本文作者：张凤春1,2，南飞飞1，徐海燕1，王红霞3，唐雷3，马越3，徐迎春3作者单位：1上海交通大学医学院附属苏州九龙医院肿瘤科2海交通大学医学院附属瑞金医院肿瘤科3上海交通大学医学院附属仁济医院肿瘤科

原代乳腺癌细胞微球体的特征

结果显示，2组的细胞密度和微球体大小均十分相似，提示采用细胞悬浮培养法可以从乳腺癌组织中成功培养获得乳腺癌细胞微球体（图1）。45例乳腺癌组织标本中，共有12例获得原代乳腺癌细胞微球体，其中8例（66.70%）病理分级为Ⅲ级、4例（33.30%）为Ⅱ级。根据ER、PR和HER-2的表达情况对这12例患者进行分型：luminalA型9例，luminalB型1例，ER、PR和HER-2三阴性2例。培养至第7～10天，可观察到原代乳腺癌细胞微球体的形成，此后微球体逐渐增大，数目逐渐增多；培养至第14天时，微球体趋于稳定，直径可达100μm。12例患者中，2例的微球体形成率为6.0‰，2例为7.0‰，1例为9.0‰，3例为10.0‰，以及11.0‰、12.0‰和13.0‰和15.0‰各1例；平均微球体形成率为（9.67±2.84）‰。

原代乳腺癌细胞微球体干细胞样表型特征的鉴定

在获得乳腺癌组织来源的原代乳腺癌细胞微球体细胞后，采用FCM分析其微球体细胞中CD44和CD24的表达情况，结果显示微球体细胞表现出CD44＋/CD24low/－的特征，且CD44＋/CD24low/－表型细胞所占百分率（24.71%）明显高于原代乳腺癌细胞的1.30%，差异有统计学意义（P＜0.05，图2A）。对原代乳腺癌细胞微球体细胞进行了干细胞相关基因表达量的测定。RFQ-PCR检测结果显示，原代乳腺癌细胞微球体细胞中SOX2、Nanog、KLF4、OCT-4和MDR1mRNA的表

乳腺癌组织来源的原代乳腺癌细胞微球体形成率与临床病理特征之间的关系

BCSC是乳腺癌发生、发展、复发和转移的根源，BCSC对化疗和放疗均表现出明显的耐药，可能直接影响乳腺癌患者的无病生存期和总生存期。因此，根据是否形成原代乳腺癌细胞微球体进行分组，并分析了微球体形成与患者临床病理特征之间的关系。研究结果显示，12例获得原代乳腺癌细胞微球体，其微球体形成与绝经情况、组织学分级、PR状态、HER-2状态和肿瘤复发明显相关（P＜0.05，表1），与患者的发病年龄和初潮年龄也具有一定的相关性（P＜0.05，表1）。生存分析显示，微球体形成与否与DFS和OS无明显相关性（P＞0.05，表1）进一步按照平均微球体形成率，将12例患者分为微球体高形成率组（≥9.0‰）和微球体低形成率组（＜9.0‰），未发现其与患者的临床病理特征及分子分型之间存在相关性，推测可能与本组病例数较少有关（表3）。

近年来的大量实验研究证实，肿瘤组织和肿瘤细胞系中存在着不同分化阶段的细胞，其中只有极少量的肿瘤细胞充当干细胞的角色，具有自我更新和多向分化的潜能，在肿瘤的发生和发展中起着关键性的作用，这些细胞被称之为肿瘤干细胞[1]。细胞悬浮培养法是利用干细胞能够在富含生长因子的无血清培养液中悬浮生长并形成微球体的特性以富集干细胞。最早由Dontu等[2]和Ponti等[5]采用该方法分别从人乳腺组织和人乳腺癌组织来源的细胞中培养获得微球体，此后便广泛应用于乳腺癌细胞系来源的肿瘤干细胞的富集[6]。然而，对于乳腺癌组织来源的原代BCSC的研究[7,8]却很少。

