生物细胞的培养范文第1篇

【关键词】生物制药；动物细胞培养；应用

一、动物细胞的特点及生长特性

动物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：①动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；②倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；③培养过程需氧量少;④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；⑥代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。

二、动物细胞大规模培养技术的发展

动物细胞大规模培养技术生产大分子的生物制品起始于20世纪60年代，当时是为了满足生产疫苗的需要。后来随着大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应用，人们发现利用动物细胞大规模培养技术来生产大分子药用蛋白质比原核细胞表达系统更有优越性。因为重组DNA技术修饰过的动物细胞能够正常地加工、折叠、糖基化、转运、组装和分泌由插入的外源基因所编码的蛋白质，而细菌系统的表达产物则常以没有活性的包含体形式存在。随着大量永生性细胞株的创建，在商业利益的刺激下，动物细胞大规模培养技术也迅速发展起来，并被应用到生产实际。

动物细胞培养主要用于生产激素、疫苗、单克隆抗体、酶、多肽等功能性蛋白质，以及皮肤、血管、心脏、大脑、肝、肾、肠等组织器官。它在医药工业和医学工程的发展中占重要地位。大规模动物细胞培养生产药物产品将是生物制药领域的一个很重要的方面，具有重大的经济效益和社会效益。生物技术在过去10年有显著增长，并继续快速发展，今后几十年内还将有更多的蛋白质、抗体、多肽类药物由动物细胞培养来生产。随着生物技术的进一步发展，开发的动物细胞生产生物制品的种类的增多及产品周期短、安全高等优点，利用动物细胞进行大规模生产生物制品凸显其优越性的发展越来越快。

三、大规模细胞培养技术的应用

近几年来，已把巨大的人力和资金投入到开发大规模细胞培养技术上，将能加快发展步伐，进一步应用遗传修饰的哺乳动物细胞生产单克隆抗体和其他精细的糖蛋白。获得有药物作用的蛋白质是十分复杂的过程，要求分子有精确的折叠和糖基化，这些要求在细菌和酵母体内却难以得到满足。然而，采用杂交瘤和重组DNA技术往往可以使动物细胞产生和分泌出一定数量的有用蛋白质。大规模的动物细胞培养在药物产品的生产方面具有重大的价值。

1.疫苗

在疫苗产业早期，往往利用动物来生产疫苗，如用家兔人工感染狂犬病毒生产狂犬疫苗，用奶牛来生产天花疫苗，用某些细菌接种到动物身上来生产抵抗该种细菌的疫苗。早在20世纪50年代，已经能够利用动物细胞培养技术生产病毒。先在反应器中大规模培养动物细胞，待细胞长到一定密度后．接种病毒，病毒利用培养的细胞进行复制，从而生产大量的病毒。这一突破是动物细胞工程的真正开始。

虽然动物细胞培养技术发展迅速，大大降低了实验动物的用量，提高厂生产效率，但由于原代细胞增殖能力有限，一般只能通过简单增加动物的数量来增加产量。而使用具有无限增殖潜力的细胞系，则使疫苗的生产得到飞跃式的进展。某些来自人体或动物体内的细胞，在一定条件下的体外培养后，可以获得无限增殖的潜力，用它们来生产疫苗可以大大降低实验动物的用量。更为重要的是，用动物细胞体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量，因为所用的细胞性质均一，经过严格的安全检验，克服了动物个体间的差异造成的疫苗质量不稳定的问题，并且大大降低了来自动物的病原体传染使用者的可能性。用类似的细胞培养技术可生产酶、细胞因子、抗体等生物制品，其先决条件是能够获得可分泌目标蛋白的细胞系。但是，在基因工程技术出现之前，细胞表达蛋白的水平很低，因而用这种工艺生产蛋白制品产量低、成本高，因此早期的动物细胞技术只用于疫苗及少量的干扰素和尿激酶的生产。基因重组技术和杂交瘤技术大大促进了动物细胞技术的进步及其在工业领域的应用，使动物细胞大规模培养技术在生产疫苗中越来越重要。

传统上一直把细胞培养产物用于人类和牲畜的病毒疫苗，这些疫苗至今己被大规模应用。口蹄疫疫苗是大规模动物细胞培养方法生产的主要产品之一。1983年，英国Wellcome公司就已能够利用动物细胞进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。美国Genentech公司应用SV40为载体，将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫苗。

2.单克隆抗体

单克隆抗体在体外诊断、体内造影、人和家畜的治疗以及工业上的应用日益广泛，需要量可达数百克。有些系统的单克隆抗体的需要量在今后几年内将迅速增加到几公斤的数量级。为此，迫切需要更有效的生产方法。采用传统方法(小鼠或大鼠的腹水瘤培养法)生产单克隆抗体，已不能适应实际需要。应用大规模细胞培养系统生产各种不同的单克隆抗体是经济可靠的方法。如英国Celltech公司采用10100和10001自动气升式培养系统，培养各种生产单克隆抗体的小鼠、大鼠和人的细胞株，生产各种单克隆抗体的产品。到目前为止，已成功地在1000L培养系统中，采用无血清培养液生产优质的单克隆抗体。其他一些国家先后制备成测定血和尿中的各种激素、特殊蛋白质、血型、各种药物、诊断细菌性或病毒性病原等的单克隆抗体诊断试剂盒。

