微生物组学研究范文第1篇

论文摘要 土壤宏基因组学技术是近来发展比较迅速的一种新方法，是研究土壤微生物生态学的基础，也是获是土壤中各种基因资源的一种有效手段。介绍了土壤宏基因文库的构建、筛选及土壤宏基因组研究现状和这一技术的局限性。

宏基因组学源于20世纪70年代土壤微生物基因组DNA的直接提取技术的实现，随着微生物学和生物技术的不断发展，Handelsman于1998年提出了宏基因组学的概念[1]。宏基因组学又叫环境基因组学（Environmental Genomics）或群体基因组学（Community Genomics），定义为利用现代基因组技术直接研究自然状态环境中的有机体群落，而不需要分离、培养单一种类的微生物。生物学和化学的结合孕育了宏基因组学的诞生，而宏基因组学的发展需要最大限度的利用现代生物技术和实用筛选技术。

土壤宏基因组学技术是近来发展比较迅速的一种新方法[2]，这种方法从土壤环境样品中直接提取微生物基因组DNA（宏基因组）并克隆于不同载体，再将重组载体转移到适宜的宿主以建立宏基因组文库；同时结合不同的筛选技术，从基因文库中筛选新基因或新的生物活性物质。应用这些免培养的新方法和新技术，可以绕过微生物菌种分离培养这一技术难关，直接在基因水平上研究、开发和利用无法培养的微生物资源；有利于揭示不可培养微生物的基因多样性，为农业、医药和环境的可持续发展提供丰富的资源。

1土壤宏基因文库的构建

关于土壤宏基因组学技术的构建已有许多研究报道[3]，文库的构建需要足够高质量的DNA，由于土壤微生物往往会与土壤其他组分紧密结合，这就增加了提取土壤DNA的难度[4]。常用的方法包括直接提取法和间接提取法。直接提取法是将样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，使其释放DNA，继而抽提纯化；间接提取法是首先去除土壤等杂质，通过不同的离心速度从土壤中分离出细胞，然后对细胞进行抽提。直接提取法提取的DNA片段较小（1~50kb），提取率高，操作简单；间接提取法提取的片断较大（20~500kb），纯度高，但操作繁琐，有些微生物在分离过程中会丢失。

根据插入片断大小，可以把基因文库分成2类：质粒载体的小片段插入（小于15kb）和柯斯质粒（15~40kb）或BAC（细菌人工染色体）（超过40kb）载体的大片段插入。大肠杆菌（Escherichia coli）是表达土壤细菌基因或基因簇的通用宿主，穿梭载体或BAC文库可将大肠杆菌包含的文库信息转移至其他宿主如链霉菌或假单胞菌[5]。

载体系统的选择取决于所提取土壤DNA的质量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的载体拷贝数、使用的宿主以及筛选方法等。如对腐殖质含量较高或剪切较严重的DNA样品适宜构建质粒文库，小片段的文库适用于筛选新的与代谢相关的单基因或小操纵子；而对于含较大基因簇或大片段的DNA样品则需要构建大片段和大容量的载体文库。Rondon直接把环境DNA克隆到低拷贝BAC载体，以大肠杆菌作为宿主构建了含100Mbp 的小文库（SL1），

并从这个文库中检测到DNA酶、脂肪酶、淀粉水解酶的活性。

2土壤宏基因组文库的筛选

宏基因文库的筛选主要有功能驱动筛选、化合物结构水平的筛选、序列驱动筛选，底物诱导基因表达筛选。功能驱动筛选是根据重组克隆产生的新活性进行筛选，在工业上有很多重要的酶就是用这种方法发现的。其主要缺点是要在寄主中进行功能表达，造成筛选工作量大，效率低。化合物结构水平的筛选是根据不同结构的物质在色谱中有不同的峰值，通过比较转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图筛选产生新结构化合物的克隆子。此方法工作量大，费用高。序列驱动筛选是不依赖重组基因在宿主中表达来筛选，而是根据已知功能的基因序列设计探针或PCR引物，通过杂交进行筛选具有目标序列的克隆子。底物诱导基因表达筛选是利用底物诱导克隆子分解代谢基因进行筛选，这种方法已经成功的从宏基因中筛选出芳烃化合物诱导的基因。国内外的资料显示这4种筛选方法可以筛选到所需要的物质，但筛选效率低，费用高。

3土壤宏基因组研究现状

利用宏基因组学的技术，科研人员筛选到了许多功能基因，加拿大TerraGen Discover公司最先在以链霉菌为宿主的宏基因组文库中筛选到了具有抗菌活性的5种新的小分子物质TerragineA、B、C、D、E[5]；Courtois等利用柯斯载体构建了含5 000个克隆子的环境基因组文库，采用PCR 序列分析的方法，筛选出编码聚酮合成酶的新基因，同时采用HPLC技术发现了脂肪二烯醇中2种新的化合物，两者互为同分异构体；Yun等选用pUC19为克隆载体构建大肠杆菌基因组文库，利用活性筛选方法，从30 000个重组子中筛选出1个含淀粉酶基因（amyM）的克隆子。

2005年，LimHK等以枯草芽孢杆菌为宿主，建立了森林土壤的宏基因组文库，筛选到2个具有抗菌活性的克隆，对其结构进行分析，得出其中一个为产红色色素的靛玉红，另一个为产蓝色色素的靛蓝，是靛玉红的异构体。2006年，VogetS等首次研究了从土壤宏基因组文库中筛选到的一种纤维素酶的性质，证实了其具有较广的pH值和温度适应范围，并且在较高的盐度时也具有活性，具有工业应用价值。

4土壤宏基因组学的技术局限性

总DNA提取技术尚存在一定的限制，土壤环境中，由于微生物与土壤颗粒紧密结合的特性以及腐殖酸等抑制性物质存在等原因，从中难以获得适于构建宏基因组文库的高分子量DNA。Bertrand等采用间接提取法，通过Nycodenz梯度离心，所回收的土壤DNA片段大小己能达到400kbp，但至今基于原位裂解获得>100kbp土壤DNA的提取技术尚未突破，运用原位裂解法构建更大片段环境宏基因组文库（现有的土壤宏基因组文库中，平均插人片段最大为44.5kb）仍是一个难点。不可避免地，环境宏基因组文库所包含微生物基因组信息的偏差将直接导致“基因遗漏”现象发生，如海洋中普遍存在的微生物固氮基因，却在测序量高达1.6Gbp的马尾藻海水宏基因组文库中被遗漏，表明仅运用宏基因组学技术同样会忽略部分的微生物资源。

