免疫室自我鉴定总结范文第1篇

新生儿疾病筛查

质谱技术在该领域的发展已十分成熟。我国很多地区和医院都已采用LC-MS，利用衍生化法检测氨基酸、肉碱等化合物，可同时筛查十几种新生儿疾病（疾病种类可增加）（见表1）。质谱技术能够做到筛查效率高、结果可靠，费用相对低廉，这是常用分析方法例如细菌抑制法、放射免疫分析法、酶联免疫吸附试验、时间分辨荧光免疫分析法、荧光酶免疫分析法等不可企及的。可以预测，随着临床对于疾病的认识和方法的建立，筛查项目的数量将会逐渐增加。以我国每年2200万新生儿中有苯丙酮尿症患儿1700例和先天性甲状腺功能减低症患儿5000例计算，及时诊断和治疗有着十分重要的社会意义和经济效益。

具有临床意义的内源性和（或）外源性化合物的监测

内分泌激素和营养素的监测对个体的疾病诊断、预测和评价健康状态都是非常有帮助的。以维生素D及其代谢产物为例，国内外最新研究认为，维生素D与心血管疾病、代谢性疾病[5]和肿瘤等疾病的发生间具有一定相关性。目前，临床以检测25(OH)-D总量来表示维生素D状况，虽然25(OH)-D水平在体内波动小，相对而言，浓度较高易于测量，半减期较长(~3周)，但LC-MS检测法比放免法、酶免疫法等快速且灵敏，更耐用。1,25(OH)2-D3是维生素D状态最好的监测指标，但其在体内含量极低且不稳定，目前已开发出可用以检测1,25(OH)2-D3的LC-MS法，比放射免疫分析法有更高的特异度和灵敏度，且安全。另外，临床要求监测儿童体内极低量性激素变化情况，但免疫法检测低于试剂盒检测下限的数据波动很可能不能反映体内真实水平。质谱技术可为我们提供pg甚至是fg级的检测限，但需注意高分辨带来的高背景噪音问题，应综合考虑。

治疗药物监测

作为临床个体化治疗重要组成部分，对于一些血药浓度与疗效关系密切、有明确的有效浓度范围、治疗窗较窄、体内代谢个体差异大、药物中毒症状与疾病症状难以鉴别、用于长期治疗和抢救的药物等情况下，临床需测定体液中药物的浓度，指导临床个体化治疗，让患者利益最大化而风险最小化。美国病理学家学会研究表明，采用LC-MS法检测结果更具有真实性和实验可信度，已成为治疗药物监测必备的分析方法。目前，临床实验室仍以免疫分析为主要方法，质谱分析法由于自动化程度不足和缺少认证试剂在近期内难以取代前者，但依旧是实验室非常好的参考方法。

微生物鉴定

感染性疾病的病原学诊断仍以微生物的分离培养作为“金标准”，但能培养成功的仅为少数，且病原体（尤其是真菌）的培养周期较长，费用颇高，因此微生物非培养技术正是为满足难培养或者感染早期诊断需要所建立的方法，包括蛋白质组学、基因组学、宏基因组技术、DNA指纹技术、分子杂交及生物芯片技术等。此处介绍应用MALDIBiotyper高通量微生物鉴定系统，通过鉴定病原体自身独特的蛋白质组成，在MALDI-TOF质谱仪中得到指纹图。该系统另一个重要的组成部分是已包含3千多种微生物蛋白特征指纹图谱数据库，通过特征模式峰的匹配值作鉴定。质谱技术鉴定微生物的优点在于其操作简单（微生物单个菌落前处理简单）、快速且高通量（每1.5h可检测100个样本），灵敏度高（100ng蛋白即可检出），准确率高(<5u，m/z：~10000u)，成本经济（<1欧元），稳定性及重现性好（微生物蛋白指纹谱峰主要集中在2～20ku质量范围内，这些持续高表达的蛋白质受微生物生长环境和状态影响很小），以上优点使得质谱技术在病原体临床诊断方面具有广阔的应用前景。同时，我们也需要认识到质谱技术的限制性，虽然其在微生物检定中可快速、准确、早期地诊断感染性病原体，但仍不能替代药敏实验。合理、正确、综合地将有限的实验数据变为高效的诊断信息才是检验的目的，质谱技术的加入不仅没有妨碍反而极大程度地推进了检验医学的发展。

生物标志物研究

由于质谱技术的高灵敏度、高准确率及易于自动化等特点，毫无疑问地成为解决蛋白质组学关键手段之一，在生物标志物研究中是必不可少的一种手段。生物质谱技术在其中扮演了重要角色，其测定生物大分子的相对分子质量高达400ku，准确率高达0.100%～0.001%，远高于目前常规应用的十二烷基硫酸钠电泳和高效凝胶色谱技术。利用肽质量指纹谱技术，结合蛋白质数据库检索，可实现对蛋白质的快速鉴别和高通量筛选，寻找新的生物标志物。同时，利用生物质谱的准确相对分子质量测定，可实现对二硫键和自由巯基及蛋白质翻译后修饰如糖基化等的快速定位与确定，包括SNPs在内，生物质谱已实现对数十个碱基寡核苷酸的分子量和序列进行测定，应用浸入分裂法结合MALDI-TOF质谱可对基因组SNPs进行分析，该法既节省时间，又适于高通量分析，有利于特异性基因的定位、鉴定和功能表征。

质谱分析技术在检验医学中的应用前景新药物（尤其是靶向药物）和生物制品的不断涌现、基因治疗的重大突破、蛋白质组学和代谢组学的重要发现都是检验医学利用高新技术新一轮发展的重要契机。我国质谱技术在实验室中的使用多为研究型应用，质谱分析技术是否能够整合到检验医学常规实验室，是否可取代常规实验室检测，如何作为常规检查方法开展检测等，以上在世界范围内均属于热点问题。

