蛋白酶抑制剂范文第1篇

【关键词】 蛋白酶体抑制剂；PC12细胞；帕金森病；细胞凋亡

【Abstract】 AIM: To investigate the effect of proteasome inhibitor MG132 on the proliferation and apoptosis of dopaminergic PC12 cells. METHODS: PC12 cells were treated with MG132 at different concentrations for 3 d. The effect of MG132 on the proliferation of PC12 cells was analyzed through MTT assay and the effect of MG132 on the apoptosis of PC12 cells was analyzed through Giemsa staining and flow cytometry. RESULTS: Treated for a same period （3 d）， the inhibitory effect of MG132 on PC12 cell proliferation enhanced with the increment of the concentration of MG132（0， 1， 2.5， 5， 10， 20 μmol/L）. The inhibitory rate exceeded 40% when the MG132 concentration was 2.5 μmol/L， and the 50% inhibiting concentration （IC50）was 3.78 μmol/L. MG132 also induced the apoptosis of PC12 cells obviously. The apoptosis index of the cells treated by MG132 at 2.5 μmol/L for 3 d was 24.7% examined by Giemsa staining and 25.6% by flow cytometry， that of the control cells was 1.3% and 0% respectively. CONCLUSION: MG132 can inhibit the proliferation of dopaminergic PC12 cells and lead to apoptosis. The disfunction of proteasome may do harm to the existence of dopaminergic cells.

【Keywords】 proteasome inhibitor; PC12 cells; Parkinson disease; apoptosis

【摘要】 目的： 了解蛋白酶体抑制剂MG132对多巴胺能细胞PC12增殖和凋亡的影响. 方法： 用不同浓度的MG132处理PC12细胞3 d，通过3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴盐（MTT）微量比色法检测MG132对PC12细胞增殖的影响，通过姬姆萨染色法和流式细胞术检测MG132对PC12细胞凋亡的影响. 结果： 在作用时间相同（3 d）的条件下，随着MG132浓度的增高（0， 1， 2.5， 5， 10， 20 μmol/L），对PC12细胞增殖的抑制作用逐渐增强. 当MG132浓度达到2.5 μmol/L时，对PC12细胞的抑制率超过40%， IC50＝3.78 μmol/L. 同时，MG132能够明显诱导PC12细胞凋亡： 姬姆萨染色显示，浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d，细胞凋亡率为24.7%，而对照为1.3%；流式细胞术分析结果表明，浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d，细胞凋亡率为25.6%，而对照为0%. 结论： 蛋白酶体抑制剂MG132能够抑制多巴胺能细胞PC12的增殖并诱导细胞凋亡，蛋白酶体活性的丧失可能影响到多巴胺能细胞的生存.

【关键词】 蛋白酶体抑制剂；PC12细胞；帕金森病；细胞凋亡

0引言

帕金森病（parkinsons disease， PD）是最常见的神经系统退行性疾病之一，严重危害患者身体健康和降低患者的生活质量［1-2］. PD的病因和发病机制至今不够明确. 越来越多的证据表明，多巴胺能神经元内蛋白质的损伤和功能异常蛋白的蓄积在散发性PD的发病过程中起着重要的作用［3］. 蛋白酶体是一种多价复合酶，分布于细胞质与细胞核内，是哺乳动物细胞中主要的中性蛋白水解酶，在泛素蛋白酶体通路（ubiquitinproteasome pathway， UPS）中起催化作用［4-5］. 本研究以多巴胺能细胞PC12为研究对象，观察蛋白酶体抑制剂MG132对PC12细胞的增殖和凋亡的影响，以探讨蛋白酶体活性异常在PD发病过程中的作用，为阐明PD的发病机理提供新的实验依据.

1材料和方法

1.1材料高分化型PC12细胞购于中国科学院上海细胞所；新生牛血清（奥地利PAA公司）；DMEM培养基干粉（美国Gibco公司）；MTT、MG132（美国Sigma公司）；6 孔培养板（丹麦NUNC公司）；NU2500E型CO2 孵箱（英国Forma Scientif公司）；酶联免疫检测仪（江苏国营华东电子管厂）.

1.2方法

1.2.1PC12细胞的培养与传代细胞在加入100 mL/L小牛血清，100 U/mL青霉素的DMEM培养液中，37℃， 50 mL/L CO2常规培养. 待细胞长满至培养瓶底面积80%之后传代.