阳性克隆筛选频率低是宏基因组学的另一个瓶颈所在，运用经典的功能筛选方式，往往是在数千个，甚至数百万个重组克隆子中才能检测到有用的活性克隆，造成此局面一个重要的原因是外源基因的异源表达水平低下。目前根据核酸序列相似性及基因保守区设计探针或引物的杂交、PCR筛选方法，从文库中发现新基因的比率尚不到已知基因的40%。

环境微生物宏基因组研究能让我们发现存在于不可培养微生物中的一些重要的生理过程。许多实验室已经开始努力从不可培养土壤生物的基因组序列中去获得重要的基因，特别是从Acidobacterium组中，因为它是土壤中最常见的细菌。这些数据提供了关于这些生物在土壤中扮演角色的线索。随着足够序列信息的获得，这些生物的代谢途径将被构建出来，引导我们采取有效的策略去培养这些生物。这些数据也将准许我们构建包含所有已知开放阅读框的微生物芯片，来确定这些基因在时间和空间上的表达状况。

尽管宏基因组技术本身还存在着一些局限性，但它为土壤微生物的研究提供了一种有效的研究策略，尤其是对于99％以上不能获得纯培养的土壤微生物来说，宏基因组学不仅是研究土壤微生物生态学的坚实基础，更是我们获得土壤中各种基因资源的一个有效手段。

5 参考文献

[1] HANDELSMAN J，RONDON M R，BRADY SF，et al.Molecular biological access to the chemistry of unkown soil microbes：a new frontier for natural products[J].Chen Biol，1998，5（10）：245-249.

[2] VOGET S，LEGGEWIE C，UESBCK A，et al.Prospecting for novel bicoatalysts in a soil metagenome[J].Appl.Emiron.Microbiol，2003（69）：6235-6242.

[3] RONDON MR，AVGUST PR，BETTENMANN AD，et al.Cloning the soil metagenome：a strategy for accessing the genetic and funcfional persity of uncultured microorganisms[J].Appl.Environ.Microbiol，2000（66）：2541-2547.

微生物组学研究范文第2篇

宏基因组学是研究生态群体基因功能和其相互作用的新科学领域，以特定生态环境中微小生物遗传物质的总和作为研究对象，基本研究策略是通过克隆、异源表达，筛选出有用的新基因及其产物。宏基因组学为生命学科和药学研究提供了一个强有力的新技术，并在包括医学在内的许多领域取得了新成就。本述评对宏基因组学的概念、技术和应用作了简要介绍。

【关键词】 宏基因组学；宏基因组文库构建；文库筛选

ABSTRACT: Metagenomics is a new field of science applied to study gene function and interaction ecotype communities. Metagenomic technology is based on the study of the DNA of microbial communities in their natural environments directly. Its basic strategy includes extracting total community DNA， constructing genomic library， and analyzing library with similar strategy to functional genomics. It provides a powerful tool to help us to exploit for novel biotechnological and pharmaceutical applications. Metagenomics has developed rapidly and acquired many novel accomplishments including in medicine. The concept， methodology and application of metagenomics have been briefly reviewed.

KEY WORDS: metagenome; metagenomics; metagenomic library construction; library screening

随着人类科学认识论和思维方式的深化，在分子生物学和分子遗传学技术方法的支撑下，顺应21世纪生命科学的发展，在基因组学的基础上诞生了一门崭新的交叉学科——宏基因组学(metagenomics)[1]。宏基因组学的问世引起世界科学界的极大关注，发展很快，它代表了生命学科今后的研究方向。本文就宏基因组学的产生、概念、研究的基本策略和方法进行综述。

1 宏基因组学的产生、发展和概念

1.1 宏基因组学的产生背景

人类基因组计划(human genome project， HGP)的完成促使了基因组功能性研究计划的开展，并推动从结构基因组学研究时代进入功能性基因组研究为主的后基因组时代，人体基因的功能研究成为生命科学领域的研究热点。

但是越来越多的研究表明，人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制，还与其他生物基因组相关；对疾病的易感性、药物反应等许多现象，也无法全部用人体基因差异来解释。已证明体内菌群的组成和活动与人的生长发育、生老病死息息相关，例如人类胃溃疡发病机制和病因与寄生在胃里的微生物的致病作用有关。因此，必须考虑与人类长期共生的微生物群体对人类的影响。

此外，自然界现存的物种数量以万亿计，包括人类、大量的高等动物、植物和微生物。世界上的万物是彼此依赖、相互作用、相互制约和相互促进，形成共生、共存和协调平衡发展的欣欣向荣局面。要想了解生命的起源、本质、进化和相互作用及影响，就必须对彼此密切相关的生物进行各个基因组学及其相互关系的研究。这种研究超越了传统意义上单一物种的基因组学分析，研究对象复杂、范围更广而方法要更新，它要求在基因学、基因组学的基础上有新的学科来承担这一新的任务。因此，21世纪人类提出了生态基因组学(ecogenomics)的概念[3]。它要求对特定环境下多种生物的基因组进行研究，这将有助于揭示生命现象的本质，发现新的基因和确定人类疾病的病因。

1.2 宏基因组学的发展与概念

宏基因组学的发展经历了环境基因组学、微生物基因组学、宏基因组学到人类宏基因组学的阶段。

1.2.1 环境基因组学的提出与发展

1991年Pace首次提出环境基因组学(environmental genomics)的概念，并在同年构建了第一个通过克隆环境样品中DNA的噬菌体文库，环境基因组学(亦称微生物环境基因组学)的研究受到广泛关注[23]。1998年美国国立环境卫生科学研究所启动了环境基因组计划(environmental genome project， EGP)，开展有关人体遗传变异与环境胁迫相互关系的研究，引起各国科学家的极大关注，标志着生命科学界将在更深层次上对环境与基因相互作用对人类健康的影响进行系统全面的研究[34]。环境基因组学第一次提出特定生态条件下，全部生物基因组总体概念，这是基因组学的重要进展。

1.2.2 微生物基因组学与宏基因组学概念的提出

环境是一个相互作用的复杂体系，又是一个不断变化的动态过程，该体系的生命与非生命的两个方面是不断互为因果，相辅相承的。为了方便研究，人类把精力集中到特定环境的微生物群体上来。