3.基因重组产品

目前已认识到在不久将来用常规的微生物学方法不能实现遗传工程的效益，人们对大规模细胞培养的兴趣愈来愈大。动物细胞能精确地转译和加工较大或更复杂的克隆蛋白质。此外，动物细胞还可以把人们所需的蛋白质分泌到培养液内，而从培养液分离蛋白质要比细胞匀浆更为容易。除了单克隆抗体外，现在人们最感兴趣的蛋白质是组织型的血纤蛋白溶酶原激剂(t%26mdash;PA)，以及其他的重组分子。利用动物细胞培养方式进行大量生产，如免疫珠蛋白G、A和M，尿激酶，人生长激素，乙型肝炎表面抗原等产品均由美国Endotronic公司用Acusyst%26mdash;P型中空纤维培养系统进行生产。

参考文献

[1]林世康,胡云龙,施国民.动物细胞无血清培养基的应用及研究进展[J].细胞生物学杂志,2000年03期

生物细胞的培养范文第2篇

【关键词】病毒类疫苗 生物制品 细胞培养

疫苗是将病原微生物（如细菌、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。根据其所预防的传染病病原体种类不同大致可分为细菌类疫苗和病毒类疫苗两大类。现在在人群中使用的病毒类疫苗，除了乙肝疫苗是通过基因工程方法制得，其他病毒类疫苗生产都需要通过对病毒的培养，而后再经过纯化、浓缩、或灭活或裂解等过程制备。病毒体是一类专营宿主细胞内寄生型微生物，其繁殖需要在其特定的宿主细胞内进行。所以，病毒类疫苗生产过程中对病毒的培养就需要首先培养病毒体能够在其中繁殖的动物细胞。直接感染动物培养病毒存在着不同个体之间的差异，后继纯化程序太过繁琐等缺点，存在一定的安全隐患，所以此种病毒培养方法现在已经基本被淘汰。

在2010年版的《中华人民共和国药典》（以下简称《药典》）第三部生物制品类中预防类生物制品共包括48种疫苗，其中病毒类疫苗共有27种，分别针对乙型脑炎、森林脑炎、狂犬病、流感、乙型肝炎、甲型肝炎、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹和肾综合征出血热等11种病毒性传染病。在这27种病毒类疫苗的生产工艺过程中，有两种重组乙型肝炎疫苗是使用重组CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）和重组酵母菌生产乙型肝炎表面抗原蛋白质作为疫苗抗原，其他病毒类疫苗生产中病毒的培养方式全是在动物细胞中，包括，通过原代细胞培养方式、通过人二倍体细胞或Vero细胞培养方式、在鸡胚中培养方式。在相应的病毒接种之前，首先要做的工作就是培养这些动物细胞。

1 动物细胞培养一般过程

动物细胞培养是指在体外培养活的动物细胞群体，当前，许多生物技术领域都会使用到此项技术。特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如疫苗或基因工程药物在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。动物细胞培养常用的仪器设备包括，无菌室、超净工作台、低温冰箱、pH计、压力蒸气消毒器、电热恒温培养箱、培养器具、CO2培养箱、恒温水浴锅、倒置显微镜、离心机、无菌过滤器、洗刷装置、细胞计数板和电子细胞技术仪等等[1]。细胞培养又可分为原代细胞培养和传代细胞培养。

1.1原代细胞培养

原代细胞培养是将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。其基本步骤包括：取材、剪切、消化、分离、计数、培养，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及其生长环境的无菌[2]。由于原代培养的细胞转化极性较小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗。在《药典》第三部病毒类疫苗中，包括利用原代兔肾细胞培养风疹病毒，利用原代猴肾细胞培养脊髓灰质炎病毒，利用原代地鼠肾细胞培养狂犬病病毒、乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒、森林脑炎病毒，利用原代鸡胚细胞培养麻疹病毒、腮腺炎病毒，利用原代沙鼠肾细胞培养肾综合征出血热病毒。

但原代细胞培养也存在着有潜在外源因子、不能事先检查标化、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。因此，利用稳定的传代细胞来代替原代细胞培养这些病毒成为未来发展方向。《药典》第三部中，上述的各类病毒的不同毒株也有在人二倍体细胞中培养生产的疫苗，如：风疹病毒BRDⅡ减毒株、脊髓灰质炎病毒Sabin株，还有在Vero细胞中生产的冻干人用狂犬病疫苗、冻干乙型脑炎灭活疫苗等。