1.2.2细胞毒性试验（MTT法）取对数生长期的细胞，接种于96孔板中. 第2日换含有MG132 0， 1， 2.5， 5， 10和20 μmol/L的培养液，继续培养3 d，加入MTT（5 g/L， 20 μL/孔），继续培养4 h，终止培养，小心吸弃培养孔内上清液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），振荡摇匀，使MTT产生的蓝色结晶充分溶解，在酶标仪上以波长490 nm测定各孔A值. 细胞增殖抑制率按照下式进行计算（对照组为0剂量组，实验组为不同浓度MG132作用组）： IR（%）=（A对照组-A实验组）/A对照组×100.

1.2.3姬姆萨染色法观察取对数生长期的细胞，常规爬片. 24 h以后，分别以正常培养液和加入MG132 2.5 μmol/L的培养液继续培养3 d，然后进行Giemsa染色. 染色方法： 0.01 mol/L PBS清洗玻片3～5次；利用卡诺固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）固定20 min；用新配制的Giemsa染色液染色20 min；自来水流水冲洗，二甲苯透明，光镜下观察染色效果，并拍照. 结果判断： 发生凋亡的细胞以及凋亡小体呈紫蓝色深染，容易在光镜下辨认. 每张盖玻片选择3个视野，每个视野计算100个细胞中阳性细胞数，计算阳性细胞数所占的百分比作为凋亡细胞的阳性指数.

1.2.4流式细胞术检测将对照组和实验组（2.5 μmol/L处理3 d）的细胞分别制成单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤2次；700 mL/L的乙醇4℃固定30 min. 流式细胞术测定细胞DNA含量，进行细胞周期分析和凋亡率的比较.

统计学处理： SPSS11.0统计软件进行统计分析. MTT实验结果用x±s表示，假设检验用方差分析，各实验组与对照组之间的比较使用Dunnettt检验；姬姆萨染色法的实验结果用u检验，以P

2结果

2.1MTT实验结果显示，不同浓度的MG132作用于细胞3 d后，在1～20 μmol/L浓度范围内，MG132对PC12细胞呈浓度依赖性的增殖抑制作用（IC50＝3.78 μmol/L）. 作用第3日， 2.5 μmol/L和5 μmol/L MG132对细胞的抑制率分别为43.47%和66.67%（表1）.表1不同浓度的MG132对PC12细胞增殖的抑制作用

2.2姬姆萨染色法检测细胞凋亡浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d后，镜下观察，含有MG132的实验组细胞总数明显低于对照组. 对照组基本上难以看到凋亡细胞，而MG132实验组随处可见紫蓝色深染的凋亡细胞（图1）. 通过计算，对照组细胞凋亡率为1.3%，MG132实验组细胞凋亡率为24.7%. MG132实验组细胞凋亡率显著高于对照组（P

2.3流式细胞仪检测结果显示，2.5 μmol/L蛋白酶体抑制剂MG132作用于PC12细胞3 d后，与对照组相比，S期细胞所占比例有所下降，从28.7%下降到24.6%. 对照组未见凋亡峰，而加入MG132的实验组有典型的亚二倍体凋亡峰，凋亡率为25.6%（图2）.

3讨论

在临床上，PD主要病理改变为黑质、纹状体多巴胺能神经元的进行性变性、死亡，导致纹状体内多巴胺浓度的明显下降［6］. 由此可见，多巴胺能神经元的增殖和凋亡的变化在PD的发病中起重要作用. PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，高分化型的PC12细胞在形态、生理、生化功能方面接近于中脑多巴胺神经元，因此在国内外常作为多巴胺神经元的细胞模型［3］. 近期的研究表明，多巴胺能神经元内异常蛋白的蓄积是PD发病的机理之一，传统的研究着重于这些异常蛋白的形成过程，很少关注其代谢和降解途径.

