我的育儿心得

前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇我的育儿心得范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。

我的育儿心得范文第1篇

他姓王――我们的语文老师，目光如电，大腹便便，

“将军肚”是他最大的特征。对于他与众不同的“将军肚”，他也有自己的诠释。记得一次语文课上，他让一个胖男生站起来朗诵课文。谁知，那男生朗诵的声音又细又小，像个腼腆的小女生。“停，停!”老师一边做个“stop”的手势，一边说。霎时，教室里一下子静了下来。老师又用手指着自己圆鼓鼓的肚子说：“老弟，你要是个女孩子，这么点声音我还能理解，可是你是个男子汉大丈夫啊。你看，你这肚子也不比老师小多少啊，我们这么大的‘音箱’，难道只能发出这么点声音吗?”话音未落，同学们已是笑得前仰后合。而老师呢，却还是一本正经，冷静得很呢!

王老师上课不仅幽默风趣，而且对我们的朗读要求也挺高的。课文中看似简简单单的一句话，有时也要让我们读好几遍，并且形式多样，让人百读不厌。当他发现我们全班齐读却谁也不愿读出大声音时，就把我们分为A、B两组，A组先读一遍，B组接着读一遍，然后全班齐读，要求“一浪更比一浪高”。并且还有更加苛刻的要求，谁读谁起立，全班齐读都坐着。这样一来，那些上课分神的“好汉”们，可就惨了：该站着读时，他坐着；该坐着齐读时，他站着，搞得是洋相百出!如此下来，我们不用真功都不行了!久而久之，语文课上，我们一个个是双目圆睁，侧耳细听，谁也不敢分神片刻呀!

哦，对了!他还有一个特点呢，就是他来上课时，从不让语文课代表去办公室捧作业本，无论多少，总是他自己亲自捧过来。他总是说：“办公室离教室太远了，作业本又多，一个人捧不了，得两个人捧，同学们下课时间紧张，我带过来就行了!”

介绍到这里，你一定很羡慕我们有这样一位优秀的语文老师吧!想知道他叫什么吗?偷偷地告诉你哦，他叫王小兵。其实刚开始我也不知道，只是有一次偷偷打开他课件的时候，被我光明正大地“瞄”到了。哈哈!

点评：

我的育儿心得范文第2篇

[关键词]生成　繁衍　传承　创新

据史学家考证，达斡尔族起源于大兴安岭南麓的洮儿河。达斡尔一名最早见于元末明初，属辽代契丹的后裔。

达斡尔族人的先民分布于外兴安岭以南至黑龙江北岸的河谷地带，以后逐步迁到嫩江流域，现多在齐齐哈尔地区、呼伦贝尔地区等。17世纪沙俄殖民者侵入黑龙江流域时，达斡尔族人民奋起顽强抵抗，受到清廷的赞赏，多次征调达斡尔人民远征屯垦戍边。新疆至今还有一支达斡尔民族的后裔。

达斡尔民族不但有悠久的历史、英雄的传奇，同时，也有灿烂的文化。他们不但有世代相传的民间美术、剪纸、刺绣、玩具，手工艺品，也有体育项目赛马、打“背阔”(曲棍球)等。民歌，也是达斡尔民族文化瑰宝中的一种。他们的民歌经过岁月的磨砺，心灵的滋养逐渐成熟起来。由于没有文字或者说由于文字的失传，靠的是口耳相传，耳濡目染使之没有完全丢失。至今，每片白云下面都有他们的歌声飞扬，每滴露珠上面都有他们的歌声流淌。

达斡尔族民歌是怎样生成和繁衍以及如何进行传承、创新就是我这篇文章所要涉及话题。

一、在独特民风、民俗中生成繁衍的民歌

从现有的资料上看，达斡尔族的民歌还是很丰富、很有特色的。其内容有情歌、酒歌、渔歌、牧歌、奶歌、猎歌、农歌、神歌等。其形式有”扎恩达勒”、“呼苏姑”、“乌钦”(乌春)、“哈库麦”“雅德根”等。

