本文作者：周永春王熙才陈艳金从国刘馨姚乾黄尤光陈晓群伍治平黄云超作者单位：昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院肿瘤研究所

实时荧光定量PCR扩增效率评价及实验细胞株的筛选

本研究前期共提取了10株肺癌细胞及其相关细胞的总RNA，各组细胞总RNA的D260/D280均为1.9～2.1，提示RNA纯度较高；1%RNA琼脂糖凝胶电泳检测进一步发现其RNA完整性较好，适合作为RT-PCR模板。在RNA反转录后，取倍比稀释的sox4和GAPDHcDNA进行实时荧光定量PCR扩增效率评价，结果显示sox4和内参基因GAPDH的扩增曲线相关系数（R2）均大于0.99，符合使用2－ΔΔCt方法分析sox4mRNA相对表达量的前提条件。以人肺上皮细胞LEC作为校正，实时荧光定量PCR检测结果显示，与肺腺癌细胞A549以及GLC、人胎肺细胞KMB-17、人肺腺癌细胞H157、个旧肺鳞癌细胞YTMLC、大细胞肺癌细胞H460和高转移性大细胞肺癌细胞H460SM相比，宣威女性肺癌细胞XWLC-05中的sox4mRNA表达水平最高（图1），因此选用该细胞进行后续实验。

高干扰效果sox4-siRNA的筛选及其转染细胞后sox4表达的变化

PCR检测结果显示，与空白对照组相比，转染sox4-siRNA2的XWLC-05细胞中sox4mRNA的表达无明显变化，而转染sox4-siRNA1和sox4-siRNA3的XWLC-05细胞中sox4mRNA的表达水平明显降低，其中sox4-siRNA3的抑制率最高（图2A），因此选用sox4-siRNA3进行后续实验。实时荧光定量PCR检测sox4-siRNA3转染XWLC-05细胞后24、48和72h时，sox4mRNA表达的变化。结果显示，24h时，实验组与空白对照组和阴性对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）；48h和72h时，实验组细胞中sox4mRNA的表达水平与阴性对照组和空白对照组相比均明显降低（48h时的P值分别为0.000和0.001，72h时的P值分别为0.000和0.001），其中以转染后48h时的抑制作用最为明显（图2B）。空白对照组与阴性对照组转染后48h和72h时的sox4mRNA表达水平无明显差异（P值分别为0.815和0.506）。蛋白质印迹法检测结果亦显示，sox4-siRNA3转染后24、48和72h时，实验组细胞中sox4蛋白的相对表达水平分别为0.203±0.034、0.046±0.026和0.092±0.018。其中，24h时各组之间的sox4蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；48h和72h时，实验组与空白对照组和阴性对照组相比，sox4蛋白表达水平明显下降（48h时的P值分别为0.000和0.003，72h时的P值分别为0.044和0.031），其中以转染后48h时的下降幅度最为明显（图2C）。空白对照组和阴性对照组各时段sox4蛋白的表达无明显差异（P值分别为0.111、0.077和0.101）。

抑制sox4表达对XWLC-05细胞增殖的影响

倒置显微镜下观察实验组、空白对照组和阴性对照组细胞均生长良好，呈均一透明的贴壁状态，增殖速度、生长密度和大体形态无明显差异（图3A）。MTS法检测结果（图3B）显示，转染sox4-siRNA3的实验组与空白对照组和阴性对照组相比，细胞增殖无明显差异（P值分别为0.059和0.113），空白对照组与阴性对照组之间的差异也无统计学意义（P＝0.650）。

抑制sox4表达对XWLC-05细胞迁移和侵袭能力的影响

划痕实验结果（图3C～D）显示，划痕后培养48h时，各组细胞均向划痕区迁移，转染sox4-siRNA组细胞的迁移距离明显短于空白对照组和阴性对照组（P值分别为0.000和0.023），空白对照组与阴性对照组之间的迁移距离差异无统计学意义（P＝0.090）。Transwell侵袭实验结果（图3E～F）显示，转染sox4-siRNA后48h时，实验组穿膜细胞数为（142.0±4.2）个，与空白对照组和阴性对照组相比，差异有统计学意义（P值均为0.000）；而空白对照组与阴性对照组穿膜细胞数的差异无统计学意义[分别为（591.0±3.5）个和（559.0±4.9）个，P＝0.372）。实验组穿膜细胞经染色后，洗脱液的D值与阴性对照组和空白对照组相比，差异均有统计学意义（P值分别为0.000和0.001），而阴性对照组与空白对照组的差异无统计学意义（P＝0.566）。上述结果表明，抑制sox4表达可显著降低XWLC-05细胞的迁移和侵袭能力。

抑制sox4表达对XWLC-05细胞周期及凋亡的影响

FCM检测结果显示，转染sox4-siRNA348h后，实验组可见典型的DNA水平小于二倍体的亚G1凋亡峰，凋亡率为（29.12±5.37）%，较空白对照组细胞凋亡率[（0.46±1.33）%]和阴性对照组细胞凋亡率[（0.41±2.30）%]显著升高（P值均为0.000，图4），而实验组PI与空白对照组和阴性对照组之间的差异无统计学意义（P值分别为0.168和0.225，表3），空白对照组与阴性对照组之间的凋亡率和PI差异均无统计学意义（P值分别为0.733和0.992）。