免疫室自我鉴定总结范文第2篇

【关键词】 PON2 多克隆抗体 重组抗原

人类PON（paraoxonase， 对氧磷酶）基因家族有3个成员: PON1、 PON2和PON3， 它们在染色体长臂7q21.3-22.1上按照着丝粒PON1PON2PON3端粒的顺序排列。在哺乳类动物中， 3个基因高度保守， 在不同种属间， 氨基酸水平上大约有79%～95%的同一性， 核苷酸水平上约有81%～95%的同一性［1］。PON1、 PON3表达主要受限于肝脏， 而PON2在大部分组织中都有表达， 如: 脑、 肝、 肾及睾丸组织［2］。系统进化分析显示PON2是家族中最古老的成员。PON2主要在肝脏中合成， 它能水解多种有机磷杀虫药的毒性代谢产物， 并且能水解广谱的有机磷酸酯底物和许多芳香羧酸酯。此外， PON2还有抗氧化功能， 防止LDL脂质过氧化， 并且能够反转氧化LDL的氧化作用。PON2的同质异构体与许多的病理生理条件有关， 包括: 与原生质脂蛋白的变更， Ⅱ型糖尿病的葡萄糖水平， 新生儿出生质量和冠心病的危险率［3-6］等现象有关。最近发现， PON基因家族与细胞的不对称分裂也有密切的关系， 在细胞不对称分裂中各种因素导致干细胞既有自我更新能力， 又能生成继续分化的细胞。在导致细胞不对称分裂的因素中， 命运决定子起着重要作用， 而PON作为Numb配体在果蝇的干细胞样成神经细胞的不对称分裂中发挥重要作用， Numb抑制自我更新， 且能被分配到注定分化的细胞中， 而Numb的分配依赖于它与PON的相互作用， 且PON在有丝分裂期间已呈不对称分布。由此可见PON对于细胞的不对称分裂研究具有重要意义。本研究中， 我们以PON2为切入点， 应用重组表达的PON2融合蛋白免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体， 并对抗体的特异性进行了鉴定， 这为进一步研究PON2在代谢及内分泌方面疾病， 不对称分裂中的作用奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料 大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)菌株为本实验室保存。pGEX4T1表达载体购于GE公司， pET32a表达载体购于Novagen公司。PCR回收试剂盒、 质粒提取试剂盒购于Omega公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购于PIERCE公司。ExTaq酶、 限制性内切酶、 T4 DNA连接酶购于日本TaKaRa公司。弗氏完全佐剂及不完全佐剂购于Sigma公司。PVDF膜、 ECL反应试剂盒购于Amersham公司。羊抗兔IgGHRP， FITC羊抗兔IgG、 Hochest染核试剂、 羊血清封闭液均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。扩增PON2部分片段的特异性引物由北京英骏生物公司合成。其上游引物序列为: 5′CGGGATCCATGACAGTCAAACATGAGCTTCTTCCAAG3′， 下游引物序列为: 5′CCGCTCGAGTTAGAGTTCACAATACAAGGCTC3′， 下划线部分为BamH I和Xho I的酶切位点。免疫用新西兰大耳白兔（雌性， 2 kg， 120 d）由军事医学科学院实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 PON2重组蛋白的原核表达及纯化 搜索PON2的蛋白序列(Human Protein Reference Database， hprd.org)， 应用 DNAstar分析软件分析其亲水性， 疏水性及可能的抗原表位， 利用美国国立数据库（ncbi）的blast功能进行不同种属蛋白的同源性分析。选取同源性得分较低， 亲水性及免疫原性得分较高的片段进行重组表达。PCR扩增所用模板为PON2的cDNA (由北京蛋白质组研究中心蛋白相互作用实验室惠赠)， PCR产物经回收后， 直接用BamH I和Xho I双酶切， 酶切产物分别与表达载体 pGEX4T1 和 pET32a连接， 连接产物转化至感受态DH5α中， 涂板后37℃培养过夜， 次日挑取单克隆， 接种于含（0.1 g/L）氨苄西林的LB培养液中， 37℃震荡培养至A值约为0.3， 用10 μL PCR体系进行阳性克隆的鉴定， PCR鉴定阳性的克隆进行测序。测序正确后抽提pGEX4T1PON2 和 pET32aPON2质粒， 并转化入E.coli BL21（DE3）进行IPTG诱导表达。pGEX4T1PON2 和 pET32aPON2质粒在E.coli BL21（DE3）中均为包涵体表达， 菌体经超声波破碎后， 采用常规包涵体纯化法纯化， 纯化的包涵体溶解于8 mol/L尿素中， BCA法及SDSPAGE法进行蛋白的定量及纯度分析。

1.2.2 GSTPON2融合蛋白的Western blot分析 将重组菌菌体蛋白经SDSPAGE凝胶电泳后， 点转移至PVDF膜上。经50 g/L脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h后， 加入1∶2 000稀释的鼠抗GST mAb， 室温下孵育2 h， TBST缓冲液洗膜后， 加入HRP羊抗鼠IgG（1∶5 000稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显影。

1.2.3 兔抗人GSTPON2多克隆抗体的制备 取1.6 mg 纯化的GSTPON2重组蛋白溶于1 mL生理盐水中， 并与等体积福氏完全佐剂混合进行充分乳化， 取2只新西兰大耳白兔进行背部及腹股沟皮下多点注射， 每只兔子免疫1 mL抗原及佐剂混合物， 4周后蛋白剂量减半进行第2次免疫， 4周后进行第3次免疫， 免疫剂量为800 μg/只， 第3次加强免疫后10 d进行颈动脉取血， 分离血清。获得后的血清用HisPON2重组蛋白进行特异性的监测。

1.2.4 抗血清的纯化 兔血清用60 mmol/L的醋酸钠缓冲液稀释3～4倍， 0.1 mol/L NaOH调PH至4.5。缓慢滴加辛酸至浓度为25 mL/L， 温柔搅拌30 min后， 4℃， 10 000 g离心30 min， 弃沉淀， 上清用滤纸过滤后加入1/10体积10×PBS缓冲液， 调pH至7.4， 在搅拌条件下缓慢加入预冷的饱和硫酸铵溶液至45%的饱和度， 4℃沉淀过夜。次日于4℃、 3 000 g离心30 min， 弃上清， 用1×PBS缓冲液溶解沉淀。得到的溶液即为纯化的抗体， 对1×PBS缓冲液透析过夜。透析后抗体用SDSPAGE法检测纯度， BCA蛋白浓度测定试剂盒进行抗体的定量分析。

1.2.5 多克隆抗体的鉴定 （1）Western blot分析: 取正常人肝组织匀浆， 用RIPA 裂解液（10 mL/L NP40， 150 mmol/L NaCl， PBS pH7.2， 2 mmol/L， EDTA， 50 mmol/L 氟化钠， 0.2 mmol/L钒酸钠， 蛋白酶抑制剂1∶50）裂解。冰上孵育30 min 后， 13 500 g 离心45 min， 获得正常人肝组织裂解液。HeLa细胞及U937细胞待细胞密度达到约2×107时， 用上述方法处理获得细胞裂解液。上述3种蛋白各取24 μg加入等体积的2×SDS加样缓冲液， 100℃加热15 min， 进行常规SDSPAGE 电泳， 电泳后， 蛋白转移至PVDF膜上， 用50 g/L脱脂奶粉封闭后; 加入50 mg/L纯化的GSTPON2多抗， 室温下孵育1 h， TBST 洗膜后， 加入1∶20 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG， 室温孵育1 h， TBST 缓冲液洗膜后， ECL法显影分析。（2）间接细胞免疫荧光分析: 于6孔板中放入灭菌载玻片， 每孔接种1×105的SY5Y细胞（神经母细胞瘤细胞）， 待细胞爬片后培养48 h， 40 g/L 多聚甲醛（10 mL/L Triton）固定10 min; 空气干燥5 min; PBS 清洗标本3次， 各2 min; 羊血清（用1×PBS 按1∶10稀释）37℃ 封闭30 min; 加入30 mg/L纯化的多抗作为一抗， 4℃孵育过夜; 次日PBS清洗标本3次， 吹干; 滴加1∶200稀释的 FITC羊抗兔 IgG， 室温孵育30 min; PBS 洗3次; 滴加Hochest染核试剂（用1×PBS 按1∶5 000稀释）， 室温孵育30 min， PBS 洗3次; 800 mL/L 甘油封片， 镜检拍照。

2 结果

2.1 PON2重组蛋白的原核表达及纯化

2.1.1 PON2的生物信息学分析 为了有效获得高效价， 高特异性的多克隆抗体， 我们对PON2全长蛋白序列与家兔的PON2蛋白进行了同源性分析， 结果发现靠近C端的片段与兔的同源性较低。我们又用DNAstar软件对蛋白的亲水性及可能的抗原表位进行了分析， 根据亲水性、 免疫原性、 灵活性及柔韧性及同源性等的分析， 最后选取157354位氨基酸进行下一步的克隆表达。

2.1.2 PON2基因的PCR扩增 用PON2 cDNA作为模板扩增目的片段， 结果见图1， 在594 bp处有1条特异的扩增条带， 片段大小与预期值一致， 表明PCR特异性好， 扩增成功。将扩增后目的片段分别连接入pGEX4T1 和 pET32a 载体， 并转化入DH5α中， 菌液PCR鉴定结果显示插入片段大小与目的片段大小相符， 表明PON2目的片段已插入至载体中。挑取PCR阳性克隆进行测序， 测序结果与PON2基因序列进行比对。比对结果显示获得的片段与PON2基因序列有99%的一致性， 其中的半胱氨酸突变成酪氨酸， 两者同属极性中性氨基酸， 对抗体的制备不会产生影响。

图1 PON2基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）

Fig 1 Agarose gel electrophoresis analysis of PON2 by PCR

M: DNA marker; 1: PCR product of PON2.