我们知道，任何优秀民族文化的产生都离不开本民族独有的生产方式和生活方式。俗话说，“一方水土养一方人，一方水土唱一方歌”。法国文艺批评家丹纳曾经论述‘“作品的生命取决于时代精神和周围风俗。”达斡尔民歌浓郁的民族性、持久的艺术性也必然生成于他们的生产方式、生活方式，也必然繁衍于他们独特的民风与民俗之中。

渔猎是达斡尔族传统的生产活动，在长期的生产实践中，达斡尔人积累了许多网鱼、狩猎方面的知识与经验，如下套子、设陷阱、放地箭、“打围”、鹰猎、权鱼等等。也因此，最初对他们民族的译音为“打虎儿”、“打窝儿”(窝，即鱼窝子)。历史悠久的渔猎生活，造就了达斡尔族独具特色的民间体育和民族文化，他们为适应狩猎生产和抵御外敌兴起了射箭、摔跤、曲棍球等民间体育的同时也必然产生像《德莫日根》《放排歌》包括思念出征亲人的《马背上的哥哥你在何方》这样的歌曲。随着垦荒戍边的兴起，大批汉族农民迁入迭斡尔族地区。在汉族先进生产方式的影响和商品市场的刺激下，达斡尔族开始了逐渐的定居生活，不但农业迅速发展。文化也受到了影响。这也就产生了许多反映农业生产和生活的民歌，象《农夫打兔》《打谷场》等民歌。

达斡尔人在过去，除了部分人信仰“萨满教”外，信仰多为神教，也有以自然界为崇拜对象的。供奉天神、山神、火神、财神、祖神等。每年阳历五月，杀牛、羊、猪祭天、地、山、川诸神。每个家庭均有一个专司祭祀的萨满，祈祷、祭鄂博。由此也必然产生诸如《萨满调》、“神歌”《图腾崇拜》等民歌。

达斡尔民歌从生成到繁衍至今，虽然由于地域的关系有所差异，但是。无论是哪种形式，哪种内容的民歌都在以独有特点的存在着，传扬着。关于达斡尔民歌的各自特点，许多音乐工作者都做了各自精辟地分析，这里就不具体赘述了。下面，想就它们的共同特征发表几点个人见解。

共同特征一，浓郁的地域特点决定了民歌的体式。由于达斡尔人生活的地方即不是内蒙辽阔草原，又不是兴安岭高耸的森林，而是平原的农业区，这就影响到他们民歌的体式。通常他们的民歌都是以一句体，二句体，三句体、四句体出现。

例1，一句式

例4，如《心上人》(谱例略)

共同特征二，擅长于舞蹈习俗决定了民歌的节奏。由于达斡尔人喜欢舞蹈、爱跳舞蹈，并且把舞蹈当作主要的生活内容，这就影响到他们民歌的节奏、节拍。通常他们的民歌多为3／8、6／8、2／4、4／4等节拍。

共同特征三，耿直的性格民风决定民歌的变化。由于达斡尔人的耿直、率真的性格也就时常出现义气用事的情景，这也当然会影响到他们民歌的变化。他们的民歌常常出现“高起低落”的现象。有人称为“一惊一炸”，“突转突变”。

例1，(这是演唱重尾音和颤音的例子)

当然，他们民歌共有的特征决不止这些，相信随着研究的深入还会有新的发现。

二、在多元时代、时尚中传承创新的民歌

对于少数民族文化的发展、传承，我们国家历来都很重视，一直在做这方面的工作。同时，一批立志弘扬达斡尔族音乐的人也一直在不懈的努力。例如，内蒙的达斡尔族作曲家通福、那日松不但收集整理了许多流散在民间的歌曲，还创作了像《映山红花满山坡》等脍炙人口的新民歌。例如，齐齐哈尔地区的辛克思(何今声)、朱葵等就为著名歌手何德志创作了《愿把天天歌唱》、《拉起四弦唱起歌》等。并且，黑龙江人民出版社出版还出版了由他整理的达斡尔民歌集《映山红花满山坡》。在社会主义建设兴起的时候。也出现了许多达斡尔族新民歌。特别值得一提的是前些年进行的少数民族民歌集成编辑工作，对民歌的保护、发展、传承起到无法估量的作用。真是功在当代利在千秋!迭斡尔族民歌作为民族少数民族的文化结晶，已经被国家列入非物质文化遗产名录。