1.2传代细胞培养

传代细胞培养，当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代或者再培养，对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。疫苗生产中的传代细胞培养是指对稳定细胞系的培养，取出生产指定用的冷冻保存细胞系，经过细胞复苏后进行培养过程。《药典》第三部中规定疫苗生产可利用的传代细胞是人二倍体细胞和Vero细胞。

人二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗。用于疫苗生产的细胞株，必须符合相关规程要求。不能含有外源因子，核型正常，对病毒敏感和具有足够多的细胞种子。第一株人二倍体细胞（HDC）WI-38建立于1961年，此后发现狂犬病毒PV株、PM株、HEP株、LEP株都可以在HDC中持续感染。法国于1974年12月批准了人二倍体细胞狂犬病疫苗（HDCV），因为它的高度安全性，HDCV也被WHO（世界卫生组织）推荐为金标准参考疫苗。但是，其生产成本很高，所以通常仅适应于发达国家[3]。

Vero细胞是由日本学者Yasumura等于1962年从正常成年非洲绿猴肾分离获得的贴壁依赖性细胞系，它也是WHO和我国认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比，Vero细胞具有以下特点：①来源方便，可连续传代，生长速度快；②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高；⑧遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高；④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。因此Vero细胞也成为众多病毒类疫苗生产科研人员研究对象。有已经应用成功的狂犬病疫苗，处于临床试验期的流感疫苗，还有正处于研发过程中的脊髓灰质炎疫苗、乙型脑炎疫苗等[4、5]。

2 流感病毒的培养

流感疫苗生产过程中流感病毒的培养是在鸡胚尿囊腔中接种，病毒感染鸡胚尿囊腔上皮细胞培养方式。这种方式也是目前流感疫苗生产最常见的方式。但是，在实际应用中存在不同批次鸡胚供用之间有差异，在流感爆发季节鸡胚供用量无法满足，和生产过程人力劳动量大等不足之处。所以，使用动物细胞培养方式生产流感疫苗就进入了人们视野。WHO也建议使用已经建立的哺乳动物细胞系替代鸡胚进行流感疫苗生产[6]。目前实验使用的细胞有Vero细胞、Madin Darby狗肾细胞（MDCK）等。

3 病毒细胞培养的不足与其技术发展

由于疫苗使用对象是健康人群和婴幼儿，它的安全性始终是人们所关注的焦点。使用原代细胞培养和使用含有血清培养基培养细胞来生产病毒疫苗存在着不同批次原代细胞或血清之间有差异、易带入外源蛋白因子等一定的安全隐患。因此，现在科学研究一方面致力于寻找适用于细胞系培养的病毒株，另一方面在研究使用无血清培养基培养细胞技术。Vero细胞无血清培养技术已经在狂犬病疫苗生产中成功运用，在流感疫苗生产中运用目前已经处于临床试验期间[4]。另外在细胞大规模生产中使用的生物反应器技术的发展也是病毒类疫苗生产过程中的关键技术。国外推广较多的生物反应器有：美国NBS公司的填充床细胞培养反应器和Wave摇袋式一次性细胞培养反应器[7]。微载体悬浮培养技术已经成为动物细胞大规模生产中较常采用的技术。通过体外表达病毒结构蛋白，在特定状态下可自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒的病毒样颗粒（VLPs），利用此项技术生产疫苗也已经成为病毒类疫苗生产的一种新途径。

参考文献：

[1] Rajeev Nema， Sarita Khare. An animal cell culture： Advance technology for modern research [J].Advances in Bioscience and Biotechnology， 2012，3，219-226.

[2]周珍辉主编.动物细胞培养技术[M].中国环境出版社，2006（08）：01

[3]王月，黄思佳.现代狂犬病疫苗生产用细胞和毒种：现状与前景[J].国际生物制品学，2012.vol35.No.5.

[4]陈天，陈克平，陈昭烈.Vero细胞无血清培养技术的研究与应用[J].生物技术通讯，2009.vol20.No.3，417-425.

[5]王辉，过琴媛，张月兰等.Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗生产工艺参数的研究[J].生物学免疫学进展，2006年第34卷第3期.

[6]Perdue M L，Arnold F，Li S，et a1.The future of cell culture based influenza vaccine productions[J].EXPERT REV VACCINES.201l.10（8）：1183―1194.

生物细胞的培养范文第3篇

【关键词】 种子细胞

【Abstract】 AIM: To purify and culture human bone marrowderived endothelial progenitor cells (EPCs) in vitro and to observe their biological characteristics. METHODS: Mononuclear cells were isolated from bone marrow suspension by density gradient centrifugation and EPCs were harvested in the endothelial growth medium (EGM2). EPCs were observed under microscope， the cell growth was calculated by cell counting and the cells were identified by electronic microscope examination and immunofluorescence staining for the expression of Ⅷ/vWF， vascular endothelial growth factor receptor2 （VEGFR2）. RESULTS: The culturedishadherent EPCs uniformly had a round or spindle shape and reformed clones with cobblestone morphology. The cells could be identified by the positive staining for VEGFR2 and Ⅷ/vWF. WeibelPaladle bodies could be seen under transmission electron microscope. CONCLUSION: EPCs are one group of stem cells in the bone marrow with the capacity of differentiating into endothelial cells. They can be purified and cultured by density gradient centrifugation and subjected to culture in vitro with endothelial growth medium (EGM2 MV). These findings suggest that EPCs may be a new seed cell of tissue engineering.