2.1.3 PON2重组蛋白的表达与纯化 从阳性克隆中提取质粒， 转化入BL21(DE3)大肠杆菌中， 进行IPTG诱导表达， 结果见图2， 与BL21空菌对照相比， 目的克隆中有明显蛋白表达， 带GST标签的重组蛋白理论相对分子质量(Mr)应为46 000， 与图2中条带3显示的Mr相符。带His标签的重组蛋白理论Mr应为40 000， 与图2中条带4显示的Mr也相符， 因此我们成功获得了带GST标签及His标签的PON2重组表达载体。由于载体中GST标签来自寄生虫的序列， 从而使重组蛋白具有更高的免疫原性， 因此我们选择带GST标签的蛋白进行免疫， 带His标签的蛋白用于抗体检测。图中结果显示， 融合蛋白主要以包涵体的形式表达， 重组蛋白的纯度均在90%以上， 浓度为4 g/L以上， 适合用于免疫。通过Western blot检测， 应用抗GST 的抗体能够在相应位置检测到GSTPON2融合蛋白， 结果见图3。

图2 PON2重组蛋白SDSPAGE分析（略）

Fig 2 SDSPAGE analysis of PON2 fusion protein

1: Protein marker; 2: BL21 E.coli control; 3: GSTPON2 fusion protein (46 000); 4: HisPON2 fusion protein (40 000).

图3 GSTPON2融合蛋白的Western blot分析（略）

Fig 3 Western blot analysis of GSTPON2 fusion protein using antibody against GST

1: Null PGEX4T1 vector expressed in E.coli BL21 as control; 2: GSTPON2 fusion protein expressed in E.coli BL21.

2.2 兔抗人GSTPON2多克隆抗体的制备 将上述获得的GSTPON2重组蛋白经3次动物免疫后收集兔抗血清， 并在第1次加强免疫后进行Western blot检测特异性， 结果如图4， 用His标签的重组蛋白作为检测抗原， 与阴性对照比较（BL21菌体总蛋白）， 在相应位置有一特异性结合抗体的条带， Mr为40 000， 与HisPON2重组蛋白Mr一致。用免疫前正常兔血清与HisPON2重组蛋白杂交， 发现正常兔血清与HisPON2蛋白无反应， 这些结果说明此抗体与E.coli BL21空菌无反应而只与PON2目的片段有特异反应， 以上结果说明此次免疫是成功的。

图4 兔抗GSTPON2抗血清特异的Western blot分析（略）

Fig 4 Western blot analysis of specificity of rabbit antiserum against GSTPON2

1: BL21 E.coli control (primary antibody: normal rabbit serum); 2: HisPON2 fusion protein (primary antibody: normal rabbit serum); 3: BL21 E.coli control (primary antibody: rabbit antiserum against GSTPON2); 4: HisPON2 fusion protein (primary antibody: rabbit antiserum against GSTPON2).

2.3 抗血清的纯化 三次免疫后取兔血清进行辛酸硫酸铵法纯化多抗， 纯化抗体纯度经SDSPAGE电泳鉴定， 结果见图5。Mr约55 000处为抗体重链， 25 000处为抗体轻链， 由于纯化抗体为多抗， 所以在25 000处呈弥散状， 从图中可以看出， 纯化后抗体纯度在95%以上。

图5 抗GSTPON2多克隆抗体的纯化（略）

Fig 5 Purification of polyclonal antibody against GSTPON2

1: Protein marker; 2: GSTPON2 pAb.

2.4 多克隆抗体的鉴定

2.4.1 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体的Western blot分析 文献报道， PON2在很多组织中广泛表达， 因此我们分别选择了人肝脏组织、 HeLa细胞系、 U937细胞系作为研究对象， 将组织和细胞裂解后获取裂解蛋白作为电泳样本， 用纯化的兔抗人GSTPON2的多克隆抗体进行Western blot分析（图6）。结果发现兔抗人GSTPON2重组蛋白的多抗均可特异识别肝脏组织、 HeLa细胞、 U937细胞中Mr约为39 000 的蛋白， 而PON2的天然蛋白Mr 39 398。说明制备的PON2多克隆抗体能结合天然PON2蛋白。

2.4.2 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体的间接免疫荧光分析 由GeneCards数据库可知PON2在脑组织中有高表达， 用SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞）进行多克隆抗体的间接免疫荧光分析， 结果见图7。PON2蛋白在细胞质膜上表达， 在间接免疫荧光试验中固定细胞时加用10 mL/L Triton X100进行通透化处理， 故胞质内亦明显的阳性着色。为进一步研究PON2的细胞定位奠定基础。

图6 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体对不同组织蛋白Western blot分析（略）

Fig 6 Western blot analysis of rabbit polyclonal antibody against PON2

1: Human liver tissue lysate; 2: U937 cell lysate; 3: HeLa cell lysate.

图7 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体的间接免疫荧光分析（略）

Fig 7 Indirect immunofluorescence analysis of rabbit polyclonal antibody against human PON2 protein

A， B， C: pAb against PON2(30 mg/L); D， E， F: Normal rabbit serum (1∶1 000).

3 讨论

Sergei等［6］报道PON蛋白作为Numb蛋白的伴侣参与细胞的不对称分裂过程中。细胞不对称分裂是由一个母细胞发育成二个不同的细胞， 在许多的发育进程中是非常重要的。细胞不对称分裂是通过祖细胞局限的决定子作用来实现的。在果蝇有丝分裂中， 神经命运决定子Prospero和Numb分别通过Miranda和PON定位于细胞基底区， 这些决定子与Inscutable和Bazooka的顶端定位一起控制纺锤体的方向， 以保证祖细胞分裂成顶端的成神经细胞和基底区的神经节母细胞。PON蛋白作为细胞不对称分裂中一个决定子发挥重要的作用。

PON2作为PON基因中的其中一个成员， 以前的研究证明PON2多态性与家族性高胆固醇血症、 糖尿病等有关。但PON2作为细胞不对称分裂的决定子却鲜有研究。目前尚无抗PON2的商业化特异抗体， 这使得研究PON2功能的工作举步维艰。本实验以此为切入点， 制备了兔抗人PON2蛋白的多克隆抗体。本研究采用原核表达技术， 表达了GSTPON2和HisPON2融合蛋白， 并以GSTPON2为免疫原， 以HisPON2为检测原（提高检测的精确度）， 免疫动物成功制备了抗PON2抗血清。应用Western blot方法证明抗血清对PON2具有很好的识别特性， 应用间接免疫荧光染色检测细胞中表达的PON2， 其主要定位于细胞质中。研究PON2在细胞不对称分裂中的作用， 其重要问题是研究PON2与其他细胞不对称分裂决定子的在细胞分裂时的共定位问题， 以及PON2能否有PON蛋白作为Numb伴侣的作用。上述兔抗人PON2蛋白的多克隆抗体将为今后PON2分子的功能研究提供必要的工具。相应的单克隆抗体的制备实验已在进行中。

参考文献

［1］ Dragomir ID， John FT， Audrey S， et al. Human paraoxonases (PON1， PON2， and PON3) are lactonases with overlapping and distinct substrate specificities［J］. J Lipid Res， 2005， 46(6): 1239-1247.

［2］ Mira R， Tony H， Khetam H， et al. Decreased macrophage paraoxonase 2 expression in patients with hypercholesterolemia is the result of their increased cellular cholesterol［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2004， 24(1): 175-180.

［3］ Carey JN， Noam B， Victor G， et al. Paraoxonase2 deficiency aggravates atherosclerosis in mice despite lower apolipoproteinBcontaining lipoproteins［J］. J Bio Chem， 2006， 281(40): 29491-29500.

［4］ Robert AH， Philip WC， Stephen WS， et al. Paraoxonase2 Gene (PON2) G148 variant associated with elevated fasting plasma glucose in noninsulindependent diabetes mellitus［J］. J Clin Endocrinol Metab， 1997， 82(10): 3373-3377.