然而，也必须认识到，我们不但要对达斡尔族民歌加以研究，加以保护。同时。我们也应该在保护中合理利用它、发展它。我的观点是“保护是必须的，利用是必然的”。我们知道，任何传统文化都是历史沿传下来的价值体系，在新的文化体系中既可以继承也可以存在，还可以利用。传统既是割不断地又是不可能是“一成不变，全盘保留的，包括达斡尔族民歌在内的非物质文化遗产。这种人类活态财富。就应该活跃在我们今天社会的生活中、活跃在我们今天不断发展的文化中。那么，怎样才能使它更能适应变化的时代，发展的社会，多元的需求呢?出路只有一条不断创新达斡尔民歌的创新。我想必须理清几种关系

其一，创新必须保持它的生态性

创新是推动历史发展的动力，不创新，任何事物都不会前进，文化也是如此!

我们应该承认，许多达斡尔民歌都是产生于原始的生产方式、生活方式之中，其内容、其形式都有局限性和封闭性，不可能不加改造地就会溶进科技的时代、信息的时代。现在，许多以原生态面貌出现的文艺形式、艺术作品也都不会就是原始的状态。

说到达斡尔民歌的创新，绝不能以牺牲基本生态为代价。我们应该对现存的民歌进 行梳理、分类、评估，然后再考虑在这基础上创新。凡是因旅游和其它经济活动可能给达斡尔民歌造成毁灭或者严重破坏的，就一定下决心整体保护。要建立一个达斡尔民歌生态库，使这种民歌永远郡不会因为利用或者创新而衰退、而变异。

其二，创新必须赋予它以时代性

现在，对待民族音乐的创新或者改革有两种观点，一种是所谓原生态的，就是说一定要是最初的本来面目，原来的民歌曲式、段式、节奏一点都不许变化，伴奏也不能加入其他的因素。另一种是主张追求现代意识，基本上是民歌的外表，西化的实质。运用许多人为的手段把民族音乐搞得面目全非。我认为这两种观点和做法都是极端的、偏激的，也是不科学的。

那么，创新要赋予民歌以时代性又能如何做到呢?最近有两个新出版的达斡尔民歌专辑，一个是我们市词曲作家创作的《神奇的达斡尔》。一个是奠力达瓦旗建旗五十周年推出的《达斡尔人》。这两个民歌专辑受到专家、群众的好评与推崇，都说这是充满时代性、时尚性的新民歌。《神奇的达斡尔》专辑中的《爱唱乌钦的阿爸》、《生长牧歌的地方》都在广西国际民歌节上获奖，其中一首不但被国内专家组评为“十大金曲奖”之一。并且还获了全国的“五个一工程奖”。它们好在哪里?我认为他们创新了!而这种再创作也决不是过去“拼盘”式的创作方法。这种创新，在不失民歌灵魂、不丢民歌骨架的原则下融入了时尚的音乐元素、融入了科技的表现手段，融入了现代的审美理念。所以，没有人不承认它是达斡尔民歌，没有人不承认它具有较强的时代性。

其三，创新必须增强它的传承性

何文化都需要传承，非物质文化遗产的保护从某种意义上讲也要传承。创新。不能让我们的传统文化遗产封尘在库房的箱子中、湮灭在历史的长河中、消失在狭隘的文化观念中。保持它的生态性，赋予它的时代性。都是为了增强达斡尔民歌的传承性。

我的育儿心得范文第3篇

[关键词] 交接法；新生儿；护理体会

[中图分类号]R471 [文献标识码] B[文章编号] 1673-7210（2009）05（b）-137-01

儿科是危重患者多、风险大的一个科室。新生儿护理时的任何一个疏忽都可能导致护理缺陷及医疗纠纷的发生。自2005年10月以来，我科改变了床头形式交接班法，对新生儿采取床头开包交接法，取得良好效果，具体介绍如下：