【Keywords】 bone marrow; endothelium/cytology; stem cells; tissue engineering; seed cells

【摘要】 目的： 体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞，研究其基本生物学特性. 方法： 利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞，再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞，观察细胞生长特性，通过检测细胞血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和透射电镜对培养细胞进行鉴定. 结果： 原代培养后细胞贴壁生长，7~10 d形成集落或融合呈卵石形，免疫组化荧光染色后结果显示VEGFR2， Ⅷ/vWF 阳性，透射电镜显示细胞内具有特征性的WP小体. 结论： 用密度梯度离心法和条件培养可以从骨髓得到高纯度内皮前体干细胞，该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征，可以进一步分化为血管内皮细胞，是理想的组织工程种子细胞.

【关键词】 骨髓；内皮/细胞学；干细胞；组织工程；种子细胞

0引言

随着干细胞研究的深入，研究者发现，内皮前体细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）是具有活跃分化潜能的干细胞，具有游走特征并能进一步增殖分化为内皮细胞.它不仅参与胚胎期的血管发育，也存在于成年机体的骨髓和外周血中，在成体血管内皮细胞发育中起重要作用，可以作为种子细胞用于人工血管、组织工程瓣膜内皮化的研究与应用［1］. EPCs的研究愈来愈受到关注，但分离相对困难，关于其培养及生物学特性研究少见报道. 为进一步探讨EPCs作为组织工程种子细胞的可能性与优越性，我们进行人骨髓内皮前体细胞的分离培养和生物学特性的研究.

1材料和方法

1.1材料

骨髓取自健康志愿者. 内皮细胞生长培养基（EGM2， Clonetics， USA），内皮细胞生长培养基补充物（EGM2 MV SingleQuots， Clonetics， USA），其中包含有胎牛血清（FBS）、血管内皮生长因子(VEGF）、成纤维细胞生长因子2(FGF2）、胰岛素样生长因子1(IGF1）以及抗生素等，黏连蛋白（FibronectinFn，Sigma），淋巴细胞分离液与PBS液（TBD公司），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡盐液（Gibco），VEGFR2兔抗（NeoMarkers，USA），第Ⅷ因子鼠抗(北京中山公司），二抗（FITC羊抗鼠与Cy3羊抗兔，Sigma），FITCconjugated CD34鼠抗（R & D公司）.

1.2方法

1.2.1骨髓中单个核细胞的分离［2］无菌条件下，取人骨髓液5 mL，加入肝素，用PBS液充分混匀，转入离心管，轻轻地层加到1077 g/L的淋巴细胞分离液上，2000 r/min离心20 min，收集中间的单个核细胞层，用PBS液1000 r/min离心洗涤2次×10 min以洗除残余淋巴细胞分离液，然后收集细胞备用.

1.2.2EPCs的培养收集骨髓中单个核细胞，用含胎牛血清和多种生长因子的内皮细胞生长培养基混匀，制成细胞悬液，接种于以黏连蛋白（Fn）包被的培养瓶中，置37℃含50 mL/L CO2孵箱中培养，第4日换液，去除非贴壁细胞，此后每3~4 d换液1次. 相差显微镜下观察细胞形态，待细胞长满瓶底的80%，用0.125 g/L胰酶消化，并以2×107/ L细胞数传入24孔培养板中，每日取4孔细胞进行计数并求均数，绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间.

1.2.3流式细胞仪检测取对数生长期骨髓EPCs， 以0.125 g/L胰酶消化后制备单细胞悬液，测定细胞生长周期；同时，检测细胞表面抗原CD34表达，鉴定所得细胞纯度.

1.2.4EPCs细胞表面抗原免疫荧光染色检测培养10 d的细胞进行免疫荧光化学染色，检测细胞表面抗原VEGFR2与Ⅷ/vWF等表达情况，选取培养10 d的成纤维细胞进行免疫荧光化学染色作为对照组. 过程如下： 细胞片用PBS液洗，然后用40 g/L多聚甲醛常温处理30 min，再用含50 mg/L马血清和50 mg/L小牛血清的PBS液浸泡30 min，去除非特异性标记，再加入VEGFR2， Ⅷ因子mAb （1∶100），37℃孵育过夜，用PBS液洗3次，加入荧光标记二抗，37℃摇床孵育1 h，荧光显微镜下拍照.