Handelsman等[1]于1998年提出生命研究对象应是生物环境中全部微小生物的基因组(the genomes of the total microbiota found in nature)，首次提出针对特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和进行研究的这一宏基因组(metagenome)概念，指出应用宏基因组学研究微生物复杂群落基因组的方法将成为快速发展的领域。2007年3月，美国国家科学院以“环境基因组学新科学——揭示微生物世界的奥秘”为题发表咨询报告，指出宏基因组学为探索微生物世界的奥秘提供新的方法，这是继发明显微镜以来研究微生物方法的最重要进展，将是对微生物世界认识的革命性突破。报告呼吁建立全球宏基因组学研究计划，建议大批量启动中小型宏基因组学研究项目，对自然环境微生物群落(如海水或土壤)、寄生微生物群落(如人体肠胃或口腔)、人为控制环境微生物群落(如污水处理厂或水产养殖厂)等展开研究；启动少量大型综合性项目，对宏基因组学研究方法、技术路线、理论框架和更为复杂的动态微生物系统进行研究[8]。

1.3 宏基因组学的概念

宏基因组(metagenome)和宏基因组学(metagenomics)的概念尚待统一，其中的“宏”所对应的英文是前缀“meta”，它源于希腊语，作为构词成分意思是超越(overrach)、在上(above)、在外(beyond)、在后(behind)等，它具有更高层次组织结构和动态变化的含义，在metagenome中有更高级、更复杂的意思。国内一般翻译为“宏”或“元”，形象表明其涵盖范围的广泛性。本文采用较为普遍的宏基因组/宏基因组学译法(注：国外有人还称为Ecogenome /Ecogenomics，译为生态基因组/生态基因组学)。

1.3.1 广义宏基因组学的概念

广义宏基因组是指特定环境下所有生物遗传物质的总和，它决定了生物群体的生命现象。它是以生态环境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律的一门科学。宏基因组学使得人们摆脱了物种界限，揭示了更高层次上的生命运动规律。

1.3.2 狭义宏基因组学概念

狭义宏基因组学则以生态环境中全部细菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它不是采用传统的培养微生物的基因组，包含了可培养和还不能培养的微生物的基因，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律。如1998年Handelsman等提出土壤宏基因组学的定义是：土壤微生物群体的全部基因组，并对其进行克隆和功能分析[1，8]。

由于狭义宏基因组学概念的对象具体、范围局限和研究目标明确，一般文献上所提的宏基因组学，除非特别指明，一般均指的是狭义宏基因组学。

1.3.3 人类宏基因组学

人体内部或体表有数以万亿的微生物个体存活，包括细菌、古细菌、真菌、寄生虫和病毒等。这些微生物占人体总重量的1%-2%，成人体内细胞约有90%为微生物细胞，其余约10%为人体细胞，因此从某种意义上说一个完整、健康的成年人是诸多物种组成的复合体。人体内共生的菌群包括肠道、口腔、呼吸道、生殖道等处菌群。其中许多微生物对人体健康维持有重要作用，帮助消化食物，制造维生素。大多微生物具有许多独特的生物功能，如有些微生物具有独特功能的一些酶，对各种复杂有机化合物有降解作用，有些微生物可以在一些极端环境下生存等等。同时，还有一些微生物则可能导致人体疾病。然而，目前对健康和疾病状态下这些细菌、真菌和其他微生物的作用还知之甚少。国际学术界把多种微生物聚居在一起形成的系统叫做“微生物群落”，也称菌群。把人体内所有微生物菌群基因组的总和称为“人体宏基因组”(human metagenome)。人类宏基因组学(human metagenomics)则是研究人体宏基因组结构和功能、相互之间关系、作用规律和与疾病关系的学科。它不仅要把总体基因组序列信息都测定出来，而且还要研究与人体发育和健康有关的基因功能。

2004年，美国国立卫生研究院专门设立“利用宏基因组学研究口腔微生物”的研究项目，2006年春季召开会议，正式成立人类宏基因组计划国际联盟，启动人类宏基因组计划，作为协调这一宏大科学计划的国际组织[3，8]。人类宏基因组计划又称“人类第二基因组计划”，它相当10个人类基因组计划工作量，其规模和广度将远远超过人类基因组计划。人类宏基因组计划目标是：把人体内共生菌群的基因组序列信息都测定出来，而且要研究与人体发育和健康有关的基因功能。该计划可能发现超过100万个新基因。该计划完成后，将对阐明人类许多疾病的发生机理、研究新药物、控制药物毒性等产生巨大作用。科学家认为，人类基因组和人类宏基因组这两本“天书”绘制完成后，将有助于更好地破解人类疾病。

2007年12月19日美国国立卫生研究院正式宣布启动一项新的基因工程——人体微生物群系计划(human macrobiotic project， HMP)。人类微生物组学(human microbiomics)是对人体内或者表面存在的所有微生物的总体进行研究。显然这和宏基因组学的概念、策略和研究方法一致，人类宏基因组学正式与人类医学研究联系在一起。

2 宏基因组学研究的策略和基本过程

2.1 宏基因组学的研究策略

宏基因组学的研究还处于初期发展阶段，但其研究的基本过程和基本策略已基本清楚。在此要强调的是，宏基因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原则指导下，基于特定生态环境基础上，依据整体、系统、动态变化和相互作用的观点，运用特殊的技术路线和方法，对研究范围中所有基因组展开研究的学科。

“宏基因组学”是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速发展和聚合酶链式反应广泛应用的基础之上，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术，涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其策略是从特定环境中直接分离所有微生物DNA，将大片段的DNA克隆到受体菌中表达，然后根据某些生物活性筛选有应用价值的克隆。包括两个方面[920]：①宏基因组文库的构建：宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般包括样品总DNA 的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]。②宏基因组文库的筛选：根据其研究目的，宏基因组文库筛选通常有功能筛选(functional screening)和序列筛选(sequence based screening)两种方法。

2.2 宏基因组学的研究步骤

基因组学的研究过程，一般包括从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA 到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的克隆等4个步骤。特别要指出的是，在基因组学研究领域中，其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因组学中，则是要测定由多种微生物组成的复杂群体(community)的混合基因组序列。这种差别的关键就是，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材料。

2.2.1 分离特定环境生物DNA

方法上不同于传统的先培养微生物再提取DNA的做法，而是首先直接收集能够代表特定生物环境生物多样性的样品；然后利用各种理化方法破碎微生物，使其释放DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。

2.2.2 纯化的大分子量DNA进行克隆

在对DNA 酶切或者超声打断处理，并与合适的载体DNA 进行连接，构建重组体。

2.2.3 将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转入模式微生物建立各自的无性繁殖系

例如转入大肠埃希菌中，使那些以前无法研究的不可培养微生物的DNA 在模式微生物中得到复制、表达，进而得到研究。所有带有宏基因组DNA 载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。