免疫室自我鉴定总结范文第3篇

1 ABO/Rh变异型的鉴定与输血

实验室发现ABO/Rh血型变异日益增多。例如:恶性肿瘤、细菌吸附导致血型抗原的减弱或获得性A或B抗原;造血干细胞移植导致的血型转换;血型抗原本身的多态性;各亚种亚型和变异型的存在等,使输血实验室工作者无法立即准确判定受检样本的血型。此时需要各种附加试验,如吸收放散试验鉴定ABO亚型;特异性D表位分析试验鉴定D变异型;红细胞膜酸处理鉴定获得性A和B抗原等,可部分解决血型亚型和变异型血型鉴定的难题。

2 提高血库常规检测试验的灵敏度和稳定性

输血实验室有2个最基本的试验用于血型鉴定,即直接血凝试验和用于抗体鉴定与配血的间接抗球蛋白试验(IAT)。IAT技术现在仍然被认为是经典的标准技术。但IAT技术重现性差和不便于自动化检测。从20世纪90年代开始,凝胶技术、亲和柱凝集技术和红细胞固相黏附分析这3中新的技术被相继应用到输血领域中。尽管这3种技术从操作步骤,所用实验仪器方面都与试管法不同,但实验原理上仍是抗原抗体相互作用后,通过红细胞的凝集来显示结果。这些新技术的设计目的是试管法试验的完善,即形成稳定的终点和便于自动化。而且这些新方法在血型检测时,所需的样本量较少,试验的重复性很好。且具有无需细胞洗涤以及对技术的依赖性降低等优点,特异性与灵敏度被认为是可与低离子强度间接抗人球蛋白试验相媲美。当然它也有一定的缺点,如在ABO和Rh定型试验也比较耗时,需20 min(10 min孵育,10 min离心);以及在获得试验体系高灵敏度的同时,也较易产生假阳性。

3 交叉配血试验显示不配合时的输血策略

随着输血前检查项目的增多和诊断试剂、实验体系灵敏度的提高,主次侧交叉配血不合的现象也日益增多。从实验室或医学文献中我们知道,许多因素将影响红细胞的免疫性破坏和体内存活。目前较明确的因素包括IgG的亚类、抗体激活补体的能力、抗体的总量、红细胞上抗原的数量、抗原从红细胞上解离的能力以及受血者单核吞噬系统的活力等。通过研究这些常规血清学试验的结果来推断输血后供血红细胞在受体内存活的状态,有时也是可能的。如利用预热技术,在37℃条件下进行配血试验,以判断抗体在正常生理体温条件下是否具有活性等等。但在另外一些情况下,则不得不采取一些非常规的方法,例如,同位素Cr51来测定红细胞的存活率;以功能细胞试验预判血型同种抗体的临床意义。这类功能细胞试验有3种:单核细胞单层检测、抗体介导的细胞毒试验和化学发光试验。这些试验都是通过抗体包被的红细胞和单核细胞之间的相互作用,以模拟致敏红细胞在体内被破坏的过程,同时结合抗体的红细胞被单核细胞吞噬后,在吞噬细胞内被裂解的这种红细胞在体内调理性吞噬的方式进行设计的。这些功能细胞试验可为我们在输血前提供一个该血型同种抗体是否有临床意义的评估,即在体外给我们模拟了一个输血后体内免疫应答的预试验。

4 血型基因诊断和临床应用

随着血型遗传学的迅速发展,通过分子遗传学技术已经能够独立地使血清学上的血型鉴定的困难或者不可能定型的血型鉴定出来。分子生物学技术的发展,使人们不断报道出以前未知的血型等位基因。但同时常常发生假阴性和假阳性结果。随着技术上的发展,定义不同的等位基因在人类血细胞上的表达已成为随之而来的更为重要的工作。而发现等位基因的时代也随之过渡到了探明基因表达阶段的时代。比如,用为矩阵的自动定型方法来取代血清学定型。此外,PCR产物与探针杂交后,通过芯片扫描可分析荧光强度的方法能够快速并且自动化地将供者和受者的血液进行“完全”定型,以增加输血的配合率,并将同种免疫反应的危险性降到最低。

临床上所发生的输血反应并不全都是有血型抗原的同种免疫造成的。有时,同样的血输给不同的人,会产生不同的结果。有研究发现恶性实体瘤、异基因干细胞移植、有糖尿病病史的患者产生同种免疫的风险性较高。机体处于炎症状态时,免疫反应可能增强等都有可能增加输血反应的发生。

综上所述,在各种血型鉴定与配血试验中,免疫血液学研究方法只有标准的操作步骤,并没有通用的、唯一的方法。各种血型抗原与抗体都有其自身的特性,我们需研究和选用更为合适的方法对样本的血型进行测定,已达到更为快速、准确的血型定型。以便于提供安全、及时、有效临床用血,解除患者的疾患。

免疫室自我鉴定总结范文第4篇

【关键词】 Norovirus NVgz01 核衣壳蛋白 单克隆抗体

诺如病毒作为流行性肠胃炎的主要病因之一， 无论在发展中国家还是发达国家， 从儿童到成年人都可以受到诺如病毒感染， 并可造成爆发流行， 成为影响人类健康的不可忽视的问题， 近年来逐渐引起了研究者的重视。美国CDC经过评估认为， 每年在美国发生的食源性疾病有2 300万宗是由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起的［1］; 在欧洲， 数据显示1995～2000年间， 有超过85％的食源性病毒肠胃炎爆发案例由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起［2］。由于人类诺如病毒分为GⅠ和GⅡ两组［3， 4］， 根据北京［5］、 太原［6］和武汉［7］三地的血清学调查结果， 初步认为GⅡ组病毒为我国主要流行组。由于诺如病毒无法在体外感染细胞及动物模型来进行培养分离鉴定， 目前对诺如病毒的诊断方法主要是免疫电镜法（IEM）、 放射免疫法（RIA）、 ELISA法、 RealTimePCR法等［8］， 其中， 夹心ELISA方法， 即使用单克隆抗体(mAb)捕获患者粪便标本中的病毒抗原来进行检测的方法， 由于交叉反应性小， 特异性较强且敏感度较高， 成为目前研制诺如病毒检测试剂所主要采用的方法。本研究中我们以E.coli表达的GⅡ组广州株NorovirusN蛋白作为免疫原， 免疫BALB/c小鼠并制备mAb， 为研制诺如病毒检测试剂盒奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 诺如病毒粪便标本为使用DakoCytomation公司的IDEIA Norovirus 抗原检测试剂盒检测为阳性的标本。6周龄的雌性BALB/c小鼠， 购自中山大学实验动物中心。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系为本实验室保存。诺如病毒核衣壳蛋白表达重组质粒 pET28a（＋）NoroNP由本实验室制备及保存， 诺如病毒N蛋白基因的克隆、 表达和鉴定方法见文献报道［9］。PEGMW3350购自Sigma公司， HAT、 HT 和RPMI1640购自Gibco公司， 新生牛血清购自杭州四季青公司， 羊抗鼠IgG购自BOSTER公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 免疫小鼠 用pET28a（＋）NoroNP重组表达载体表达诺如病毒GⅡ组广州株的全长衣壳蛋白， 收集产物经Ni2＋亲和层析柱纯化， 以此纯化后蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠， 每次免疫剂量为70 μg/只， 免疫途径为腹腔免疫， 每间隔2周免疫1次， 累计免疫3次， 初次免疫使用弗氏完全佐剂， 后两次免疫使用弗氏不完全佐剂; 第3次免疫完成10 d后小鼠尾部取血检测免疫效果， 血清效价达到104后可脾内注射进行加强免疫， 3 d后取脾融合。