1.2.5电镜检查体外培养10 d，离心收集EPCs，用3 g/L戊二醛固定过夜，细胞团用PBS 洗3 次×10 min，1 g/L四氧化锇4℃固定30 min， PBS洗3次×10 min，丙酮系列脱水，包埋并制作超薄切片，透射电镜观察拍照.

转贴于

2结果

2.1骨髓EPCs体外培养及扩增用梯度密度离心法从骨髓中分离出单个核细胞层后，用内皮细胞生长条件培养基培养，并通过换液去除非贴壁细胞，所得贴壁细胞即为骨髓内皮前体细胞. 原代培养4 d内，细胞呈圆形（Fig 1A）；培养7 d后，细胞铺展呈椭圆形或短梭形，并迅速增殖，10 d后出现细胞融合呈“铺路卵石样”（Fig 1B），约14 d可传代. 传代后细胞于24 h内完全贴壁，接种后第1~3日为潜伏适应期，从第4日起细胞增殖迅速并进入对数生长期，第7日达高峰，此后进入平台期，细胞生长曲线如Fig 2所示. 同时，依据生长曲线计算细胞群体倍增时间约为36 h.

2.2流式细胞仪检测贴壁细胞消化后用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34表达，结果显示细胞均一性较好（阳性表达率72%），说明采用本实验中分离细胞的方法可得到较高纯度的骨髓EPCs. 同时，流式细胞仪测定细胞生长周期，结果显示： G0/G1期细胞为71.1%，G2/M期细胞为14.7%，S期细胞为14.2%，说明EPCs细胞增殖比较活跃.

2.3骨髓EPCs表面标记的检测EPCs细胞均表达Ⅷ/vWF，免疫荧光染色呈阳性，细胞胞质呈绿色，胞核不染色（Fig 3A）；EPCs细胞均表达VEGFR2，免疫荧光染色呈阳性，细胞胞质呈砖红色，胞核不染色（Fig 3B）. 对照组成纤维不表达Ⅷ/vWF与VEGFR2，免疫荧光染色呈阴性，细胞胞质和胞核均不染色.

2.4骨髓EPCs超微结构观察细胞边缘可见较多绒毛状突起，胞质内还见一种短棒状小体，即Weibel Palade氏小体，是内皮细胞特征性的细胞器（Fig 4）.

3讨论

近年来研究发现，EPCs具有游走特征并能进一步增殖分化为内皮细胞，它不仅参与胚胎期的血管发育，也存在于成年机体的骨髓和外周血中，在成体血管内皮细胞发育中起重要作用. 1997年Asahara等［3］成功地在体外将CD34+细胞诱导生成血管内皮细胞，并于体内证明其生血管能力，说明EPCs是CD34+细胞重要亚群. 因此，EPCs有望成为血管组织工程内皮种子细胞的新来源.

EPCs是CD34+细胞重要亚群，多采用吸附单克隆抗体－磁珠分离系统(MACS)进行分离得到，此法所得细胞均一性好，纯度高，但价格昂贵，实用价值欠佳，同时，EPCs吞噬的磁性微粒也必然影响细胞的代谢及功能［4］. 本实验中，根据细胞密度的差异，针对EPCs属于单核类细胞的特点，抽取骨髓后，用密度梯度离心法分离出单个核细胞层，再利用内皮细胞生长条件培养基外加黏连蛋白黏附特性，最终所得贴壁细胞即为EPCs. 同时，我们对所得到的骨髓EPCs用流式细胞仪检测表面抗原表达，结果显示细胞均一性较好，CD34阳性表达率72%，也进一步鉴定了所得到的细胞为较高纯度的骨髓内皮前体细胞. 此方法简单、经济、高效，具用较高的应用价值.

VEGFR2是内皮细胞生长的早期表面受体，主要出现在内皮细胞诱导转化的早期［5］. Ⅷ因子是内皮细胞特异性抗原，可以通过vWF的测定对内皮细胞进行鉴定［6］. 本实验中人骨髓EPCs呈贴壁生长，随体外培养时间延长，其形态由早期圆形铺展呈椭圆形或短梭形，并迅速增殖，出现细胞融合呈“铺路卵石样”. 培养一定时间后，细胞增殖速度由快变慢，胞体变大、胞质疏松，提示EPCs增殖活力下降. 原代培养生长曲线显示，EPCs的体外培养经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，其增生分裂能力活跃，体外培养可以实现快速扩增. 此外，分离得到的骨髓EPCs具有与血管内皮细胞共同的特征，细胞呈鹅卵石状贴壁生长，均表达VEGFR2， Ⅷ/vWF，胞质内还可见内皮细胞特异性标记短棒状小体，即Weibel Palade氏小体.