1 临床资料

将2005年10月～2006年7月在我科住院的新生儿82例作为对照组，采用床头形式交接法。2006年8月～2007年10月住院新生儿105例作为实验组，采用床头开包交接法。患儿平均年龄为0～8 d。两组患儿的年龄、营养状况、疾病等比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2 方法

2.1 床头形式交接法

2.1.1 简单看患儿，不进行护理检查由于护士忙于处置，到患儿床前只是简单观察患儿一般状态如面色、呼吸等，向家长了解患儿的进乳，大、小便，睡眠等情况，省略了新生儿检查这一环节，导致臀红、皮肤破损等并发症发生。

2.1.2 注意交接患儿的病情不进行使用物品和仪器的交接形式交接班，护士只交接患儿的病情及药物，对所使用的物品（如热水袋、热水瓶、保暖箱）等不做交接，由于家长使用不当或暖箱缺水等导致烫伤，发生体温不升和皮肤硬肿，并可使体内各主要脏器组织受损、功能受累、甚至导致死亡[1]。

2.2 床头开包交接

2.2.1 新生儿基础护理交接每天晨、晚交接班时由护士长带领各责任护士，逐步对每个新生儿开包进行全身检查；从头到脚，尤其腋窝、腹股沟等皱褶处。指导家长做好皮肤护理，新生儿皮肤薄，易擦伤引起感染，特别是颈下、腋下、大腿根部和臀部需要每天清洁，防止感染。洗澡应先洗头面部、颈部，然后洗全身。洗澡后要用干毛巾擦干身体。每次大、小便后用清水清洁臀部；新生儿期间尽量避免使用一次性纸尿裤、塑料布等，避免臀红发生。低出生体重儿，皮肤薄嫩，长期平卧、年龄偏小容易引起压疮[2-3]，定时翻身是缓解局部受压的主要预防措施，翻身频率需根据患儿的病情和舒适需要决定[4]， 一般间隔2 h或更短。

2.2.2 禁止家长使用热水瓶等末梢循环差的患儿，建议使用保温箱。禁止家长使用热水袋及热水瓶，避免家长在忙乱中长时间不更换保暖位置而引起烫伤。如不使用保暖箱者可多包棉被。包裹要紧，不可过于松散。或者看护者用手捂住小儿双手或双脚，定时检测患儿体温情况，使体温保持在36～37℃，减少患儿耗氧量[5]。

2.2.3 详细交接仪器如使用保温箱的患儿接班者接保温箱运行情况，水槽内水是否更换、温、湿度是否达到标准，当日的清洁、维护是否已做，可减少故障的发生，也避免了体温过低或过高等并发症的发生。

3 结果

两组患儿发生护理并发症的例数比较，见表1。

表1 两组新生儿发生护理并发症例数比较（例）

4 讨论

床头开包交接法将评估、检查、指导环节贯穿于整个交接班过程中，利于及时发现问题，并对家长进行宣教与指导，促进护士与患儿家长间的有效沟通。亲情化护理可以使患儿享受到正常新生儿所得到的护理。新生儿新陈代谢旺盛，经常洗澡可使皮肤清洁，改善血液循环。开包交接通过对患儿的抚摩，使大量温和良性刺激通过皮肤感受器上传达到中枢神经系统，产生一系列生理效应，促进患儿身心发育[6-7]。床头开包交接法通过严谨、细致的交接，取代了床头形式交接班，减少了臀红、体温过低、过高及仪器等故障导致的并发症的发生，减轻患儿的痛苦，利于患儿康复。

[参考文献]

[1]韩玉昆.实用儿科学[M].北京:人民卫生出版社,2003:225-226.

[2]Neidig JR, Kleiber C, Oppliger RA. Risk factors associated with pressure ulcers in the pediatric patient following open-heart surgery[J].Prog cardiovasc Nurs,1989,4(3):99-106.