蛋白酶体是一种多价复合酶，分布于细胞质与细胞核内，是哺乳动物细胞中主要的中性蛋白水解酶，在UPS中起催化作用. UPS是蛋白质选择性降解的主要方式，可以清除真核细胞中突变、损伤和异常折叠的蛋白质，维持细胞内环境的稳定，在维持细胞正常功能方面发挥着重要作用［7-8］. MG132是蛋白酶体抑制剂，可以抑制UPS中起主要催化作用的蛋白酶体的催化活性，从而阻断了UPS对异常蛋白的降解. 在PD的研究过程中，人们已经发现，αsynuclein， Parkin和UCHL1等基因的突变可能与一些家族性PD的发生有关. 而这三种基因都与UPS的功能有关［9］.

本研究结果显示，一定浓度的蛋白酶体抑制剂MG132对PC12细胞的增殖有明显的抑制作用. 在引起细胞增殖抑制的同时，MG132还诱导细胞凋亡. 姬姆萨染色和流式细胞术结果均显示，浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d后，可明显诱导PC12细胞的凋亡. 通过抑制蛋白酶体的活性，直接导致了PC12细胞增殖的抑制以及凋亡率的增高. 这表明，作为维持细胞内稳态的重要物质，蛋白酶体的功能是否正常至关重要，蛋白酶体活性的改变能够对PC12细胞的生存产生重要的影响，正常的蛋白酶体活性对维持神经系统的正常功能有着重要的意义. 本实验结果再次证明，多巴胺能神经元内异常蛋白的蓄积在PD的发病过程中起着不可忽视的作用，保持多巴胺能神经元内异常蛋白的降解系统UPS功能的正常，可以为PD的预防提供一个新的思路.

参考文献

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［7］ Hershko A. The ubiquitin system for protein degradation and some of its roles in the control of the cell pision cycle ［J］. Cell Death Differ， 2005，12（9）:1191-1197.

蛋白酶抑制剂范文第2篇

 

关键词：  胰蛋白酶抑制剂； 鱼腥草； 分离纯化

   

胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor ,TI)除了在临床上用来治疗急性胰腺炎、肺气肿、脑水肿和脑缺血外，目前还发现它在HIV和肿瘤的治疗中也有重要意义［1］。化学合成的TI生物利用度低、副作用大以及产生耐药性等缺点，植物来源的TI具有兼容性好、安全和特殊的药物特性等优点。因此，从传统中药中筛选具有TI有活性的材料有很广阔的应用前景和市场价值。

鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb的地上部分，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋之功效，是临床应用极其广泛的中药之一。本文在前期研究的基础上，对鱼腥草中TI进行了分离纯化，获得的结果对开发植物来源的TI具有重要意义。

1  材料与仪器

1.1   试剂胰蛋白酶(北京麒麟宏伟公司) ，苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(上海三杰生物技术有限公司)，DEAE-纤维素(Sigma)，三-羟甲基-氨基甲烷，无水氯化钙，盐酸，三氯乙酸，氢氧化钠等为国产分析纯。

1.2  仪器可见光分光光度计，高速冰冻离心机，精密pH 计，数显恒温水浴锅，精密电子天平，蛋白质电泳仪等。

2  方法

2.1  鱼腥草胰蛋白酶抑制剂抑制率的测定参考杜旭东等［2，3］的苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPNA)法。

2.2  鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化参考康庄等［4］的方法进行。

3  结果

3.1  硫酸铵分级沉淀按照硫酸铵沉淀表，对样品浸提液添加硫酸铵至30％，45％，60％，75％饱和浓度，分别测定各浓度下的体积、抑制活性和蛋白浓度。pH值为6.0的样品浸提液实验结果见表1，pH值为8.0的样品浸提液实验结果见表2。表1  pH 6.0条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果（略）表2  pH 8.0条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果（略）

    

从图1可以看出，两种不同pH体系活性析出均集中于30％～75％饱和度，但45％～60％饱和度下比活力最高，且pH 8.0体系时比活力大。因此，在以后的纯化过程中，均采用pH 8.0溶液体系对样品液进行硫酸铵分级沉淀，加(NH4)2SO4至40％饱和度，以除去碱性或中性杂蛋白。再加(NH4)2SO4至60％饱和度，收集沉淀，溶解透析供下步离子交换层析用。抑制剂的析出在pH 6.0体系比pH 8.0体系要早，这说明抑制剂可能是一种酸性蛋白。