2.2.4 对宏基因组文库的DNA 进行分析

基于不同的研究目的，有很多分析方法，主要分为两类：一类为表型功能筛选，即利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因。例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。功能分析法根据重组克隆产生的新活性进行筛选，可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。另一类为序列基因型分析，即对文库中所有或部分的DNA 进行测序分析，以应用于生态学研究。例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，及尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。

3 宏基因组学的技术方法

宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。宏基因组学的研究策略和方法大致相同，现按照宏基因组学研究的基本过程和策略对常用方法和技术予以简要介绍。

3.1 样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集

提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，尽可能代表自然状态下的微生物原貌，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。要采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇[45]。所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。应严格操作，谨防污染，并且保持DNA 片段的完整和纯度。已有许多商品化宏基因组DNA提取试剂盒可用，同时很多实验室仍致力于宏基因组DNA提取方法的改进[68]。

常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法(细胞提取法)。直接裂解法是将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法等)和化学法、酶法等。不同直接裂解法的提取方法差别在于细胞破壁的方式不同。此法操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性好，但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1-50kb)，难以完全去除酚类物质。细胞提取法先采用物理方法将微生物细胞从环境中分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。此法可获得大片段DNA(20-500kb)且纯度高，但操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA也不容易抽提出来。

为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率，需要在克隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集[911]，一个比较好的富集方法是稳定同位素示踪技术[12]。

抑制性消减杂交技术[13]是抑制性与消减杂交技术相结合的更简单、更快速的分离差异基因的方法。该方法不仅利用了消减杂交技术的消减富集，同时也利用了抑制性技术进行了高效率的动力学富集，所以该技术是一项富集特定基因、证实微生物之间基因不同的非常有用的技术方法。

3.2 宏基因组文库的建立

宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。偏重于低拷贝、低丰度基因还是高拷贝、高丰度基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物还是整个操纵子及编码不同代谢途径的基因簇。基因文库的建立过程中需要选择合适的克隆载体和宿主菌株。传统的方法是直接利用表达载体构建宏基因文库，但是表达载体可插人的宏基因片段一般小于10kb。克隆中宿主菌株的选择主要考虑到转化效率、宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等。目前大肠杆菌是最为常用的宿主[14]，此外，链霉菌和假单胞菌也可以作为构建文库的宿主，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。

3.3 宏基因组文库的筛选

由于环境基因组的高度复杂性，需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因。筛选技术大致可分为四类:①基于核酸序列差异分析；②基于目的克隆功能的特殊代谢活性；③基于底物诱导基因的表达；④基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其他技术。

3.3.1 基于序列的筛选方法

通常根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆。用这种方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基因，这一策略可以分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因[1516]。另一种方法是对含有16S rRNA等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文库随机测序[17]。优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，文库中那些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛选，故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成员有一定的局限性，也很难获得全序列。

直接序列分析法(sequencedriven screening method)是对所构建宏基因组文库的克隆进行随机测序分析，显然可以得到最多的信息[1820]。也可用鸟枪法对宏基因组文库进行测序，但需要进行大量的测序和分析工作，需大量人力、物力及财力。虽然DNA序列分析技术不断发展，但与个体微生物基因相比，宏基因组文库包含着巨大的序列片段，但对这些序列片段进行后续的分析则极为困难，结合其他的筛选方法可以得到更多的信息。

用微阵列技术(基因芯片)进行初步筛选，可以很大程度上减少测序量和后续的序列拼接等工作量。但微阵列技术在用于宏基因组文库筛选时，除了其本身由于交互杂交等导致的特异性低、灵敏度较差等缺点外，同样不能用于对未知功能基因的筛选，且检测不到环境中存在的那些低丰度微生物的序列[2122]。

3.3.2 基于功能的筛选方法

功能性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克隆。由于基于活性的筛选不需要已知序列的信息，故能较快地找到可用于工农业和医药的蛋白质和天然产物。功能性筛选的方法有两种，一种是对具有特殊功能的克隆子进行直接检测，如利用其在选择性培养基上(如含有化学染料和不可溶的或发光的酶反应底物)的表型特征进行筛选[23]。这种方法具有较高的灵敏度，可检测到较少的目的克隆。另一种方法是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行[24]。

功能性筛选法的优点是筛选过程比较简单、快速，只要基因能表达，就可以根据基因表达特性进行筛选，不需要复杂的实验过程。不足之处是这种筛选方法依赖于目的基因在新的宿主中表达，但使用模式微生物并不能把所有的宏基因组DNA表达出来，而且要求克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中破坏基因某个组件将使得基因没法表达，也就不能根据功能进行筛选，故检出的概率很低，工作量大，往往从上万个克隆中只能筛选到几个有用的克隆。

3.3.3 底物诱导基因表达筛选(substrateinduced geneexpression screening， SIGEX)

SIGEX是用于能利用各种底物诱导的分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技术用来筛选代谢相关基因及酶基因[25]。由于编码相关代谢基因或酶基因通常呈簇存在，通常与该物质诱导的启动子和同源转录调控序列毗邻，往往在有底物诱导的条件下才表达，反之则不表达。首先构建一个含有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体，这个载体可将宏基因组DNA克隆到GFP基因上游，使该基因的表达受到宏基因组DNA片段中的启动子调控。当外加目标底物时，可以影响GFP的表达，进而通过活细胞荧光分离技术(fluorescence activated cell sorting， FACS)，在添加特定底物的条件下对表达库进行筛选，就能够得到对该底物具有代谢活性的克隆。

SIGEX在宏基因组研究中具有很多优势，它提供了一个有效的和经济的检测手段，大大增加了筛选的容量和效率，节省了时间，为高通量筛选提供了保障，而且不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需担心因修改底物而产生毒性；且可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能。而SIGEX法的不足之处是目标基因的结构性和适应性很敏感，同时，无法用于分析不能进入细胞质的底物，而且FACS对进样设备的要求也比较高；代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都相邻；同时有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他因子的诱导，而有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的，有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导表达。但是考虑到宏基因组文库中含有大量的基因，其中必然有一部分是可诱导的，是可以被该技术检测到的。所以只要对这些不足之处进行优化，选择合适的条件，SIGEX法仍然是一种宏基因组文库筛选的有效方法，尤其适合于在工业上使用[26]。

3.3.4 基于稳定性同位素技术筛选方法

具有相同原子序数但不同中子数目且不具放射性的元素称为稳定同位素(stable isotope probing， SIP)。环境中的许多物质都可以用SIP来标记，鉴定和分析复杂样本中进行有特殊代谢功能的微生物[27]。