[3]Suddaby EC, Barnett S, Facteau L, et al. Skin break clowns in acute care pediatrics[J].Pediatr Nurs,2005,31(2):132-139.

[4]Curley MAQ, Razmus IS, Roberts KE, et al. Predicting Pressure Ulcer Risk in pediatric patients-the Braden Scale[M].Nurs Res,2003,52(1):22-31.

[5]崔焱.儿科护理学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2003:109.

[6]王维业.运用护理程序理论指导和规范临床护理交接班[J].中国现代医生,2007,45(20):99,132.

我的育儿心得范文第4篇

关键词：幼儿教育；信任危机；策略

中图分类号：G612文献标识码：B文章编号：1672-1578（2013）10-0290-01

1.幼儿教育信任危机的表现

1.1教育安全信任危机。目前频发的虐童事件导致民众对幼儿在园期间的安全问题越来越担忧，使得幼儿教育安全信任危机凸显。尤其是最近浙江温岭女教师虐童照片的曝光，把这一问题推向了舆论的焦点。如果孩子在幼儿园的人身安全不能得到保障，幼儿园、甚至整个幼儿教育体系就会失去公众的信任。曾有报道指出，有些家长为了了解孩子在幼儿园的情况，将录音笔装在孩子的口袋内。目前，有条件的幼儿园流行在教室里安装监控的做法，家长可以随时在互联网上查看孩子的一日活动情况。从表面上看，这种方式能使家长放心，但从实质上讲，视频监控体现的正是教育信任危机问题。生活在监控之下，一举一动都会被无数只眼睛监视，无论对教师还是幼儿，都是一件令人不舒服的事情。也许在这样的环境中师生的行为会更规范，但其心理也会变得越来越恐惧，不利于师生身心的健康发展。因此，监控不能从根本上解决信任危机问题，并且会带来某些负面影响。

1.2教育内容信任危机。目前教学内容偏重于读、写、算，有的幼儿园甚至直接使用小学教材，为了让孩子多学文化知识，而挤占了孩子的户外活动时间。幼儿园盲目传授小学内容、甚至让幼儿写家庭作业的做法引起了人们的强烈不满，幼儿教育内容信任危机弥漫。对人的一生发展来说，知识固然重要，但良好心理素质和行为习惯的养成以及价值观念的树立等亦是不可或缺的。

1.3教育方式信任危机。目前，许多幼儿园的教学活动以传统的讲授法为主，教师讲、幼儿听，教师念、幼儿读，游戏成分偏少，在游戏的组织形式上，表现为自由游戏多，益智游戏少。上课时幼儿要统一坐端正，手背后，不准随便离开座位，教师提问时要先举手后回答，教师讲课不准随便插话，俨然一副小学生的模样。在教学过程中教师倾向于将自己的所知灌输给幼儿，不重视让孩子在玩中学，没有充分发挥自主探索在幼儿学习中的作用。这种注入式的教育训练方式，将会使幼儿的创造意识和创新精神磨灭殆尽，也使得应试教育正在幼儿教育中渗透、生根、发芽。

2.幼儿教育信任危机的对略

2.1完善立法，加强管理作保障。目前，我国现有关于幼儿教育的政策法规，如《幼儿园管理条例》《幼儿园工作规程》《幼儿园教育指导纲要（试行）》等都属于教育法律体系的第四个层次，所具有的法律效力较低，而在义务教育、高等教育、职业教育等领域都有着层次较高的全国性法律。有了完善的教育法律法规，才能够完善幼儿教育的管理体系，规范办园行为，加强政府对幼儿教育的监管力度，保障幼儿教育事业的有序发展。

