表形式），还要包括对实验结果的分析讨论，如实验为什么出现这样的结果，过程中可能存在哪些问题，有没有改善实验的方法，对这些问题进行分析解释有助于加强学生对某些枯燥理论的理解及其在实际工程中应用的认识。再者，由于实验课由原来的课内实验修订为独立实验，将成绩由原来的10%纳入该课程的总成绩改为独立计分，实验教学考核体系需要进一步完善。新的考评制度还将增加以下三个方面：1.以实验理论知识和操作要点为内容进行实验预习问答和笔试；2.实验过程中与教师互动的积极性、实验操作的主动性以及与小组成员的合作性作为衡量实验课成绩评定的重要指标；3.鼓励学生到开放性实验室参与设计性实验，并将这部分作为一项考评指标纳入总成绩。

总之，“环境工程微生物学实验”课程的改革必须转变教学观念和教学目标，更新和拓宽教学内容，改革教学方法等，并将几种改革方式有机结合，才能在专业实验教学中收到良好的效果，培养出执业资格体系下工程实践能力强的技术人才。

[ 注 释 ]

[1] 匡颖，张焕祯.职业资格制度与环境工程本科教学改革探讨[J].教育与职业，2010（17）：107-109.

[2] 任屹罡，杨艳琴，张宏忠，等.就业导向型的环境工程本科课程体系改革[J].广西轻工业，2011（27）：122-123.

[3] 强虹，梁东丽，池勇志.农林院校环境工程专业实践教学的改革[J].中国林业教育，2013（31）：29-31.

[4] 蔡苏兰，梁丽莉，徐威.改革实验教学内容与方法提高环境微生物学实验课的魅力[J].中国科教创新导刊，2008（9）：47-47.

[5] 郑莉.环境微生物学开放性实验教学的探究与实践[J].中国现代教育装备，2009（3）：97-98.

微生物的纯培养步骤范文第5篇

【关键词】 小鼠 动脉血管平滑肌细胞 原代培养

Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast， the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods ， this approaches can save much time and more materials， also have better cell quantities and purity.

Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult

在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。

1 材料与试剂

1．1 组织来源：C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。

1．2 试剂： 鼠抗SMC-α -actin ，Cy2 conjugated affinity purified anti-mouse

IgG［H/L］，戊巴比妥钠注射液。

1．3 培养基：在DMEM 培养基中添加15％ 胎牛血清、1％青霉素、 链霉素、1％谷氨酰胺，过滤除菌备用（不要超过四4周）。

1．4 酶消化液：Collagenase TypeⅡ 7 mg 溶于5 ml DMEM 培养基中(无血清)， 过滤除菌即用。

1．5 70％乙醇：用无菌蒸馏水配制。

1．6 器械、仪器：齿、平镊，组织、眼科剪，无菌注射器，培养皿，解剖显微镜（Paxcam，Vistavision），荧光显微镜(LEICA DMI6000B）。

2 方法

2．1 常规麻醉小鼠，70％乙醇冲洗颈部和腹部， 打开胸、腹腔 ， 暴露心脏。

2．2 5 mL 注射器穿刺左心室， PBS 缓冲液冲洗主动脉。

2．3 完整分离主动脉，放入100 mm无菌平皿，滴1～2滴PBS 缓冲液。

2．4 解剖显微镜下撕去血管外膜至血管光滑透明（如粗糙不平说明外膜去除不干净）。

2．5 取出血管，放入另一有 PBS 缓冲液的平皿里，转到超净工作台操作。

2．6 眼科剪将血管快速剪成1～2 mm2 大小后用胶原酶消化3～4 h（组织块变成细胞团即可）。

2．7 加入 DMEM培养基终止消化并离心倾去上清液，离心管中加入1 ml 新鲜培养基重悬细胞，接种于12孔培养板中的一孔，常规静置培养。

2．8 第2天观察是否有细菌污染，如有要更换新鲜培养液，静置培养。于第5、6天细胞生长达培养皿面积的80％左右时可传代，常规方法即可。

3 细胞鉴定

免疫荧光法鉴定平滑肌细胞：常规消化，细胞接种于培养载玻片。第2天用PBS 缓冲液轻缓洗涤，加3.7％福尔马林液在室温下固定30 min后用PBS 缓冲液洗涤3次，2 min／次。然后用 0.1％ Triton-x-100 (PBS配制) 室温下渗透细胞10 min，以便抗体更好的进入细胞。用10％山羊血清(PBS配制) 封闭非特异性抗原30 min，鼠抗SMC-α-actin （1:200 PBS 稀释）室温下孵育细胞2 h，PBS 缓冲液洗涤3次，5 min／次。以下步骤避光：用荧光标记二抗（ 1:200 PBS 稀释）在室温下孵育细胞1 h，PBS 缓冲液洗涤3次，5 min／次，然后用荧光封片剂封片后在荧光显微镜下检测（440/510nm，Ex/Em）。

4 结果

细胞于第2天游离出，第3天沿细胞团成放射状生长，成梭形，传代后细胞生长较快， 成典型的峰谷样生长， 细胞形态多呈宽大的长梭形， 核大一只小鼠的主动脉用该法培养，10天左右即可获得106个细胞，传代生长快，可满足任何细胞试验要求。流式细胞仪检测细胞纯度达98%以上，免疫荧光检测显示细胞 SMC-α-actin 染色呈阳性， 绿色荧光呈束状，显示肌丝特征。

5 讨论

传统的原代培养方法［1，2］有两种， 一种是酶消化法，将组织用合适的酶消化后培养，因除去了妨碍细胞生长的间质，所以产量高，但因步骤繁琐，易发生污染且材料消耗较多，只适合培养大块组织。另一种是组织块培养法， 将组织活体取出后剪切成小块，贴于瓶壁等待细胞从组织四周游离出，该法细胞生长较慢且不一定每块都长出细胞，所以成功率不高， 但适合组织量少的细胞培养。目前国内平滑肌细胞的原代培养多采用组织块贴壁法［3～6］，因而也存在上述弊端。如何简化操作、提高细胞培养的成功率？在试验中我们反复比较，发现在传统的酶消化方法上进行改良可获得很好的效果，从而建立了上述改良的血管平滑肌细胞原代培养技术。该方法将以往复杂的酶消化过程简化，大大减少了组织损失及污染机会，并简化了血管分离技术，使操作容易掌握，可重复性强，并且所培养的细胞活力强、生长快。在试验过程中，我们发现如注意以下几点可大大提高培养成功率：第一，要强调无菌观念，所用器械要高压消毒，打开胸、腹腔时所用的剪刀和镊子不再重复使用 ，其他器械在使用中要不断浸到70%乙醇中消毒灭菌，这样做基本可避免污染。第二，选用鼠龄8 W以上完全成年的小鼠（幼小的鼠细胞含量少）。第三 ，使用解剖显微镜去除外膜，由于视野放大更能完整干净的去掉血管外膜。第四，小鼠动脉细小而薄，内膜无须刮除 。第五，掌握好消化时间，如果用新鲜的胶原酶，消化3 h或略长即可，太长的时间可致细胞活力丧失。第六，在最初两天尽可能不要动细胞，以免干扰细胞贴壁。

参考文献

［1］ 司徒镇强.细胞培养［M］. 第二版 .北京:世界图书出版社 ，2007

［2］ 卢圣栋.现代分子生物学实验技术 ［M］. 第二版 .北京:中国协和医科大学出版社，1999. 439-441

［3］ 王敏，崔连群.动脉血管平滑肌细胞、血管内皮细胞原代培养的改良及应用［J］.山东医药，2004，44(14) ：17-18

［4］ 冯大明，万载阳.组织块法培养大鼠肠系膜小动脉的平滑肌细胞［J］.南华大学学报，2003，31(3): 251-253

［5］陈焰炫、刘健康.动脉平滑肌细胞原代培养贴块法的改良［J］.生物学杂志，2002，19(4)：27-28