3.3.5 荧光原位杂交技术

荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization， FISH)是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞。FISH技术已经用于不同生态系统的研究中，应用稳定同位素技术可以对环境中某些活性微生物的核酸进行富集，进而构建宏基因组文库，更有利于寻找未培养微生物的功能基因[28]。

3.3.6 其他筛选策略

常规的PCR、分子杂交、抗原抗体反应等技术也可以用于筛选，也有公司开发出了专门筛选某些酶、蛋白等的试剂盒，在食品工业、医药等领域有较好的应用前景。此外，在构建文库之前对样品有目的进行富集，然后提取样品DNA构建文库，这也可以提高目的克隆的数量。

当前宏基因组学技术中最大缺陷是文库的表达问题，模式微生物并不能把所有的宏基因组DNA表达出来，降低了表型筛选的效率。宏基因组表型筛选的效率很低，从上万个克隆中一般只能筛选到几个有用的克隆。这表明宏基因组学的提出虽然带来观念上极大的突破，但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论上可能带来的巨大成果。但有理由相信，随着分子生物学技术的发展，宏基因组学研究必然成为今后若干年自然科学研究的一个重要领域。

4 宏基因组学的应用

宏基因组学代表了一个研究自然环境样本中生物多样性的强大工具。从宏基因组文库中获得的信息可以大大地丰富有关工农业、医学以及环境生态等诸多领域的认识，并带来很多应用可能。宏基因组学研究在短短几年内，已渗透到包括农业、土壤、林业、海洋、人体医学、药物等各个领域，并在替代能源、环境修复、生物技术、生物防御、哲学及伦理学等各方面，显示了重要的价值[2931]。

4.1 宏基因组学在基础微生物学研究中的应用

4.1.1 发现新基因

由于自然界中大多数微生物物种及其生物量是未知的，其中存在大量不可培养的微生物，无法通过培养法进行研究，而宏基因组学的策略则突破了这一束缚。通过构建宏基因组文库，而且从中鉴定出的大多数基因将都是新的基因[3234]。即使是对一个相对较小的宏基因组文库进行筛选，所获得的序列与已公布的数据库中的序列的相似性也很低。如利用宏基因组文库，已发现的新基因主要有：生物催化剂基因、抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因等。

4.1.2 开发新的微生物活性物质

在地球各种环境中，多达99%的微生物因为不能培养而无法了解。有数据表明，其中蕴含着巨大的应用潜能——其代谢产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物。如何研究并开发利用这些不可培养微生物，成为重要而又急迫的任务。近年来，由于极高的重复发现率，利用纯培养技术从环境微生物中筛选到新活性物质的几率显著下降。宏基因组学则为新微生物活性物质的开发提供了新思路。目前通过采用土壤、海水、海洋浮游生物、海绵、甲虫、人唾液等环境样品，成功构建了宏基因组文库，筛选到多种新的活性物质如各种酶类及一些次生代谢产物等，将宏基因组文库筛选和基因改组等基因工程技术结合起来，在开发新的微生物活性物质方面具有巨大潜力[3537]。

4.1.3 研究微生物群落结构及其功能

宏基因组学为认识由可培养和不可培养微生物所构成的复杂生境及其功能提供了可能，且必将在研究生物多样性中发挥重要作用。运用宏基因组技术对海洋病毒已有较深入的研究，为探寻复杂微生物群落中的感应信号分子及其基因调节机制，探知微生物物种在群落中的功能打下基础[3840]。

4.2 宏基因组学在农业微生物研究中的应用

近年来发展起来的宏基因组学利用分子生物学的研究方法绕过培养方法来研究微生物的多样性及功能，为土壤微生物研究开辟了新的道路。土壤中多数微生物不可培养，这限制了微生物资源的开发利用。宏基因组学方法在开发和利用不可培养微生物资源方面有巨大潜力，可以将其运用到土壤微生物学研究中，也可以用于改造土壤、提供有机肥料和改进粮食品种等领域。随着微生物宏基因组研究的不断深入，宏基因组技术也在土壤、海水微生物等研究领域中成功应用[1，69]，预示着在不久的将来，宏基因组技术必将会在更广泛的关键领域取得重大突破。

4.3 宏基因组学在医学研究领域中的可能应用

人体和动物体内存在适合微生物生长的生境，例如肠道、皮肤表面、口腔等，同样可以利用宏基因组学方法来研究这些微生物群体，特别是其在某些疾病过程中发生的变化。2004年，美国国立卫生研究院专门设立“利用宏基因组学研究口腔微生物”的研究项目，证明国际学术界对宏基因组学方法的重视，也说明宏基因组学方法应用于某些医学研究领域的可行性。

到目前为止，宏基因组学在医学领域还处于起步阶段，但研究结果令人振奋。如 Breitbart等[41]利用宏基因组方法分析了人粪便中不可培养的病毒群体，发现该群体中包含1200个病毒基因型，对其序列分析表明大多数是之前没有报道的。Walter等[42]对小鼠大肠微生物群构建了宏基因组文库，并对表达β葡聚糖酶活性的克隆进行了筛选，发现2个克隆是来自不可培养微生物的。DiazTorres等[23]利用宏基因组学方法，对口腔细菌群体中耐药基因进行了分析，结果证明用宏基因组学方法进行耐药情况调查和研究是可行的。Gill等[43]建立了人肠道微生物群的宏基因组，并对其代谢特征进行了分析。研究发现，肠道菌群结构的改变与失衡除会导致肠道疾病外，还与很多慢性全身性的代谢性疾病，如糖尿病、肥胖，甚至是癌症的发生有着密切关系。Manichanh等[44]利用宏基因组方法对比研究了正常人和节段性回肠炎患者肠道微生物多样性，发现患者肠道微生物多样性大大降低，尤其是硬壁菌门的细菌种类大大减少。

人类基因组和肠道微生物基因组学研究业已显示了有力证据，人类基因组编码223种与细菌蛋白高度同源的蛋白，深入研究将揭示宿主与肠道微生物在进化过程中如何有机地结合在一起，形成现存互惠共生的复合体。

宏基因组学在医学研究领域中的应用具有很大潜力，以下方面的研究有望获得突破: 新感染性疾病的发现(例如临床存在很多不明原因的发热患者，其中可能有不可培养微生物感染的可能)；正常人及某些疾病患者的肠道生境中微生物群体多样性分析及与疾病的可能关系；不可培养微生物耐药情况及其机制分析，以及在耐药传播机制中的作用；特殊微生物群体致病机制研究(例如生物膜的研究)；从微生物生活环境中发现有医学应用价值的生物活性新物质等等。人类宏基因组研究起步较晚。应充分利用我国的特有优势参与国际竞争，加快人类宏基因组研究步伐，是一个十分迫切的问题。