3.2  DEAE-52离子交换分离纯化取pH 8.0 Tris-HCl缓冲液透析后的粗提液5 ml，上DEAE-52离子交换柱(ф 2.5 cm×15 cm),流速为0.75 ml/min，以50 ml缓冲液洗脱,使样品液压实，再分别用由缓冲液配制的60～400 mmol NaCl溶液进行梯度洗脱，所得各管洗脱液(每管收集3 ml)在紫外光280 nm下测其吸光度，检测蛋白含量，其梯度洗脱曲线见图2。

由图3可知, 在55～70号试管具有HCTI活性，以60～63号活性最高。收集60号试管及附近活性较高的试管保存，进一步处理后进行HCTI相对分子量的测定。洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系见表3。表3  洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系（略）

3.3  鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的相对分子量的测定

DEAE-52离子交换柱分离纯化后HCTI液的活性峰经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果如图4。

由电泳图谱上测定的标准蛋白相对迁移率及其分子量，待测蛋白的迁移率为0.530。经计算机处理数据后，得回归方程：LogY=－1.355X+5.165 3 如图5所示，将待测的蛋白相对迁移率带入方程，计算出HCTI的分子量约为28 kDa。

4  讨论

   

本实验在粗提过程中采用分级盐析法除掉了部分杂蛋白，分离过程中用到了DEAE-52离子交换层析法，并检测到活性峰。说明分级盐析发挥了一定作用，从而简化了分离纯化过程，测得HCTI分子量约为28 kDa。为该胰蛋白酶抑制剂的进一步深入研究奠定了一定的理论基础。

【参考文献】

 

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蛋白酶抑制剂范文第3篇

【摘要】 目的研究大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治疗效果。方法以市售大豆为材料，经酸浸、脱脂、硫酸铵沉淀、透析除盐、葡聚糖凝胶G-75柱纯化等方法进行大豆胰蛋白酶抑制剂的分离提纯。然后，用大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃给药。通过比较正常对照组、实验对照组、大豆抑蛋白酶抑制剂高中低剂量组的多项血液指标（血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇）及各组小鼠病理切片等，研究大豆胰蛋白酶抑制剂的降糖活性。结果给予大豆胰蛋白酶抑制剂灌胃的糖尿病小鼠其血糖水平明显下降，甘油三酯水平下降，总胆固醇水平和高密度脂蛋白胆固醇水平无明显变化。结论大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对糖尿病有较显著的疗效。

【关键词】 大豆 胰蛋白酶抑制剂 分离提纯 糖尿病 小鼠胰蛋白酶

抑制剂（soybean trypsin inhibitor，SBTI）是一类可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽，普遍存在于植物的储藏器官，如种子、块根和块茎中［1］。大豆胰蛋白酶抑制剂已在多种医药领域有所应用［2，3］，另有报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调可能有一定效果［4］，但未见SBTI对糖尿病治疗效果的专项研究，本文就大豆胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治疗作用进行研究和探索。

1 材料与仪器

1.1 试剂与药品市售大豆，牛胰蛋白酶(1∶250，上海维编科贸有限公司），BAPNA·HCl(Na-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐，上海维编科贸有限公司)，Tris(三羟甲基氨基甲烷，成都化学试剂厂生产)，Sephadex G-75（葡萄糖凝胶G-75，上海化学试剂厂生产），Alloxan（四氧嘧啶，sigma公司），葡萄糖试剂盒-GLU(氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试剂有限公司)，高密度脂蛋白胆固醇试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），甘油三酯试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），总胆固醇试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），肝素钠（江苏万邦生化医药股份有限公司），硫酸铵，正己烷，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，36%乙酸等均为国产分析纯。

1.2 仪器DS-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂），DF206电热鼓风干燥机（北京医疗设备二厂），FA1004电子天平（科大创新股份有限公司中佳分公司），KDC-1042低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），722分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），AE240电子天平（METTLER公司）。

2 方法与结果

2.1 胰蛋白酶抑制剂的分离纯化

2.1.1 大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）粗提物的制备用酸抽提法所得粗品蛋白和抑制剂总量高［1］，故本实验采用酸性水溶液浸泡大豆粉末提取大豆胰蛋白酶抑制剂［5，6］。

2.1.2 大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物的透析除盐将抑制剂粗制备物置于透析袋中蒸馏水充分透析7 d，除去盐分。