1.2.2 细胞融合 取免疫后小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规融合方法融合。

1.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化 融合后细胞用含HAT的RPMI1640培养液进行筛选， 10 d后待杂交瘤细胞生长至视野的1/3大小时， 取100 μL细胞上清用ELISA方法对抗体进行检测。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行多次克隆化， 待所有单克隆细胞培养液中抗体阳性率为100%时， 将生长状态良好并抗体ELISA值高的单克隆细胞扩大培养。

1.2.4 腹水的制备及效价测定 将6周龄以上的BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL/只弗氏不完全佐剂， 诱导1周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞， 7～10 d后可产生腹水。收集腹水离心除去细胞碎片。用重组蛋白(5 mg/L)作为抗原包板， 腹水从10-2起10倍稀释至10-7作为一抗（连续梯度稀释）， 羊抗鼠IgG作为二抗， 用间接ELISA方法对腹水效价进行测定。

1.2.5 mAb免疫球蛋白亚类鉴定 采用PIERCE公司的Monoclonal Antibody Isotyping Kit(HRP/ABTS)对mAb的亚类进行鉴定， 按试剂盒说明书进行。

1.2.6 mAb特异性检测 用Western blot方法测定mAb对GⅡ组广州株诺如病毒衣壳蛋白， 及对天然GⅡ组诺如病毒粪便标本的特异性反应情况。

1.2.7 mAb配对试验和初步应用 将效价较强的N2C3、 N7C2、 N4B1 3株mAb用硫酸铵辛酸法纯化［10］， 并分别将这3株抗体用辣根过氧化物酶（HRP）标记。将纯化过的抗体分别用5 mg/L浓度包被酶标板作为一抗， 诺如病毒衣壳蛋白作为抗原， 标上HRP酶的3株抗体分别作为二抗， 使用ELISA夹心法对mAb进行配对试验。配对完成后挑选灵敏度相对较高而本底相对较低的配对方式， 与PCR方法（本实验室建立）检验为诺如病毒GⅡ组阳性的水样腹泻患者粪便标本进行反应。

2 结果

2.1 分泌抗诺如病毒衣壳蛋白mAb的杂交瘤细胞株的建立 用pET28a（＋）NoroNP重组表达载体表达诺如病毒GⅡ组广州株的全长衣壳蛋白免疫小鼠， 取小鼠血清测效价， 在满意滴度下将小鼠进行脾内加强免疫， 3 d后取脾细胞与Sp2/0细胞进行融合。10 d后用纯化的NVNP 5 mg/L包被酶标板， 杂交瘤细胞上清作为一抗， 羊抗鼠IgG作为二抗检测抗体， 并同时用pET28a（＋）载体表达的轮状病毒蛋白作为阴性对照， 以排除与大肠杆菌BL21细胞成分和pET28a（＋）载体成份反应的假阳性抗体。对抗体分泌能力强的培养孔用有限稀释法进行2次克隆化， 共筛选出4株能稳定分泌抗诺如病毒核衣壳蛋白抗体的细胞株， 分别为N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。

2.2 腹水效价的测定 收集腹水， 用间接ELISA方法测定， 结果N2C3和N7C2 2株抗体最强， 腹水稀释至10-6P/N值为0.4; N4B1株抗体较弱， 腹水稀释至10-4P/N值为0.5; N8A9株抗体最弱， 腹水稀释至10-3P/N值为0.3（阴性对照P/N值为0.08）。

2.3 mAb免疫球蛋白亚类鉴定 用PIERCE公司试剂盒对mAbIg的类型和亚类进行特异性鉴定， 结果2株mAb鉴定为IgG2a（N2C3和 N4B1）， 2株mAb鉴定为IgM（N7C2和 N8A9）， 4株mAb轻链均为к链。

2.4 mAb特异性检测 4株mAb分别与表达重组蛋白和诺如粪便标本进行Western blot检测， 表达重组蛋白上由于带有表达载体上的T7和（His6）标签， 因而Mr比天然诺如病毒核衣壳蛋白（Mr为56×103～58×103）多了3×103左右。Western blot结果见图1， mAb不仅可以同表达重组蛋白进行特异性反应， 并且可以同天然诺如病毒核衣壳蛋白进行特异性反应。其中N2C3和N7C2的反应性较强， N8A9和N4BI对粪便标本的反应性较弱。

图1 mAb的Western blot分析（略）

Fig 1 Western blot analysis of expression products in E.coli and native NV stool sample with four mAbs

A: N2C3; B: N8A9; C: N7C2; D: N4B1. 1: Native norovirus stool sample; 2: Expressed recombinant protein of Norovirus NVgz01.

2.5 mAb配对试验和初步应用

2.5.1 配对 N2C3、 N7C2、 N4B1 3株抗体每株都与自身及其他2株抗体用夹心法进行配对试验， 将表达蛋白稀释至0.16、 0.084、 0.056和0.042 mg/L作为样本进行检测。P/N值结果见表1。结果显示N2C3和N7C2可以进行自身配对， N2C3和N7C2之间可以互相配对， N4B1不能进行自身配对， 并且与其他两株配对效价都不高。

表1 N2C3、 N7C2和N4B1 mAb在夹心ELISA中的结果（略）

Tab 1 Sandwich ELISA results for N2C3， N7C2 and N4B1

2.5.2 初步应用 根据配对结果， 选择阳性值较高且本地值较低的N2C3＋N7C2E配对方式。将53份PCR检测为诺如病毒阳性的粪便标本取上清， 用PBS稀释10倍作为样本进行检测。结果显示， 35份标本ELISA检测为阳性（P/N值为 0.408～3.045之间， 阴性对照为0.170）， 相对阳性率为66％。

3 讨论

诺如病毒最早发现于1972年， 由Kapikian等［11］借助免疫电镜技术（IEM）观察到一种病毒颗粒， 并根据发病地区将此病毒命名为 Norwalk virus(NV)。此后， 越来越多的诺瓦克样病毒在世界各地被发现， 这些分离得到的病原都以其流行地区或发病特征等命名。1993年Jiang等［12］通过分析诺瓦克病毒的cDNA克隆的核酸序列发现其属于杯状病毒属（calicivirus）， 后根据病毒RNA聚合酶区或衣壳蛋白区核苷酸和氨基酸序列的同源性比较， 将人类杯状病毒（HuCV）分为3个基因组（genogroup）:Ⅰ组（代表株NV）、 Ⅱ组（代表株SMA）和Ⅲ组（代表株Sapporo）。现将这3组病毒统称为诺如病毒（Norovirus）。诺如病毒在我国最早发现于1995年［13］， 后于我国多个城市和地区均有发现。根据文献报道， 当前GⅡ组病毒为中国主要流行的诺如病毒［14］。

诺如病毒是单股正链RNA病毒， 其基因组长度为7～7.5 kb， 包括3个ORF， 其中ORF2编码一个Mr为58～65×103的病毒核衣壳蛋白［15］。由于诺如病毒在感染患者粪便中排毒量少， 排毒时间短， 且无法在体外感染细胞及动物模型来进行培养分离鉴定［16］， 因此为了对诺如病毒进行进一步的研究， 制备mAb， 或研制疫苗等， 都只能依靠表达系统来完成。自20世纪80年代通过杆状病毒表达系统确定了ORF2为病毒核衣壳蛋白编码序列后， 对诺如病毒的免疫学研究工作主要都通过表达ORF2来进行。