宏基因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受，有关宏基因组学研究的文章逐年增多。宏基因组学研究将大大扩展我们对生命的了解，包括了解生命如何耐受极端环境、新的生物能源、生命进化以及微生物与环境之间的相互作用。宏基因组学为最大限度地挖掘微生物资源带来了前所未有的机遇，已经成为国际生命科学技术研究和开发最重要的热点和前沿。我国应尽快开展有关宏基因组学的研究，通过联合攻关，拓展研究领域，发展相关研究策略和技术，开展广泛的国际合作，使我国在宏基因组学研究领域中有所作为。

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微生物组学研究范文第3篇

【关键词】林业微生物学 理论教学

【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2015）10-0176-02

林业微生物学是微生物学的一门分支学科，着重研究微生物与土壤环境、森林病害及森林培育关系的一门科学，具有较强的理论性和实践性。为适应新形势下的教学要求，提高课堂教学效果，笔者在课堂理论教学方面进行思考，形成以下几点想法。

一、将微生物知识生动化、趣味化和可视化，切实提高学生的学习兴趣

微生物学知识点多，听起来枯燥乏味，且不易记忆。针对这一特点教师在教学过程中应采取多元化的教学手段，努力将枯燥乏味的微生物知识生动化、趣味化和可视化，使学生在复杂中有律可寻、在枯燥乏味的学习中获得乐趣。如：在讲绪论部分时，教师应像讲故事般地把微生物研究对象、特点、发展简史及其应用娓娓道来，从而将学生的思维引入新学科的大门，使他们对本学科产生较大的兴趣；再如，在讲病毒时，可运用形象生动的比喻讲解病毒的结构、化学组成及其繁殖特点，并播放相关视频详细介绍噬菌体在发酵工业中的危害及其防治方法。

二、老师走“下台”，学生走“上台”，提高学生的自主学习能力

为激发学生学习热情，提高学习效率，老师应引导学生化被动为主动，将老师的“喂饭吃”转变为学生自己“找食吃”，改变过去“学生围着教师转”的被动局面。在教学过程中，教师要“精讲”，重点突出，画龙点睛，重点讲解关键基础知识，课后教师通过布置任务，让他们统筹安排学习时间，根据学习要求围绕一些小知识点主动搜集资料进行自学并进行归纳、凝练和总结，然后走上台来给同学们讲解，有意识地让学生自己做“小老师”。对一些重点知识点，可在学生讲解完后，再召开小组讨论会，老师跟学生一起相互提问、共同交流。这样做学生的积极性很高。因此，教师要敢于大胆放手让学生独立学习，充分发挥他们的主观能动性。

三、强调理论联系实际

林业微生物是一门内容枯燥、复杂并且难以理解的学科，初学者往往都难学难懂难记。强调理论联系实际可加深学生对微生物知识的记忆。如：为了说明大部分陆生植物都能被菌根真菌侵染，可让同学们从校园中采集各种林木的根系，染色后在显微镜下镜检，观察菌根真菌的菌丝、丛枝、泡囊等结构；为了说明杨树溃疡病是由微生物引起的，可让学生采集发病杨树的病斑，从中分离病原微生物，然后再将分离的病菌接种于健康杨树，观察杨树的发病状况。此外，贯彻理论联系实际的原则可引导学生将微生物理论知识与学生已有的知识基础和生活经验实际、科学上的最新成就实际、前人从事科学研究的实际、学生的思想实际等相联系，使学生在学习过程中不断认识所学课程的重大价值，从而产生巨大的学习动力，使学生兴趣昂然地去学习微生物学。

四、将学科前沿知识贯穿于林业微生物教学过程

博士研究生是工作在科研一线的研究者，经过多年的研究训练，他们掌握着各自研究领域的最新研究方法与进展。据此，在林业微生物教学过程中，教师邀请了与林业微生物相关的博士研究生深入课堂，给同学们做专题报告。博士研究生们就“菌根与植物抗逆性的关系”、“食源性致病菌特性与检测”和“根瘤菌在逆境生态修复中的作用”等专题从不同角度深入浅出地向同学们讲解了微生物学的最新研究方法与成果，并就各自的研究内容与同学们进行了深入交流。专题报告结束后，同学们“现学现用”，自行分组，各小组根据自己的兴趣点收集不同微生物的特点、研究方法及其应用等方面的文献和资料，进行演讲比赛，比赛中再邀请博士研究生担任评委，就同学们PPT制作、资料查询、文献总结等方面进行点评和评比，并对表现优异的小组予以适当的奖励。通过开展“邀请博士研究生进课堂，学生“当家作主””专题活动，一方面让同学们掌握了一些微生物学领域的研究前沿，让他们变被动学习为主动学习，学习如何收集资料并进行总结、凝练和展示，另一方面让博士研究生的“光环”在一定程度上激起本科生对微生物学的学习热情，为切实提高教学效果发挥了一定的作用。

总之，林业微生物课程教学改革对提高教学效果起到了一定的作用。此外，今后还应进一步强化理论与实验并重，建立以学生为主体的教学方式，促进学生自主性学习和个性发展，完善知识背景和提升创新能力，注重学生独立解决问题能力和综合素质的培养。

参考文献：

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微生物组学研究范文第4篇

重庆市黔江区城南街道社区卫生服务中心　重庆市　409000

【摘　要】目的：分析评价宫颈微波手术联合药物治疗宫颈糜烂的效果。方法：随机选取我社区卫生服务中心收治的2012年3 月到2014 年3 月患者80 例宫颈糜烂，并且将这些宫颈糜烂患者可以依据随机分配方法将患者分两组，即研究组（40 例）和对照组（40 例）。给予对照组患者治疗中，采取常规药物治疗，给予研究组患者宫颈微波手术治疗的同时，联合药物进行治疗，对两组患者临床效果进行分析评价。结果：研究组患者经治疗后，总治愈率高于对照组，其患者临床得到明显改善，显著高于对照组（P<0.05）。结论：在临床宫颈糜烂治疗中，应用宫颈微波手术联合药物治疗，安全有效，可以提高患者在临床治疗效果，提高宫颈糜烂治愈率。