EPCs存在于成年机体的骨髓和外周血中，可以自体取材，避免新的机体创伤和免疫排斥反应. 同时，EPCs增生分裂能力活跃，体外培养可以实现快速扩增，能进一步分化为内皮细胞，参与成体血管内皮细胞发育、创伤愈合、肿瘤生长等病理生理过程［7］. 因此，EPCs可以作为理想的内皮种子细胞来源，用于人工血管、组织工程瓣膜内皮化研究，具有潜在的临床应用价值.

【参考文献】

［1］ Griese DP， Ehsan A， Melo LG， et al. Isolation and transplantation of autologous circulating endothelial cells into denuded vessels and prosthetic grafts: Implications for cellbased vascular therapy ［J］. Circulation， 2003;108(21):2710-2715.

［2］ 郑奇军，蔡振杰，俞世强，等. 骨髓间质干细胞体外定向心肌样分化的实验研究［J］. 第四军医大学学报，2002；23（20）：1871-1873.

Zheng QJ， Cai ZJ， Yu SQ， et al. Experimental study on differentiation of mesenchymal stem cells in bone marrow to cardiomyocytes in vitro ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2002;23(20):1871-1873.

［3］ Asahara T， Murohara T， Sullivan A. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis ［J］. Science， 1997;275(14):964-967.

［4］ Eggermann J， Kliche S， Jarmy G， et al. Endothelial progenitor cell culture and differentiation in vitro: A methodological comparison using human umbilical cord blood ［J］. Cardiovas Res， 2003;58:478-486.

生物细胞的培养范文第4篇

传统的流感病毒疫苗生产多采用鸡胚培养工艺，这种方法一直沿用至今，然而这种生产工艺受到许多限制：鸡胚来源受限；培养过程极易污染；成本不易降低；不能保证产品的质量稳定性等。而在未来几年，随着对流行性和季节性流感疫苗的需求越来越大，人们会迫切选择使用低成本质量高的疫苗，这也就使得以细胞培养技术生产流感疫苗成为趋势，MDCK 细胞就是适用于流感病毒疫苗生产的细胞系之一，其对流感病毒具有高度敏感性。故而研究MDCK细胞的大规模培养及制备病毒疫苗具有重大意义。其中，考虑到细胞本身的生长特性- 贴壁生长，如果采用贴壁细胞培养应用于大规模工业生产会遇到很大的难题，如细胞的消化问题，因此，使MDCK 细胞适应悬浮生长进而培养流感病毒就成为研究的重点。

一、MDCK 细胞大规模培养技术

细胞的悬浮培养可谓是理想的大规模细胞培养方式，悬浮培养技术是在生物反应器中，在人工条件下，高效率大规模的培养动物细胞进而应用于生物制品生产的技术，可根据细胞的贴壁能力分为微载体悬浮培养方式和全悬浮培养方式。

1. 微载体悬浮培养。MDCK 细胞是从犬肾分离出来的一种贴壁依赖性上皮细胞，且它具有典型的“失巢凋亡”现象，即一种特殊的细胞程序死亡，是由于细胞与细胞外基质或相邻细胞脱离接触而诱发的，也就是说依靠传统的驯化方式或者单纯的用机械搅拌使MDCK 细胞悬浮生长难度相当大。Van Wezel 创立的微载体悬浮培养系统开创了细胞体外大规模培养的先河，更为准确的说是使贴壁细胞大规模培养成为现实。微载体悬浮培养是一种先进的贴壁细胞培养技术，其原理是将对细胞无害的颗粒加入到生物反应器的培养液中，作为载体，使细胞能在微载体表面附着生长，同时加以持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。反应器中使用微载体是一种可以提高细胞浓度的策略，其细胞密度可达1×107 cells/ml。

采用微载体培养MDCK 细胞，结合了悬浮培养与贴壁培养的优点，包括（1）细胞贴壁表面积大大增加，培养基利用充分，细胞密度增大。（2）微载体可在搅拌停止时沉降，便于将培养基与细胞分离。（3）与方瓶贴壁培养时的代谢变化不大，正常培养基可通用等等。

但是，目前生物反应器微载体培养研究只是单批次的培养，其消化放大培养依旧是难题。且微载体培养过程中一般添加了血清，给下游纯化带来了巨大压力。采用商业无血清培养基，会大大增加企业生产成本。因此，自主开发无血清培养基进行MDCK 细胞悬浮培养是目前的发展趋势。

2. 无血清单细胞悬浮培养。我们知道，生物制品生产尤其是细胞培养方法生产病毒疫苗的过程十分严谨。细胞培养需添加血清，可是血清的加入无疑给生产后期的除杂纯化等工艺带来难度，而且，流感病毒血凝素HA 可被宿主蛋白酶裂解为成熟的HA1 和HA2，能够介导病毒囊膜和靶细胞膜结合，病毒开始繁殖，而MDCK 细胞本身不具备裂解HA 的蛋白酶类，所以常常添加胰蛋白酶来提高病毒产量，但是，细胞培养中的血清恰好又可以中和胰蛋白酶，这种矛盾致使MDCK 无血清培养问题更亟需解决。目前，MDCK 无血清培养已经取得了很大的进展，基本思路是在基础培养基的基础上补加各种生物活性因子来替代血清，结合细胞生长所需成分，配制出无血清培养基， 能够支持MDCK 细胞正常生长增殖。一般常见的营养添加因子有：胰岛素，人转铁蛋白，氢化可的松等等，再经过对这些添加因子的添加量的优化，最终确定无血清培养基成分。