诺如病毒广州株NVgz01（DQ369797）为本实验室测出的本地流行株， 经同源性分析属于诺如病毒GⅡ组［17］， 符合我国人杯状病毒的流行趋势。过往研究者在研究ORF2时多采用杆状病毒载体系统来表达， 且表达的核衣壳蛋白可以自行组装成病毒样颗粒， 但杆状病毒表达系统相较于E.coli表达系统而言费时费力。E.coli表达系统操作简便， 重组蛋白产量高， 并且可以使用配套纯化方法对重组蛋白进行高度纯化。Tomoko等［18］的研究证实， 用E.coli表达系统也可以表达出用于免疫研究的病毒核衣壳蛋白， 并且证实重组蛋白具有良好的抗原性， 因而本实验也采用E.coli表达系统表达诺如病毒核衣壳蛋白。利用Ni2＋亲和层析柱对重组N蛋白进行纯化， 纯化后表达蛋白纯度占总蛋白的95％以上， 用此纯化后的重组蛋白作为抗原免疫小鼠， 然后制备mAb。为了保证制备mAb的特异性， 我们使用表达轮状病毒VP6的pET28a（＋）VP6BL21的细胞裂解液作为阴性对照， 确保了所获得的杂交瘤细胞分泌的抗体均是针对诺如病毒重组N蛋白的。经过多次克隆化， 共获得了4株稳定分泌抗衣壳蛋白抗体的杂交瘤细胞株， 并对mAb Ig的类型和亚类进行特异性鉴定， 结果2株mAb鉴定为IgG2a（N2C3和N4B1）， 2株mAb鉴定为IgM（N7C2和N8A9）， 4株mAb轻链均为к链。虽然本实验使用的二抗是羊抗鼠IgG， 但其能筛选出IgM的原因可能是此二抗识别的表位是位于IgG和IgM所共有的恒定区上， 因而在ELISA过程中此二抗也有可能识别出IgM。根据ELISA和Western blot检测结果分析， N2C3、 N7C2、 N4B1和N8A9均与表达衣壳蛋白有良好的反应性和特异性， 并且都与患者粪便标本中的天然诺如病毒具有反应性和特异性， 其中N2C3和N7C2 2株的反应性和特异性都较强。根据N2C3和N7C2的配对结果， 以重组表达蛋白作为样本进行检测时， 样本浓度稀释至0.042 mg/L时P/N值仍能达到1.139～1.452， 证明N2C3和N7C2 2株抗体之间的配对检测具有较强的灵敏性和特异性。在此配对结果基础上， 对53份PCR检测为Norovirus GⅡ组阳性的腹泻患者粪便标本进行检测， 共检出35份阳性结果， 阳性率为66％。出现PCR结果和ELISA结果不完全相符的原因可能是由于PCR方法的假阳性率比较高， 或是配对的两株单抗在病毒组内表现株型特异性， 这两种可能性都有待进一步研究证实。

参考文献

［1］ Mead PS， Slutsker L， Dietz V， et al. Foodrelated illness and death in the United States［J］. Emerg Infect Dis， 1999， 5(6): 607-625.

［2］ Lopman BA， Reacher MH， van Duijnhoven Y， et al. Viral gastroenteritis outbreaks in Europe， 1995-2000［J］. Emerg Infect Dis， 2003， 9(1): 90-96.

［3］ Jiang X， Maston DO， Cubitt WD， et al. Genetic and antigenetic persity of human caliciviruses (HuCVs)useing RTPCR and ELISA［J］. Viral Gastroenteritis Arch Viral， 1996， 134(12): 251-262.

［4］ Berke T， Golding B， Jiang X， et al. A phylogenetic analysis of caliciviruses［J］. Med Viral， 1997， 52(4): 419-424.

［5］ 靖 宇， 钱 渊， 王洛平. 北京地区人群诺瓦克样病毒血清抗体水调查［J］. 病毒学报， 1998， 14(4): 322-328.

［6］ 靖 宇， 钱 渊， 吴立平， 等. 太原市部分人群诺瓦克样病毒血清抗体水平的调查［J］. 中国儿科杂志， 1999， 37(9): 559-561.

［7］ 刘满清， 谭 慧， 王 斌， 等. 90例非轮状病毒腹泻患儿粪便中诺瓦克样病毒的检测［J］. 疾病检测， 2005， 20(7): 362-363.

［8］ 段燕文， 黄 英. 诺瓦克样病毒胃肠炎的实验室和流行病学诊断方法［J］. 中国卫生检验杂志， 1995， 5(5): 313-316.

［9］ 李 潇， 周 荣， 胡龙波， 等. 诺瓦克病毒广州株N蛋白基因的克隆、 表达及抗原性鉴定［J］. 南方医科大学学报， 2007， 27(9): 1410-1413.

［10］ 朱立平， 陈学清. 免疫学常用实验方法［M］. 北京: 人民军医出版社， 2000: 51-56.

［11］ Kapikian AZ， Wyatt RG， Dolin R， et al. Visualization by immune electron microscopy of a 27 nm particle associated with acute infections nonbacterial gastroenteritis［J］. J Virol， 1972， 10(5): 1075-1081.

［12］ Jiang X， Wang M， Wang K， et al. Sequence and genomic organization of Norwalk virus［J］. Virol， 1993， 195(1): 51-61.

［13］ 方肇寅， 温乐英， 晋圣谨， 等. 在我国腹泻患儿中发现诺瓦克样病毒感染［J］. 病毒学报， 1995， 11(9): 215-219.

［14］ 郭 丽， 周红莉， 江 涛， 等. 诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定［J］. 中国人兽共患病学报， 2006， 22（5）: 414-418.

［15］ Greenberg HB， Valdesuso J， Kalica AP， et al. Proteins of Norwalk virus［J］. J Virol， 1981， 37(3): 994-999.

［16］ 金 奇. 医学分子病毒学［M］. 北京: 科学出版社， 2001: 571-576.

免疫室自我鉴定总结范文第5篇

【摘要】 目的: 制备RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体， 并进行初步鉴定和应用， 为研究RAI16蛋白的功能及作用机制获得重要的实验工具。方法: 应用Fmoc法化学合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽， 经C18的RPHPLC纯化后， 通过高碘酸钠法将纯化的RAI16蛋白的多肽与KLH交联; 皮下注射抗原免疫新西兰纯种大耳白兔， 加强免疫得到抗血清， 应用蛋白G纯化获得多克隆抗体。对纯化的抗体进行ELISA、 免疫组化、 Western blot等初步鉴定和应用。结果: 化学合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽， 纯化后多肽纯度为96％ ， 达到免疫用抗原标准。多肽与KLH交联， 用于免疫动物。经纯化后的抗体效价为1∶125 000。该多肽抗体可特异识别人脾脏组织中相对分子质量(Mr)约为55 000的RAI16蛋白。结论: 所制备的多克隆抗体能与天然RAI16蛋白发生特异性反应， 可应用于ELISA、 免疫组化、 免疫沉淀和Western blot等实验， 为确定RAI16蛋白的组织分布和亚细胞定位、 研究RAI16蛋白的功能及作用机制提供了重要的实验工具。

【关键词】 视黄酸诱导蛋白16; 多肽抗原; 多克隆抗体; ELISA; 亲和层析

近几年在对视黄酸（RA）作用研究中发现了视黄酸诱导蛋白（RAI）系列基因， 但尚无具体完整的结构和功能研究的相关报道， 只是推测RAI 系列蛋白可能是一种“新型”的胞内参与信号转导转录调控的蛋白质家族。视黄酸诱导蛋白16（RAI16）蛋白作为家族成员之一， 了解其结构功能， 对认识整个家族特征具有重要的意义。