关键词 联合药物治疗；宫颈微波手术；宫颈糜烂；效果

相关医学文献报道，宫颈糜烂作为妇女常见病、多发病，给患者带来严重影响，临床常用药物治疗、物理治疗以及手术治疗等手段，效果均不满足患者需求[1]。本研究对近两年来我社区卫生服务中心收治的80 例患者的临床资料进行了统计分析，分析评价宫颈微波手术联合药物治疗宫颈糜烂的效果，现报告具体内容如下。

1 资料与方法

1.1 资料

随机选取我社区卫生服务中心在2012年3 月至2014 年3 月收治80 例患者，所有患者均经临床检查证实宫颈糜烂，均符合临床相关诊断标准[2]，均知情同意，将接受治疗。依据随机数字表法将这些患者分为两组，即研究组（40 例）和对照组（40例）。研究组患者中年龄在20-45 岁之间，平均年龄为（26.5±0.3）岁，单纯型宫颈糜烂患者16 例，颗粒型宫颈糜烂患者12 例，乳突型宫颈糜烂患者12 例；对照组患者年龄在20-45 岁之间，平均年龄为（26.7±0.2）岁，单纯型宫颈糜烂患者15 例，颗粒型宫颈糜烂患者13 例，乳突型宫颈糜烂患者12 例；两组患者在年龄、病变部位等方面，进行比较不具备差异（P>0.05），两组具有可比性。

1.2 方法

给对照组患者治疗中，应用常规药物治疗，采取纳米银抗菌凝胶（生产企业：深圳爱杰特医药科技有限公司；批准文号：粤食药管械（准）字2005 第2640025 号），可以用温水清洁患处，并在患者阴道放药，治疗中每日1 次，以6d 为1 个治疗疗程，共治疗2 个疗程。研究组患者临床治疗中，在给予患者进行常规对照组药物治疗的基础上，行微波治疗，可以选在患者月经干净后进行微波治疗，治疗中，可以取患者的膀胱截石位，并对患者宫颈进行常规的消毒，然后应用微波以2~3mm/s 速度，缓慢扫描宫颈表面，直至患者糜烂面均匀呈现出黄白色，停止治疗。最后，分析评价2 组患者临床治疗效果。

1.3 观察指标

对2 组患者的病情变化等进行认真细致的观察和比较，治愈：患者的宫颈直径缩小到2.5cm，宫颈糜烂面也完全愈合，宫颈创面也完全上皮化，且柔软光滑，不出现自觉症状；有效：宫颈直径缩小到2.5~3.0cm，患者宫颈糜烂面积缩小到原来的2/3 以上，宫颈糜烂程度变浅，宫颈糜烂患者自觉症状改善；无效：宫颈糜烂局部无改善，症状未减轻。

1.4 统计学处理

对本研究中所有数据进行统计学处理的过程中运用统计学软件spss20.0，分别用率和（ ）表示计数资料，然后用X2检验组间，P<0.05 表示具有统计学差异。

2 结果

2.1 两组患者的治疗效果评价

研究组患者治疗后， 总治愈率达到92.5%，对照组总治愈率75.0%。研究组治疗效果显著高于对照组（P<0.05）。见表1。

结果，在临床宫颈糜烂患者治疗中，对患者应用宫颈微波手术联合药物治疗，提高患者治愈率，提高治疗效果，有极大的治疗优势，值得在实际中推广应用。

3 讨论

宫颈糜烂，多由不良性生活流产、感染、手术操作不当等因素引起，宫颈糜烂会引起患者子宫颈管载膜柱状上皮增生, 在宫颈外口呈鲜红糜烂区域。以上研究证实，研究组经治疗后，临床宫颈糜烂总治愈率达到92.5%，较研究组总治愈率75.0% 有显著差异（P<0.05）， 在临床治疗中发挥重要治疗效果。

临床治疗中，应用宫颈微波手术联合药物方法进行治疗，可以使药物直接作用于宫颈病变的组织，从而促进子宫颈管载膜柱状上皮再生，促使宫颈病变组织愈合，提高宫颈糜烂总治愈率，临床治疗效果显著。根据刘宏[3] 医生在探讨微波联合药物治疗宫颈糜烂的临床疗效中，得出微波联合药物治疗宫颈糜烂有很好的疗效。

本研究结果充分证实宫颈微波手术联合药物治疗宫颈糜烂，能够显著改善宫颈糜烂患者症状，安全有效，其临床效果好于单一应用药物治疗效果，值得在实际中推广。

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微生物组学研究范文第5篇

摘要:

微乳是一种新型的药物载体，具有热力学稳定性，能够提高药物溶解度和生物利用度等优点，具有优良的透皮特性，是目前透皮制剂研究的热点。本文主要从微乳的形成机理、促渗机制、组成成分的选择、制备方法及研究应用几个方面进行了综述。

关键词:

微乳;促渗;透皮吸收

现阶段对于经皮给药制剂研究存在最大挑战是药物有效成分或活性成分较难穿过皮肤角质层进入真皮，其次是药物溶解度和生物膜透过性差等。这些挑战限制了很多药物的研究开发，这无疑向药物制剂新剂型与新技术提出了挑战。目前，经皮给药研究手段主要有药物经离子导入、电致孔、超声波等，还有将药物研制成微乳制剂、脂质体等新剂型给药者。微乳是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂按适当比例自发形成的一种透明或半透明的、低黏度、各相同性且热力学稳定的溶液体系。从结构上可分为油/水(O/W)型、水/油(W/O)型及双连续型［1］。作为新型透皮给药载体具有以下特点:(1)增加难溶性药物的溶解性、稳定性及透皮量［2］;(2)可避免某些药物胃肠道和肝脏首过效应，长效缓释微乳还可以克服多次给药带来的血药浓度的峰谷现象等优势［3］;(3)经皮给药可使局部药物浓度增加，起到靶向给药的目的。

1微乳的形成机理

关于微乳形成机理的理论有多种，主要可归纳以下3种［4］。第1种是混合膜理论，以Schulman和Prince为代表，认为界面张力在微乳形成过程中起着重要作用，微乳中油水两相分布在表面活性剂和非表面活性剂构成的界面膜的两侧，形成油膜、水膜，故称作双层膜。微乳为热力学稳定体系，当暂时界面张力γ＜0时，微乳自发形成;γ逐渐上升至γ=0时，微乳形成。该理论微乳形成过程中存在负的界面张力难以预测的局限性。第2种是增溶理论，以Shinoda等为代表，认为存在高浓度的表面活性剂时，大量的胶束对油相或水相产生增溶作用。油相和水相进入胶束内部，胶束发生“肿胀”，认为胶束是特殊条件下溶胀的胶束。胶束是热力学稳定体系，故微乳也是热力学稳定体系。增溶理论不能解释为何只要表面活性剂的浓度大于临界胶团浓度就可产生增溶作用。第3种是热力学理论，用热力学的方法算出形成微乳的自由能及其相转变的条件来研究微乳的形成。热力学理论是不能真正意义上的指导微乳的形成。