现在，已有MDCK 细胞商业用无血清培养基，它们的成功问世解决了这一大难题。通过直接法或间接法，即：原含血清培养贴壁细胞直接消化传代换成无血清培养基培养或逐步降低血清浓度直至降到无血清培养，使MDCK 细胞适应无血清培养基，生长状态优良且能正常增殖传代。

完成了MDCK 无血清培养后，MDCK 单细胞悬浮培养仍在研究当中，有文献报道，已有驯化成功的MDCK 悬浮细胞系，但就市场应用来看，是远远不够成熟的。现阶段，驯化MDCK 细胞在适应了无血清培养基培养的基础上，对其进行单细胞悬浮培养驯化方法主要有以下几种：（1）使用硅化方瓶培养：将细胞培养方瓶先用硅化剂处理，防止了细胞的贴壁，再通过调整培养基成分，使细胞增殖；（2）使用摇床或摇瓶体系，通过外力作用，防止细胞贴壁，再对细胞进行筛选，然后扩大培养。

二、 MDCK 细胞应用于流感病毒疫苗生产

采用细胞系培养流感病毒是目前最有前景的流感疫苗生产方法，市场销售的一些贴壁细胞系如Vero 细胞，MDCK 细胞是应用于流感疫苗研究最典型的哺乳动物细胞系，经研究，这些宿主细胞产生的病毒滴度高，大部分病毒繁殖效果好。此外，研究表明，从相应的细胞培养生产的疫苗免疫应答效果和用鸡胚生产的疫苗一样好。MDCK 细胞应用于流感疫苗生产有很多优点：MDCK细胞易培养、增殖快、易放大，感染流感病毒效率高，可高效扩增流感病毒；MDCK 细胞生产的疫苗可以应用于对鸡胚蛋白过敏的患者等等。在使用MDCK 贴壁细胞接流感病毒后，通常会有较高的细胞特异性产率；微载体悬浮培养的MDCK细胞，接流感病毒后，HA 滴度可以高达9log2（1∶512）；就已知实验室用驯化出MDCK 悬浮细胞系接流感病毒，得出的TCID50 值和HA 滴度都高于贴壁细胞系。且已有疫苗厂商如Solvay 制药公司采用无血清培养基、微载体技术制备出了MDCK细胞流感亚单位疫苗；诺华公司制备出了由MDCK 细胞培养生产的流感疫苗Optaflu。

三、展望

在过去十几年中，用动物细胞培养制备流感疫苗生产方式已经替代了传统的使用鸡胚生产方式。动物细胞培养生产流感疫苗的特征在于其灵活性和可扩展性，然而，贴壁细胞易培养但是却很难扩大生产量，而如果使用微载体提供生长表面又会大大增加其成本。所以要努力创建悬浮细胞系，特别是MDCK悬浮细胞系。

多年以来，监管部门督促行业设立无血清培养流程，以避免污染。

然而，许多市售培养基仍然需要添加物，以达到高细胞密度和最大产物产量。理想的情况是，在疫苗生产中应该使用不需添加另外的蛋白质等混合物的已知成分的培养基。这不仅会降低批次变化的风险也有利于病毒收获的下游处理。此外，疫苗生产过程可以被简化，可以直接接毒而不用更换培养基。

各种传代细胞系可用于工业生产， 如PER.C6 细胞，EB66 细胞，AGE1.CR 细胞等等，它们已经被应用于疫苗生产并且这些细胞系可以在不含动物血清的培养基中悬浮生长。还有一些悬浮生长的细胞如CHO 细胞，BHK 细胞，HEK293细胞也常常被用于重组蛋白，单克隆抗体和兽用疫苗的生产。所以悬浮MDCK 细胞系是非常有必要且可行的，因为用这种细胞生产，其生产效率和经验会增强生产过程中的稳定性，并且十分经济。MDCK 细胞无血清全悬浮培养是最终目的，既可以解决血清带来的种种不利，又可以避免使用微载体添加物带来的未知隐患，从而可以提高细胞增殖效率且降低成本，保证产品的质量。

生物细胞的培养范文第5篇

关键词：哺乳动物细胞；培养制备；充足蛋白质药物；进展分析

1 前言

在近年生物制药发展中，利用哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质已经成为了重要的发展方向。研究表明，哺乳动物细胞培养制备的蛋白质，无论是在制备质量上，还是在蛋白质含量上，都达到了药用标准，并且在性能上也与天然蛋白质较为接近。基于这一优势和特点，关于哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物的研究得到了有效开展，并取得了积极的研究效果。结合目前关于哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物的现状，该研究在重组细胞系、重组表达载体和生物制备过程中取得了积极进展。