我们前期工作以Tec激酶结构域作为“钓饵”蛋白， 利用酵母双杂交技术筛选构建于转录激活结构域(AD)载体的人胎肝cDNA文库， 经营养缺陷选择及诱导筛选及初步鉴定， 发现并确证了一个新的阳性克隆， 对筛库所得基因片段测序经BLAST比对分析后， 确定为RAI16(Homo sapiens retinoic acid induced 16)基因， 已被GenBank收录(编号为BC052237)， 组织来源为脑Ⅳ型星状细胞瘤， 其编码蛋白为RAI16。并由此推译出其蛋白质一级结构， 对其功能区、 信号肽、 亚细胞定位、 二级结构及亲疏水性等进行了分析。研究表明， RAI16蛋白是一种定位于胞质内内质网上的分泌型的球形信号蛋白， RAI16蛋白很可能在肝干细胞和肝癌诱导分化过程中， 作为RA诱导蛋白被信号蛋白分子募集至胞质内， 通过磷酸化、 去磷酸化、 豆蔻酰化、 酰胺化等修饰， 通过不同的活化形式和剪切方式以及胞质与胞核间的移位， 完成其在信号转导中的重要角色［1］。因此推测RAI16蛋白可能为RA信号通路中一类胞质内重要“新”的信号蛋白分子。结合前期工作， 根据人RAI16蛋白的cDNA 编码的氨基酸序列， 结合计算机分子模拟设计11个氨基酸多肽， 经与载体蛋白KLH 偶联作为免疫原， 免疫家兔制备多克隆抗体， 并经亲和层析进行纯化。从而制备出可与天然RAI16蛋白发生特异性结合反应的抗RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体， 为进一步深入研究RAI16蛋白的功能、 阐明RAI16在肝癌细胞诱导分化信号转导通路中的作用和明确RAI16与Tec蛋白之间的相互作用机制作奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料 免疫和筛选用的RAI16蛋白cDNA编码的氨基酸序列N端第44～55位氨基酸的多肽为化学合成， 免疫用抗原C端交联载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)， 均由上海艾比玛特公司采用合成肽自动合成仪合成。Methylated bovine serum albumin(MBS)和福氏佐剂为Sigma公司产品。HiTrapTM Protein G HP抗体纯化柱为Amersham公司产品。羊抗兔IgGHRP和 DAB为北京中杉金桥生物技术公司产品。ECL反应试剂盒为Amersham公司产品。SephadexTMG25 脱盐柱(Amersham Biosciences， Sweden)、 小牛血清、 牛血清白蛋白、 loading buffer为TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司产品; 免疫用兔子系新西兰纯种白兔2只（1.5个月左右， 雄性健壮， 质量为2 000～ 2 200 g）， 由上海申旺实验动物中心提供。

1．2 方法

1.2.1 RAI16合成肽的设计 结合前期的研究， 从GenBank中检索到RAI16蛋白cDNA全长序列， 利用DNAstar软件根据抗原指数(Antigenic Index)、 亲水性结构(Hydrophilicity Plot)、 柔韧区(Flexible Regions)及表面概率结构(Surface Probability Plot) 4个参数及特异性、 合成难易程度等方面综合分析RAI16序列的特点， 确定氨基酸片段为欲合成的肽序列， 从N端起包含第44～55位氨基酸， 其序列为: CSTPAKKTDIPWRNH2。

1.2.2 RAI16蛋白N端多肽抗原的合成及其与KLH 和BSA 的交联 RAI16合成肽由上海艾比玛特公司采用合成肽自动合成仪合成。化学合成采用Fmoc方法， 从C端向N端合成， 获得的多肽经常规C18的RPHPLC柱进行纯化。纯度为96%。RAI16与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法， 将5 mg合成肽加入7 mg KLH和BSA中， 边振荡边缓慢加入新鲜配制的3 g/L 的戊二醛溶液 (1 mL)， 室温作用2 h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜， 交联形成RAI16KLH、 RAI16BSA偶联物。

1.2.3 RAI16蛋白合成肽抗体的制备 取200 μg合成肽KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后， 于兔颈部和背部皮下多点注射， 每点约100 μg。4周后加强免疫， 剂量同前， 用不完全福氏佐剂充分乳化后， 于兔背部皮下多点注射; 以后隔2周加强免疫1次; 从第3次加强免疫开始， 每次免疫后7 d， 经耳中央动脉采血测定抗体的效价， 经过4次加强免疫后符合要求时， 立即颈动脉采血， 分离血清后， 无菌分装保存于-80℃备用。

1.2.4 ELISA检测抗血清效价 用人脾脏微粒体蛋白和合成肽BSA偶联物以1 mg/L 的浓度包被ELISA检测板， 每孔100 μL， 4℃孵育过夜后， 用10 mL/L胎牛血清封闭， 37℃ 2 h后， 洗涤备用。取出包被好的检测板， 每孔加入按1∶2梯度稀释的抗血清100 μL (对照为正常兔血清)， 37℃孵育30 min， 洗涤3次后每孔加入1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG 100 μL， 37℃孵育30 min， 洗涤3次后进行TMB显色， 37℃孵育15 min， 中止反应后， 用酶标仪测定样品的A450的吸光值。

1.2.5 抗体血清的亲和纯化 将获得的兔抗人RAI16多肽的抗体血清用结合缓冲液(100 mmol/L Tris/HC1， pH7.5， 100 mmol/L NaC1)稀释后， 经0.45 μm的滤膜过滤， 加样到HiTrapTM ProteinG HP的纯化柱上， 用洗脱缓冲液(100 mmol/L甘氨酸HCL， pH2.5)洗脱后， 收集洗脱峰。

1.2.6 间接ELISA检测抗体相对亲和常数 用合成肽交联BSA以1.5 mg/L和1.0 mg/L的浓度包被ELISA检测板， 封闭后加入倍比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的抗体， 再加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗， TMB显色测定A450。以抗体浓度的对数为横坐标， A450值为纵坐标作图。以曲线达到水平时的A值为100%， 求出A50即50% A值对应的抗体浓度。按照Kaff=(n-1)/2(n［Ab’］ t - 2 ［Ab ］ t) 算出抗体亲和常数， 其中［Ab’］ t 、 ［Ab ］ t指的是A50时即包被抗原为1.5 mg/L和1.0 mg/L时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度， ［Ag］ t、 ［Ag’］ t指的是包被的抗原浓度本实验中即指15 μg和10 μg， n=［Ag］t/［Ag’］t， 本实验中n=2。

1.2.7 多克隆抗体的Western blot分析 用RIPA裂解液(10 mL/L NP40， 150 mmol/L NaCl， PBS pH7.2， 2 mmol/L EDTA， 50 mmol/L氟化钠， 0.2 mmol/L矾酸钠， 蛋白酶抑制剂1∶50)裂解冰冻人脾脏组织样品， 冰上孵育30 min后， 13 500 g离心45 min， 获得脾脏组织总蛋白， 取5 g总蛋白裂解液并加入等体积2×SDS加样缓冲液， 于100℃加热5 min后， 进行常规SDSPAGE电泳， 分离胶浓度为100 g/L。电泳结束后， 电转至PVDF膜上， 用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h; 然后加入1∶1 000稀释的兔抗人RAI16蛋白N端多肽多抗， 室温下孵育2 h， TBST缓冲液洗膜后， 加入羊抗兔IgGHRP抗体(1∶5 000稀释)， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显色。

1.2.8 RAI16在再生肝组织中表达的Western blot分析 组织蛋白提取按申能RIPA使用说明书操作（同时增加5 mmol/L benzamidine， 1 μmol/L aprotinin A， 1 μmol/L pepstatin， 1 μmol/L leupeptin， 1 mmol/L PMSF， pH7.4）， 上清进行冷冻干燥24 h， 用含蛋白酶抑制剂的PBS 60 μL稀释蛋白沉淀; 对获得肝组织蛋白进行考马斯亮蓝法定量， 调整密度为6 g/L， 样品容积与载样缓冲液等量混合， 实际浓度为3 g/L。样品15 μL/lane， 100℃， 煮沸5 min、 迅速冷却， 短暂离心; 生物素标记Marker ， 10 μL+10 μL载样缓冲液/lane ， 100℃， 煮沸2 min、 迅速冷却， 短暂离心。按生物素标记Marker、 正常对照组、 肝切除术后0.5 h、 1 h、 2 h、 4 h、 8 h、 24 h、 48 h、 72 h的顺序加样后， 进行常规SDSPAGE电泳， 分离胶浓度为110 g/L。电泳结束后， 电转至PVDF膜上， PVDF膜经标记、 PBS洗后入60 g/L nonfat milk的pH7.2的PBS中封闭， 室温1～2 h， 置 4℃冰箱过夜; 然后加入1∶300稀释的兔抗人RAI16多克隆抗体， 同时加入小鼠抗βactin mAb 7.5 μL， 使体积比为1∶2 000， 室温下孵育1 h; PBS缓冲液洗膜后， 加入抗兔HRPIgG、 抗鼠HRPIgG， 工作浓度均为1∶2 500， 抗生物素HRP抗体30 μL， 工作浓度为1∶1 000， 室温孵育1 h， PBS缓冲液洗膜后， ECL法显色， 背景洗涤， 再定影。