本研究选择45例乳腺癌患者的乳腺癌组织，参照乳腺癌细胞系MCF-7来源干细胞的体外培养条件，采用无血清培养方式和细胞悬浮培养形成乳腺癌细胞微球体的方法，获得12例患者乳腺癌组织来源的原代乳腺癌细胞微球体。由于原代乳腺癌细胞微球体的培养时间较长，因此微球体形成率较低，平均仅为（9.67±2.84）‰，较乳腺癌细胞系MCF-7的微球体形成率低。推测可能与如下因素有关：从乳腺癌组织中分离乳腺癌细胞时所采用的机械和化学消化对细胞可能产生一定的损伤，导致细胞活性下降；体外培养环境与体内环境不同，从体内分离得到的细胞需要一段适应期才能适应体外培养环境；不同组织学类型的乳腺癌组织中干细胞的数量不同。

本研究结果显示，乳腺癌组织来源的原代乳腺癌细胞微球体细胞中的CD44＋/CD24low/－表型细胞所占百分率高于原代乳腺癌细胞（分别为24.71%和1.30%，P＜0.05），提示原代乳腺癌细胞微球体富集了BCSC样表型细胞。干细胞相关基因Nanog、OCT-4、SOX2和KLF4都是维持胚胎干细胞自我更新以及多能性转录调控网络中的核心转录因子[9-12]。本研究发现，乳腺癌组织来源的原代乳腺癌细胞微球体细胞均表达SOX2、KLF4、Nanog和OCT-4mRNA，且表达量明显高于原代乳腺癌细胞（P＜0.05），表明前者具有干细胞样基因表达特征。本研究还发现，乳腺癌组织来源的原代乳腺癌细胞微球体细胞表达MDR1mRNA，提示其对化疗药物的敏感性较差，因此应选择其他有效的治疗方法进行干预。乳腺癌临床病理特征和分子分型与治疗选择及预后相关，但对于原代BCSC数是否会影响预后尚无定论。Idowu等[13]采用免疫组织化学方法检测了50例乳腺癌组织CD44＋/CD24low/－的表达，发现三阴性乳腺癌中CD44＋/CD24low/－表型细胞所占百分率较高。李媛[14]报道，CD44＋/CD24low/－细胞所占百分率较高者更易发生远处转移，特别是骨转移。田允鸿等[15]检测了87例乳腺癌组织来源的CD44＋/CD24low/－肿瘤干细胞的平均含量，结果显示ER和PR与肿瘤干细胞含量及能否成功形成球囊明显相关，而HER-2、年龄和T分期等与肿瘤干细胞含量及能否成功形成球囊无明显相关性。本研究中，按照平均微球体形成率将患者分成微球体高形成率组（≥9.0‰）和微球体低形成率组（＜9.0‰），结果未发现微球体形成率与临床病理特征和分子分型之间存在相关性，推测可能与本组病例数较少有关。12例获得原代乳腺癌细胞微球体，其微球体形成率与绝经情况、组织学分级、PR状态、HER-2状态和肿瘤复发明显相关（P＜0.05），与患者的发病年龄和初潮年龄也具有一定的相关性（P＜0.05）。这些结果均提示，原代乳腺癌细胞微球体数量可能成为重要的疗效及预后判断指标。今后有必要开展长期的随访研究，同时扩大样本量以进行进一步的验证。

乳腺癌作为实体肿瘤，其干细胞的纯化十分困难，一方面是由于原代BCSC数量非常少，另一方面也是因为缺少明确的干细胞表面标志物。因此，寻找能够有效分离并富集原代BCSC的新方法仍然是BCSC研究中亟待解决的问题。本研究利用获自于乳腺癌患者肿瘤组织的乳腺癌细胞，在无血清的干细胞培养条件下获得原代乳腺癌细胞微球体，这些微球体细胞高表达干细胞相关基因，并具有自我更新和增殖能力，提示其含有相对较多的肿瘤干细胞样表型细胞，且与患者的部分临床病理特征相关，可能为未来以乳腺癌患者肿瘤组织来源的BCSC为靶点的研究以及乳腺癌预后的判断提供参考依据。