2.2增加投入，经费筹措是关键。巧妇难为无米之炊，没有经费作保障，幼儿教育的发展必然受限。目前，幼儿教育领域存在的许多问题说到底是经费的问题。近年来，各级政府对中小学教育的投入都有所增加，但唯独没有增加对幼儿教育的投入。幼儿教育是基础教育的基石，决定着国家和民族的兴衰存亡。因此，国家要承担起相应的责任，建立以政府为主的幼儿教育投入机制，进一步增加财政投入，多渠道筹措经费，确保幼儿教育的健康发展。随着我国经济实力的增强，希望可以将学前三年的幼儿教育纳入义务教育范畴，这将有助于实现教育公平，提高幼儿教育的质量。

2.3打造队伍，教师素质是重点。首先，加大幼儿教师职前培养的力度。国家要鼓励师范大学开办学前教育专业，同时要给予人力、物力、政策上的扶持，缓解我国幼儿教师稀缺的问题。其次，加强对在职幼儿教师的培训。由国家出资，由师范院校的相关教育教学机构承担培训任务，通过短期培训和长期置换研修的方式，有效提升教师的教育教学能力和整体素质。第三，提高幼儿教师的社会地位。应将幼儿教师纳入到小学教师管理体系中，明确幼儿教师的身份，提高幼儿教师的待遇，让所有幼儿教师都能愉快而有希望地工作，做到安心从教、乐于从教。

2.4改进教法，提高质量为目标。应针对幼儿的身心发展特征开展幼儿教育，将幼儿视为"小大人"，一味进行知识灌输的做法是不可取的。幼儿教育"小学化"从短期效果看，也许确实会令教师和家长感到欣慰，但这种暂时的成绩是以牺牲幼儿的习惯和品格的养成为代价的，最终会影响到幼儿一生的发展。幼儿园贯彻《基础教育课程改革纲要》和《幼儿教育指导纲要（试行）》的精神，依据幼儿身心发展的特点和教育规律，坚持保教结合和以游戏为主的原则，改变传统的教学方法，为幼儿创设良好的生活和学习的环境，让幼儿从事探索世界、认识世界的活动。唯有如此，才能提升幼儿教育的质量。

2.5注重沟通，家园共育为途径。家庭和幼儿园是幼儿生活的两个最重要的环境，家庭教育伴有亲情，幼儿园教育更为专业，两者的协调配合对促进幼儿的发展意义重大。家庭教育和幼儿园教育应该保持方向上的一致性，否则幼儿就会陷入两难的境地，不利于促进其身心的健康发展。家长和教师可利用家园联系册、幼儿园开放日、家长学校等形式进行交流和沟通，了解幼儿在家和在园的表现。在交流和沟通时应本着"平等、民主、一切为了孩子"的原则，切忌教师向家长告状以及家长向教师兴师问罪式的交流。对于幼儿发展中出现的问题，尤其是一些不良行为的出现，家长和教师更要注意双向沟通，共同商议解决方案，千万不能想当然、一厢情愿地办事。如果家长发现问题不是在第一时间与教师进行沟通，而是通过自认为有效的途径对问题进行处理。这种单方面解决问题的方式，对幼儿的发展是极其不利的。所以，教师和家长要充分认识沟通的重要性，互相尊重、理解和体谅，加强交流，从而形成对幼儿教育的合力，促进幼儿身心的健康发展。

参考文献

[1]丁斐.提高幼儿教育质量的策略探讨[J].新课程（下），2012，11：126.

我的育儿心得范文第5篇

【摘要】 目的 建立新生昆明小鼠耳蜗Corti器体外培养的简便方法并观察耳蜗毛细胞的组织学形态。方法 取生后3～5 d昆明小鼠耳蜗基底膜，平铺在胶原凝胶表面，然后在含有1% 牛血清白蛋白的DMEM/F12培养基中进行培养。采用异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色方法观察耳蜗毛细胞的生长情况。结果 耳蜗基底膜经24、48 h和72 h培养后，内、外毛细胞均生长良好，其结构完整，纤毛束排列有序，无任何缺失。结论 本培养方法简便有效，可用于耳蜗Corti器体外培养实验研究。