2微乳的促渗机制

微乳由多相组成，所以其透皮机制可能与多方面有关，即与各组成成分密切相关。已有报道［5］微乳通过以下几种机制促进药物的透皮吸收:增溶及提高渗透浓度梯度;增加角质层脂质双层流动性;破坏角质层水性通道，微乳完整结构经毛囊透皮吸收;药物从微乳中析出后透皮吸收。

3微乳组成成分的选择

选择微乳作为经皮给药载体，一般会用到大量的油相和表面活性剂，由于用量过大会带来一定的毒性和对皮肤有一定的刺激性，从而限制了微乳在经皮给药系统中的应用。对微乳处方进行筛选应从以下几方面进行:(1)应首选无毒、无刺激性、无不良药理反应、良好的生物相容性等特点的组分。(2)微乳的处方组成直接关系到微乳的透皮能力大小。现阶段对透皮能力差异的考察主要以药物体外透皮过程中的透皮量作为评价指标，一般选择透皮能力强的处方组成。Kweon等［6］研究表面活性剂/助表面活性剂的比值(Km)按不同Km值制备酮洛芬微乳，结果发现，Km为1﹕2时制备的微乳透皮性最高。(3)可根据伪三元相图微乳形成面积的大小对处方进行筛选。以下是对微乳处方组成的简要说明。

3.1油相

在微乳制备中油相要求有安全、稳定，可与多成分在不同温度下形成乳剂，选用较少的用量溶解处方量的药物，油相影响溶解度，决定微乳。常用的油相有植物油类(如大豆油、橄榄油等)、甘油三酯类、肉豆蔻酸异丙酯(IPM)、脂肪酸类［7］。醇类在微乳中不太常作为油相使用，而可以作为油相的醇类有辛醇和癸醇［8－11］。

3.2表面活性剂

表面活性剂在微乳中的比例占到了20%～30%［12］，主要是降低界面张力形成界面膜，促使微乳形成。分为非离子、两性离子、阳离子或阴离子表面活性剂，非离子型表面活性剂能与大多数药物配伍，应用最广。常用的非离子型表面活性剂有聚氧乙烯类、聚乙二醇甘油脂、吐温类、司盘类及天然的卵磷脂等［13，14］。

3.3助表面活性剂

在微乳形成机理的研究中，助表面活性剂的作用主要是插入界面膜的乳化剂分子间，从而降低界面膜的刚性，辅助乳化剂降低油水界面张力，形成暂时的负界面张力，增加界面膜的流动性。一般常用的助表面活性剂是中等链长或短链的醇类，如:乙二醇、丙二醇、乙醇、甘油、正丁醇等［15，16］。研究发现，在接触时间足够短的情况下，使用乙醇作为透皮给药的助表面活性剂是相对安全的［17］。

4微乳的制备与系统评价

4.1微乳制备

现阶段微乳制备通常有三种制备方法，即盐度扫描法、相变温度法和HLB(hydrophilelipophileblance)值法。在药剂学中应用较多的是单向微乳即O/W型或W/O型微乳，从而盐度扫描法和相变温度法的应用受到了限制，制备微乳首选HLB值法。在制备微乳时，首先根据制备微乳的类型及油相的性质选择合适的乳化剂和助乳化剂。表面活性剂的HLB值是微乳制备的重要参考标准，一般以HLB值在3～6易形成W/O型微乳，在8～18易形成O/W型微乳。其次是选择合适的助表面活性剂，其作用是通过与乳化剂形成复合界面膜，降低表面张力，调节表面活性剂的HLB值［18］。

4.2微乳的系统评价

目前对于微乳透皮给药制剂的评价包括制剂外观、浊度、相图、粒径分布、Zeta电位、体外释放及透皮速率、体内药动学及生物等效性等。一些新的方法也在微乳的性质测定中有很重要的应用［19］。王霄［20］对雷公藤多苷微乳质量进行评价:利用动态光散射粒径测定仪测定微乳的平均粒径为(22.5±1.2)nm;通过透射电镜对微乳的显微结构进行镜检可看到:微乳颗粒均匀且圆润;平板旋转流变仪考察微乳黏度为(220±0.19)mPas，具有良好的流动性;采用TK－20B型透皮扩散试验仪体外透皮24h累积透皮量(35±0.93)mg.mL－1，明显高于空白组。现阶段对于微乳质量的研究不应局限于粒径、外观成型、体外释放等方面，药物最终要进入体内产生疗效，在考察微乳透皮质量评价还应结合药效学综合评价。

5药物研究

应用实例微乳作为一种新型给药载体在很多方面有其优势，越来越多的研究者也开始对中药有效组分的微乳透皮制剂、口服制剂、注射剂进行了研究，且都显示出了微乳独特的优势。现阶段微乳经皮给药的研究应用比较广泛，技术也相对较成熟，一些微乳给药制剂研究应用实例见表1。由表1可知微乳可减少口服给药对胃肠道的刺激，避免肝脏的首过作用和胃肠道的降解，可增加其靶向性，对一些难溶性、稳定性差、亲脂性化合物以及一些中药提取物均具有良好的溶解能力，透皮速率较其他制剂高，并且还能使药物大剂量长时间释放、对于一些毒性中药的应用起到增效减毒的作用。

6展望

现阶段药物的开发研究大多都处于一个滞留阶段，特别是传统中药，因多数活性成分极性较小，难溶于水，生物膜透过性差，易氧化分解而不稳定，靶向性差，导致疗效差、副作用明显。微乳作为一种新的透皮给药载体为这类药物研究应用提供了可能，将药物制成微乳制剂经皮给药，可较理想地透过角质层，起到全身或局部的治疗作用，克服了肝的首过效应和胃肠的消除与分解;同时对于一些有药用价值的毒性中药，其有效治疗剂量与中毒量非常接近，将其制成微乳经皮给药可以起到增效减毒的作用。但微乳经皮给药制剂也有其局限性:微乳属于液体制剂，黏度小，无法定量给药。研究者为了克服这些问题，多将其制成微乳凝胶，但对于以微乳凝胶透皮的可行性还需进一步考察。

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