2.1.3 凝胶柱的制备及抑制剂粗提物的纯化［5，7］参考文献［5，7］中方法，吸出存留缓冲液，加入1 ml样品，用缓冲液进行洗脱，控制流速在2 ml·h-1。流出10 ml后，用干净的试管分部收集，检测每管抑制剂的活性。

2.1.4 大豆胰蛋白酶抑制剂的活性测定［5，7］参考文献［7］中方法，以BAPNA为底物测定胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的活性。计算其抑制百分率［5］。收集具有抑制活性的洗脱液（即大豆胰蛋白酶抑制剂的提取物）。

2.2 大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对小鼠血糖、甘油三酯、总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平的影响

2.2.1 实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型的建立随机选取10只小鼠作为正常对照组(Control)。除正常对照组外，其它小鼠禁食12 h后，腹腔注射四氧嘧啶250 mg·kg-1。72 h后尾尖取血，用葡萄糖氧化酶法测定注射四氧嘧啶小鼠的血糖，以血糖值大于11.1 mmol·L-1［8］的小鼠作为四氧嘧啶糖尿病模型小鼠。将糖尿病模型小鼠随机分为实验对照组(Alloxan) 、大豆胰蛋白酶抑制剂低剂量组(Alloxan+ SBTIL) 、大豆胰蛋白酶抑制剂中剂量组(Alloxan +SBTIM) 和大豆胰蛋白酶抑制剂高剂量组(Alloxan+SBTIH)。

2.2.2 分组给药及测定方法Alloxan+SBTIL组、Alloxan+SBTIM组和Alloxan+ SBTIH组的定时给药剂量分别为每只每天0.1，0.3 ml和0.5 ml。但为了消除不同给药剂量对实验结果的影响，需将Alloxan+SBTIL组和Alloxan+SBTIM组的药液用蒸馏水稀释，使得稀释后药液的给药量为每只每天0.5 ml。Control组和Alloxan组给予等容量生理盐水（0.5 ml）。连续7 d经口灌胃给药。末次给药后次日分别测定各组小鼠的血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇4项血液指标（均采用试剂盒法，其具体操作过程见试剂盒内说明书）。完成测定后，处死小鼠，取肾脏和肝脏制作病理切片。

2.2.3 大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病模型小鼠血糖水平的影响结果见表1。表1 对糖尿病模型小鼠血糖水平的影响由表1可见，造模72 h后，四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠的血糖水平均显著高于正常对照组（P＜0.01），并且糖尿病模型小鼠状态较为萎靡，表明糖尿病模型制造成功。对照实验后的各给药组和糖尿病模型小鼠的血糖水平可见大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病的降糖作用：由Alloxan组、Alloxan+SBTIL组、Alloxan+SBTIM组到Alloxan+ SBTIH组小鼠的血糖水平有逐渐降低的趋势，即血糖降低程度与给药剂量正相关。其中Alloxan+SBTIM组、Alloxan+SBTIH组与Alloxan组相比有明显降低（P＜0.01），尤以Alloxan+SBTIH组更为明显。结果表明，大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病小鼠的血糖有较明显的降低作用。

2.2.4 SBTI对糖尿病模型小鼠TG，CHO和HDL-C的影响结果见表2。表2 SBTI对糖尿病模型小鼠TG，CHO和HDL-C指标的影响与Control组比较，aP＜0.01，cP＜0.05；与Alloxan组比较，bP＜0.01

本实验中，SBTI给药组的血清甘油三酯水平有所降低，其中大豆胰蛋白酶抑制剂高、中剂量给药组小鼠的甘油三酯水平与四氧嘧啶糖尿病模型组之间存在统计学差异（P＜0.01），可认为给药组小鼠血清甘油三酯水平明显降低。另一方面，SBTI对总胆固醇有一定的降低作用，对高密度脂蛋白胆固醇有一定的升高作用，但其差异不存在统计学差异（P＞0.05），即影响不显著。该实验结果在一定程度上补充说明了SBTI对糖尿病具有较好疗效。