2 哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组细胞系中取得的进展

COS细胞曾是进行外源基因表达研究中用途最广的宿主，但由于其严重的贴壁作用，限制了大规模悬浮培养的实际应用。目前哺乳动物细胞生产重组蛋白中，常用的细胞系有CHO和HEK293两大类细胞。CHO是目前生物工程上广泛使用的细胞。该细胞属于成纤维细胞，本身很少分泌内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利，是表达复杂生物大分子的理想宿主。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞及CHO/dhfr-细胞，被广泛地用于重组DNA蛋白的稳定表达生产。HEK293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，它易于转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。利用瞬时基因表达方法，采用悬浮培养系统，可以快速、方便地获得mg级蛋白。

目前还有一些哺乳动物细胞株正在进行大规模培养生产的研发中，如来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株（MDCK）、红系细胞株、以及人的胚胎干细胞等。由于不同重组细胞系表达的重组蛋白其稳定性和糖基化类型不同，需要根据目的蛋白选择最佳的重组细胞系。

从上述研究成果来看，哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组细胞系中取得了积极进展，其产生的影响主要表现在两个方面：一.哺乳动物细胞系的分类越来越清晰，主要分为CHO和HEK293两大类细胞。二.哺乳动物细胞系在培养生产中种类得到了拓展，对推动哺乳动物细胞系研究具有重要作用，满足了哺乳动物细胞系研究需要。

3 哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组表达载体中取得的进展

外源基因可以通过病毒载体感染或质粒载体转染等方式进入宿主细胞。病毒载体是通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等，近几年杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达也越加受到重视。

质粒载体与病毒载体不同，它是借助于物理或化学的作用导入到细胞内。人工构建的哺乳动物细胞质粒表达载体一般为穿梭载体。含有原核基因序列，便于载体在原核细胞中扩增和大量制备，另外含有能使外源基因在哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子元件，以及终止子和加polyA信号序列等。Invitrogen公司的pcDNA系列载体是实验中常用的哺乳动物细胞表达载体。

外源基因能否在宿主细胞中获得高效表达主要取决于表达载体上启动子和增强子的强弱、二者之间的搭配、以及它们与宿主细胞类型的兼容性。目前常用表达载体的启动子包括人巨细胞病毒早期启动子（CMV-IE）、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉瘤长末端重复序列。近年来新发现的强启动子如人编在蛋白（ubiquitin）C基因启动子以及一些新构建的杂合启动子不仅具有更高的活性，而且具有更广阔的宿主细胞范围。

上述研究表明，不断地筛选改造载体上的表达结构元件是优化表达载体、提高蛋白质药物在哺乳动物细胞中表达量的不变的方向。

4 哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在生物制备过程中取得的进展

哺乳动物细胞大规模培养的工业化生产过程绝大多数是在生物反应器中进行的单细胞悬浮式培养，反应罐的体积可达20吨。为了节约成本，减少动物血清对产品的污染，现在主要采用无血清培养基，目前有多家商业公司提供适用不同细胞株和不同生产工艺的无血清培养基，如UltraCulture，ProCHO，Pro293等。

考虑到制药过程的现实需要，提高生物制备能力是保证蛋白质药物制备取得实效的关键。从目前的研究过程来看，提高生物制备能力的研究成果主要表现在以下几个方面：

4.1 培养方式可以为单细胞悬浮式培养。这样可以减少培养基，提高培养效果，降低培养过程成本。

4.2 反应罐的体积可以达到20吨以上。现有的培养实验将反应罐的体积设定在20吨，并取得了良好的培养效果。因此在蛋白质制备过程中，可以根据实际需要扩大反应罐的体积，满足蛋白质制备需要。

4.3 培养中使用无血清培养基。既降低培养基成本，又减少了血清中动物成分的污染可能。

5 结束语

通过本文的分析可知，结合生物制药的研究与发展形势，哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物已经成为了可能，从目前的研究来看，哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得了积极进展，在重组细胞系、重组表达载体和生物制备过程中都取得了进展和突破。为此，我们应积极推动哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物的研究，为生物制药发展提供有力支持。

参考文献

[1]王文强，闫琦，侯敢，黄迪南.提高哺乳动物细胞医用蛋白质产量方法的研究进展[D].生命科学，2013年.

[2]潘永飞.重组杆状病毒作为一种新型的基因治疗载体的研究[D].华中农业大学，2009年.

[3]勾蓝图，杨金亮.用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达新技术[D].生物技术通讯，2012年.

[4]吴淑云.腺病毒介导重组人生长激素基因在兔和羊乳腺中高效表达的研究[D].西北农林科技大学，2009年.