1.2.9 多克隆抗体的免疫组化染色 取出用丙酮固定的石蜡包埋的大鼠再生脏组织切片， 滴加50 g/L BSA， 室温下封闭20 min， 加入1∶1 000稀释RAI16多肽抗体， 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗兔IgG2HRP， 37℃孵育20 min， PBS洗片后进行DAB显色， 苏木素复染， 返蓝后， 脱水、 透明、 封片， 镜检， 放大400倍拍照记录结果。

2 结果

2.1 RAI16的氨基酸序列分析 用DNAstar软件根据亲水性结构、 柔韧区、 抗原指数及表面概率结构4个参数对氨基酸序列进行综合分析(图1) 。预测的结果进行综合考虑， 选取欲合成的肽序列为第44～55位氨基酸(图中阴影区)， 其序列为: CSTPAKKTDIPWRNH2。

2.2 RAI16蛋白多肽抗原的合成与纯化 化学合成的多肽经HPLC纯化后， 纯度可达96％， 交联KLH后可作为抗原免疫动物。

2.3 抗血清的特性鉴定 ①效价测定: 合成多肽经4次动物免疫并进行效价测定确定抗体产生后， 收集兔抗血清， 蛋白G纯化后， 经间接ELISA检测， 效价约为1∶125 000。②相对亲和力常数测定(图2): 用间接ELISA测定纯化后抗体的亲和常数10-5～10-6 M-1。

2.4 RAI16合成肽多克隆抗体的Western blot分析 由于RAI16在脾脏组织表达丰度较肝组织显著， 因此选取脾脏组织并将其裂解后获取的总蛋白作为电泳样本， 对纯化的兔抗人RAI16合成肽多克隆抗体进行Western blot分析， 结果发现RAI16合成肽的多克隆抗体可特异性识别脾脏组织中相对分子质量(Mr)约为55 000的蛋白(抗原) (图3)。

2.5 RAI16在再生肝组织中表达的Western blot分析 由于在酵母双杂交系统筛选中Tec酪氨酸激酶与RAI16蛋白相互作用的现象， Tec本身与肝癌细胞、 肝干细胞和肝细胞的关系密切， Tec是肝干细胞和肝细胞增殖、 定向诱导分化及凋亡信号转导途径中关键的蛋白激酶连接分子［1］， Tec在肝再生过程中起着重要的调节作用［2］。因此， 将正常肝组织、 0.5 h、 1 h、 2 h、 4 h、 8 h、 24 h、 48 h、 72 h鼠再生肝组织分别裂解后获取的总蛋白作为电泳样本， 用制备的兔抗人RAI16合成肽的多克隆抗体为一抗， 以羊抗兔HRPIgG、 羊抗鼠HRPIgG为二抗， ， 以小鼠抗βactin mAb作阴性对照， Western blot分析RAI16在再生肝组织中的表达。结果发现在从0.5 h到72 h鼠再生肝组织中， RAI16的表达于0.5 h即可检测到， 4 h达高峰（图4）， 提示RAI16直接参与了肝细胞的增殖调控。

2.6 RAI16多克隆抗体的免疫组化定位 RAI16蛋白是一种定位于胞质内内质网上的分泌型的球形信号蛋白［1］。经免疫组化实验证明， RAI16多肽多克隆抗体可与大鼠再生肝细胞胞质中的RAI16蛋白结合(图5) 。

3 讨论

随着人类基因组计划的完成， 蛋白质研究已成为后基因组时代的重要任务。抗体是研究蛋白质的必不可少的工具之一， 在一种新的cDNA被克隆后， 由此推译出的氨基酸序列人工合成多肽并与载体偶联， 免疫制备其抗体， 是一个快速而有效的手段［3］。抗原表位的选择是制备合成肽的关键。一般认为， 亲水性强和具有稳定构象的线性表位， 对于维持抗原的免疫反应性极其重要［4-7］ 。我们通过综合分析RAI16的亲水性， 柔韧性， 抗原性及表面性4个参数预测的结果， 最终确定以亲水性强、 抗原指数高、 表面性及柔韧性好的区域(即44～55位的11个氨基酸)作为RAI16的抗原决定簇。但有些亲水肽段形成的抗原决定簇在变性条件下易受到破坏， 从而影响其抗体的特异性， 因此抗体纯化后需要对其进行全面鉴定［6］。由于RAI16在正常肝组织中表达较低， 而在脾脏、 结肠、 胎盘等组织中有明确的表达， 因此， 我们选择脾脏组织的蛋白作为电泳样本， 对纯化的兔抗人RAI16合成肽的多克隆抗体进行Western blot特异性分析， 结果发现兔抗人RAI16合成肽的多克隆抗体可特异性识别脾脏组织中Mr约为55 000的蛋白(抗原)。

鉴于RAI16最初作为Tec相互作用蛋白被筛选克隆得到， 提示Tec和RAI16蛋白之间存在相互作用。而Tec是国内外研究较活跃的一个非受体型蛋白酪氨酸激酶， 他主要介导细胞信号转导。已有研究表明Tec 基因是一种与肝再生调控密切相关的早期反应基因［2］， 是肝干细胞和肝细胞增殖、 分化、 凋亡信号转导路径中关键的蛋白激酶连接分子。因此， 我们推测RAI16作为Tec激酶区作用蛋白， 可能与肝再生调控密切相关。我们利用新制备的抗RAI16合成肽多克隆抗体对其在再生肝组织中表达进行Western blot分析， 结果发现在从0.5 h到72 h鼠再生肝组织中， RAI16的表达于0.5 h即可检测到， 4 h达高峰， 提示RAI16具有调控肝细胞增殖的作用。经免疫组化实验证明， RAI16多肽多克隆抗体可与再生肝细胞胞质中的RAI16蛋白结合。此抗体的初步应用， 进一步表明我们所设计和合成的多肽是成功的。制备的高质量的抗RAI16合成多肽抗体效价高、 亲和力强、 特异性好， 能与天然RAI16发生反应， 可进一步用于免疫组化、 免疫沉淀和免疫印迹等实验、 以及其他体外实验分析。该合成肽及其抗体的制备， 为RAI16蛋白功能及作用机制的研究奠定了基础。

参考文献

［1］ 王 阁， 邓 婧， 杨 进， 等. 视黄酸诱导蛋白16蛋白质结构功能分析［J］. 世界华人消化杂志， 2007， 15(12): 1342-1346.

［2］ 王 阁， 冷恩仁， 胡 辂， 等. 肝细胞生成素及肝部分切除快速诱导肝再生相关基因Tec 的表达［J］. 中华消化杂志， 2002， 22(8): 455-458.

［3］ Liu ZH， Li MY， Cui DF. A novel method for polypeptide design to prepare specific antibody of the peptide and applied to immunoassay［J］. J Immunol Methods， 2003， 281(1-2): 17-25.

［4］ Merson RR， Franks DG， Karchner SI， et al. Development and characterization of polyclonal antibodies against the aryl hydrocarbon receptor protein family (AHR1， AHR2， and AHR repressor)［J］. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol， 2006， 142(1-2): 85-94.

［5］ Matsumoto K， Torimaru A， Ishitobi S. Preparation and characterization of a polyclonal antibody from rabbit for detection of trinitrotoluene by a surface plasmon resonance biosensor［J］. Talanta， 2005， 68(2): 305-311.