【关键词】 小鼠;耳蜗;体外培养;Corti器

Abstract: Objective To establish an simple method for the culture of the organ of Corti from newborn Kunming mouse， and to observe the histological morphology of cochlear hair cells. Methods The cochleae from Kunming mice of postnatal day 3 to 5 were used. The basilar membrane of the mouse was isolated and positioned on the surface of collagen gel， and then cultured in DMEM / F12 medium containing 1% bovine serum albumin. Tetramethylrhodamine isothiocyanate-labeled phalloidine staining was used to observe growing status of hair cells. Results Following culture of the cochlear basilar membrane for 24 hours， 48 hours and 72 hours， the inner and outer hair cells were both growing well. Their structures were intact， and stereociliary bundles were arranged orderly， without any deletion. Conclusions This method is simple and effective， which can be applied to the experimental study of the organ of Corti in vitro culture.

Key words:mouse; cochlea; culture; organ of Corti

耳蜗Corti器体外培养是进行内耳生理和病理生理等实验研究的重要手段，尤其对研究各种耳毒性药物的听觉损伤机制及其防治办法具有较大的实际应用价值。目前关于耳蜗Corti器体外培养的方法各不相同，本文介绍一种简便有效的新生昆明小鼠耳蜗Corti器的体外培养方法，并通过异硫氰酸四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)标记的鬼笔环肽荧光染色技术，观察了耳蜗毛细胞的组织学形态。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择出生3～5 d的昆明小鼠20 只，雌雄不限，由辽宁医学院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂和仪器

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA );TRITC-鬼笔环肽(美国Sigma公司);DMEM / F12培养基(美国Hyclone公司);Ⅰ型鼠尾胶(杭州生友公司);10×BME(北京迈晨生物科技有限公司)。CO2培养箱(SANYO);荧光显微镜(ZEISS A1)。

1.3 耳蜗基底膜取材

将小鼠用75%乙醇喷洒全身进行皮肤表面消毒，断头后沿矢状缝将颅骨切成两部分，去除脑组织以充分暴露颅底。体视显微镜下取出整个耳蜗，并移入盛有预冷的Hanks液的无菌培养皿中。打开蜗壳，依次剥离螺旋韧带、前庭膜及血管纹等结构。由于新生小鼠耳蜗尚未骨化，韧性较好，可用游丝镊夹住基底膜底回末端，将基底膜沿蜗轴完整分离。

1.4 耳蜗Corti器培养

预先在培养皿中滴入10 μL配制好的胶原凝胶液(由Ⅰ型鼠尾胶、10×BME和2% 碳酸钠溶液按9∶1∶1的比例混匀配制而成)，每个培养皿6个胶滴。室温下放置15～20 min，待胶原凝胶液凝固后加入1 mL无血清培养基(DMEM / F12培养基中加入1% BSA和10 U/mL的青霉素G并充分混匀)。将分离后的基底膜分为顶回、中回和底回三段，分别移入培养皿中。沿着胶滴边缘慢慢将基底膜移到顶端，使其正面朝上且平铺到凝胶表面，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h后再加入1 mL培养基，使培养基完全覆盖凝胶，然后放回培养箱中继续培养。在培养24、48 h和72 h后分别终止培养。

1.5 TRITC-鬼笔环肽荧光染色

终止时吸出培养基，向培养皿中加入含有4%多聚甲醛的0.1 mo1/L PBS溶液，4　℃下固定过夜。用游丝镊取下带有基底膜的凝胶，0.01 mo1/L PBS 漂洗3 次后，浸入0.25% Triton X-100 溶液中，室温下处理20 min。然后移入到TRITC- 鬼笔环肽(1∶200稀释)溶液中，室温下避光染色30 min。0.01 mo1/L PBS漂洗后将带有基底膜的凝胶移至滴有抗荧光淬灭封片液的载玻片上，铺平放正并盖上盖玻片。荧光显微镜下观察耳蜗毛细胞形态变化。