云南省宣威地区女性高发肺癌，近年来受到国内外学者的广泛关注。本院收治的宣威女性肺癌患者除表现为对常规放化疗不敏感的共性外，还显示出发病年龄年轻化、转移早、对现有靶向治疗不敏感和预后差的特点。作为转录因子，sox4除在人类胚胎的发育和分化中扮演重要角色以外[11]，在肿瘤的发生和发展中也具有重要作用。

在细胞严谨有序的分化和发育过程中，sox4基因的突变、缺失或过表达均可能导致细胞分化障碍以及增殖和凋亡失控，从而参与肿瘤的发生和发展。既往研究揭示，sox4在不同类型肿瘤中具有致癌基因的作用[12-15]，也可作为一种抑制因素影响肿瘤的生长[16,17]。这些作用机制涉及sox4对细胞信号通路的调节、对细胞凋亡的调控、对微小RNA（microRNA）的表达调控以及对细胞增殖和分化的调控等。在肺癌领域，目前的研究多集中于sox4表达差异及突变方面[10]，最近也有学者通过高通量芯片技术致力于探讨受sox4调节的下游靶基因，并证实小细胞肺癌和非小细胞肺癌中均有sox4的过表达，受其影响的下游基因多达123个，且在不同类型的肺癌中存在差异[18]。

然而，目前尚不明确sox4在肺癌生长和转移中的确切机制。本研究通过对10株不同类型肺癌细胞和正常细胞株进行比较，发现sox4mRNA在正常人支气管上皮细胞BEAS-2B和人肺上皮细胞LEC中呈现低表达，而在胚胎细胞KMB-17中呈现高表达，符合其作为胚胎发育调节基因的本质。此外，与正常肺及支气管细胞相比，sox4在各类型肺癌细胞中均表现为过表达，推测其与恶性肿瘤细胞去分化的特点有关。本实验结果显示，宣威女性肺癌细胞XWLC-05中的sox4mRNA表达水平相对较高，因此采用RNA干扰技术抑制该基因在XWLC-05细胞中的表达，试图探讨sox4在宣威肺癌侵袭和转移中的作用。XWLC-05细胞系由昆明医学院病理教研室于2007年建立，是目前唯一以宣威女性肺癌为来源建立的细胞株，材料取自宣威当地一名68岁的女性肺腺癌患者（右肺中分化腺癌）。实验证明，该细胞株维持了原肿瘤的表型特征，能够形成与宣威女性肺癌具有相同形态学特征的裸鼠移植瘤[19]。因此，选择该细胞作为体外研究的对象，能够最大程度地反映宣威女性肺癌的生物学特征。

为了避免只选择一个序列可能出现RNA干扰无效或低效的情况，本研究选择了sox4基因编码序列中3个可能的干扰位点，并筛选出干扰效应最强的sox4-siRNA3进行实验，同时通过设置阴性对照以排除可能出现的假阳性结果。实验结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，sox4-siRNA能够在mRNA和蛋白水平显著降低肿瘤细胞中sox4的表达，且抑制效应在转染后48h时最强，这与siRNA的瞬时干扰作用相符，因此后续实验均选用转染后48h时的细胞作为研究对象。

MTS法检测细胞增殖活性的原理与传统的MTT法相同，但因为前者不需要对细胞进行冲洗以及额外添加DMSO，也不需要收获细胞，可直接进行比色，因此兼具了MTT法快速、安全和灵活的特点，同时操作更加简便，敏感度更高，实验结果也更加准确而可靠[20]。本研究利用MTS法检测XWLC-05细胞转染sox4-siRNA后的增殖活性，结果显示与对照组相比差异无统计学意义，转染前后显微镜下的细胞形态学也与空白对照组无明显差异。FCM结果也显示，实验组和对照组细胞的增殖率无显著差异，提示sox4可能并不参与调控XWLC-05细胞的增殖。不过，转染48h后的FCM检测结果却提示，实验组细胞出现了明显的亚二倍体峰，其凋亡率较空白对照组和阴性对照组明显升高，提示sox4可能在XWLC-05细胞的凋亡中起一定的作用，这与Liu等[12]在前列腺癌中的研究结果一致。

基膜是阻止肿瘤细胞侵袭和转移的机械屏障，而Matrigel是从富含细胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出的基膜基质，主要成分包括层黏连蛋白、胶原Ⅳ、巢蛋白和硫酸肝素糖蛋白等，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。在室温条件下，Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，可以模拟体内细胞基膜的结构、组成、物理特性和功能。本研究结果显示，抑制sox4表达可以降低XWLC-05细胞对Matrigel的穿膜能力，同时划痕实验显示细胞迁移率显著降低，提示sox4与XWLC-05细胞的侵袭和转移表型密切相关。结合FCM检测结果，推测抑制细胞凋亡可能是sox4增强肿瘤细胞恶性行为的机制，但对其具体的分子机制仍有待进一步研究。

综上所述，本研究利用siRNA成功抑制了宣威女性XWLC-05肺癌细胞中sox4的表达。体外实验证实，抑制sox4表达后肿瘤细胞的侵袭和转移能力均下降，虽然细胞增殖未受到明显影响，但细胞凋亡明显增加。本研究结果为下一步构建稳定转染模型和动物实验奠定了基础，也为以sox4作为肺腺癌治疗靶点的研究提供了实验依据。