2 结 果

荧光显微镜下，可见TRITC标记的鬼笔环肽染色呈现红色荧光，主要定位在毛细胞的纤毛束。培养前，小鼠耳蜗毛细胞形态结构保持正常，外毛细胞的纤毛呈典型的“V”字形排列，而内毛细胞的纤毛则排列成“一”字形(图1A)。经体外培养24、48 h和72 h后，小鼠耳蜗毛细胞仍能保持良好的形态，三排外毛细胞和一排内毛细胞轮廓清晰可辨，纤毛束均排列整齐，未见倒伏(图1B～D)。

3 讨 论

哺乳动物的耳蜗毛细胞属于一种高度分化和稳定的感觉细胞，通常不再具备分裂增殖的能力，因此，耳蜗Corti器体外培养相对于其它器官培养而言具有更高的要求和难度。迄今为止，耳蜗Corti器体外培养仍是一种原代培养方法，而不能像其它组织细胞那样在体外条件下做到传代培养。然而，通过不断改进哺乳动物耳蜗Corti 器的体外培养方法以及改善培养基的成分，人们已经可以延长耳蜗Corti器的体外培养时间并能保持耳蜗正常的形态结构和组织学特性[1]。

国内外已有报道的耳蜗Corti器体外培养的方法大致分为两种，即无血清培养法和有血清培养法。Ding和Chen等[2，3]采用的是无血清培养法。他们将生后2～3 d的小鼠耳蜗基底膜分离出来，放入预先滴有胶原凝胶液的培养皿中，然后加入改良的无血清培养基(BME培养基中加入1%BSA、无血清补充剂、谷氨酰胺、葡萄糖、青霉素G 等物质)，再放入37 ℃、5% CO2培养箱中连续培养24 h 或48 h。而Gross和刘英鹏等[4，5]采用的则是有血清培养法。他们分离出生后1～5 d的大鼠耳蜗基底膜，放入含有10%胎牛血清的DMEM或DMEM/F12培养基中，然后在37 ℃、5% CO2培养箱中连续培养24 h 或7 d。上述两种方法虽然都取得了满意的实验结果，即耳蜗毛细胞生长良好，结构完整，但仍然存在一些缺点。Ding等采用的无血清培养法，需要在培养基中添加昂贵的补充剂，因此成本较高且配制过程复杂;而Gross等在培养基中加入血清，易导致样本中非听毛细胞生长，从而不利于后期观察。为此，本实验在上述培养方法的基础上加以改进，我们选用了营养成分丰富的DMEM/F12培养基，仅向其中加入了1%BSA和10 U/mL青霉素G。结果显示，在体外培养24～72 h期间，小鼠耳蜗内、外毛细胞的纤毛束均排列整齐，毛细胞形态完好，结构清晰完整。这种培养基不仅配制成分简单，不易污染，而且也有利于毛细胞的后期观察，从而有效避免了上述培养方法的不足。

我们在操作过程中体会到，将基底膜平铺在胶原凝胶表面，通过利用来自于培养基的薄层表面张力可有效防止基底膜沉入到胶原组织中;将培养基分两次加入有利于基底膜和凝胶的紧密结合，使基底膜能牢固粘附于凝胶表面。这样有助于保持基底膜的伸展性，使耳蜗毛细胞暴露在表面，便于药物渗透、培养基的更换以及后期染色观察。

综上，本文建立了一种新生昆明小鼠耳蜗Corti器体外培养的简便方法，该方法具有操作简单易行、结果稳定、成本相对低廉、便于推广使用等诸多优点，可用于耳蜗的发育分化、药物耳毒性及其防护措施以及毛细胞再生等方面的体外实验研究。

参考文献

[1] Rastel D，Abdouh A，Dahl D，et al. An original organotypic culture method to study the organ of Corti of the newborn rat in vitro [J]. J Neurosci Methods，1993，47(1-2):123-131.

[2] Ding D，Stracher A，Salvi RJ. Leupeptin protects cochlear and vestibular hair cells from gentamycin ototoxicity [J]. Hear Res，2002，164:115-126.

[3] Chen FQ，Schacht J，Sha SH. Aminoglycoside-induced histone deacetylation and hair cell death in the mouse cochlea[J]. Neurochem，2009，108(5):1226-1236.