2.2.5 SBTI对糖尿病模型小鼠肾脏和肝脏细胞的病理切片显微镜观察结果比较观察图1～3，Control组小鼠肾脏细胞的组织切片中可见，其细胞形态为饱满，结构清晰，与周围细胞的界限较明显，细胞排列相对整齐；肾小球形态正常；近曲小管、远曲小管形状较规则，均匀排列。Alloxan组切片的细胞形态萎缩变形，轮廓不饱满，界限不清晰，细胞排列紊乱；肾小球固缩较明显，肾小球囊壁增厚；肾小管萎缩；间质组织细胞增生明显，有炎细胞浸润。Alloxan+SBTIH组细胞形态、界限、排列状况均较高血糖对照组有改善；肾小球固缩程度减轻；肾小管的形态、排列状况及间质增生情况也有改善。肾组织切片显示，大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病模型小鼠的肾组织有一定的保护作用。

比较观察图4～6，Control组小鼠肝脏切片中可见，肝小叶结构完整，形态饱满，界限清晰；肝板排列规则整齐，且较为紧密。Alloxan组切片肝脏细胞体积变小；胞质嗜酸性增强，细胞核染色较深；肝板排列较为疏松，且不整齐。高剂量给药组小鼠的肝小叶结构明显，肝板细胞体积增大，排列较整齐、规则。

3 讨论

血糖是糖尿病的主要表征，临床上以血糖值作为糖尿病的主要诊断依据。因此，血糖水平的降低程度可直接反映糖尿病的治疗效果。通过分析各组小鼠血糖水平的实验数据可得出，大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病具有较好的治疗作用。

四氧嘧啶糖尿病小鼠较正常小鼠的血清甘油三酯，胆固醇水平均有升高［9］。本实验中，SBTI给药组的血清甘油三酯水平有所降低，其中，SBTI高、中剂量给药组小鼠的甘油三酯水平与Alloxan组之间存在统计学差异（P＜0.01）。另一方面，SBTI对总胆固醇有一定的降低作用，对高密度脂蛋白胆固醇有一定的升高作用，但其差异不存在统计学差异（P＞0.05）。该实验结果在一定程度上补充说明了SBTI对糖尿病具有较好疗效。

由于糖尿病小鼠胰岛素的缺乏会引起肝糖原合成减弱和分解过程加强加速，引起糖尿病的肝细胞体积减小，胞质嗜酸性增强，即肝细胞发生病变；糖尿病肾组织中肾小管的重吸收作用降低，大量葡萄糖由肾脏排出，病理性渗透性利尿，即肾细胞发生病变。而且，蛋白质、脂肪、水和电解质的代谢紊乱等也对肝肾细胞造成相应的损伤。因而，通过其肾、肝脏器质病变程度也可反映出治疗糖尿病药物的疗效。肾、肝的病理切片反映，给药组糖尿病小鼠的病情有一定程度的好转。

从实验数据中可观察到，各大豆胰蛋白酶抑制剂给药组的CHO，HDL-C水平与Control组及Alloxan组之间均无统计学意义（P＞0.05）。因此，拟定在下一步研究中，通过四氧嘧啶和高糖高脂饲料诱导大鼠的高糖高脂糖尿病，研究大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病模型各项血脂指标的影响，进一步探索大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病的疗效。

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蛋白酶抑制剂范文第4篇

【关键词】半胱氨酸蛋白酶抑制剂C;测定方法;临床应用

【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455(2010)07-0044-02

血半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C 又名胱抑素C)是目前发现的对组织蛋白酶B抑制作用最强的物质,其生物学功能主要是调节半胱氨酸蛋白酶活性。因其分子量小,能自由通过肾小球滤过膜,几乎完全被肾小管重吸收且不被分泌,能很好的替代肌酐而成为一种新的反映GFR的理想标志物。随着科学家对胱抑素C的深入研究,发现其不仅在肾脏疾病方面有临床价值,而且还揭示了它与肝脏疾病、糖尿病、肿瘤等具有一定的相关性。现就其在临床疾病中的研究进展概述如下。

1 血半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的结构和特性

1961年Clausen 于脑脊液中发现一种物质,因它与哺乳动物胱蛋白A 和胱蛋白B 的结构及活性相似,当时被称为胱蛋白C 。1985 年cystatin C 首次被报道可作为评估GFR 的指标,称为半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 。其最重要的生理功能是调节半胱氨酸蛋白酶活性[1]。

Cystatin C 是一种非糖基化的碱性蛋白质,由120 个氨基酸组成,相对分子质量是13.36×103 ,等电点为9.3,特点为位于羧基端附近有2 个二硫键。人的cystatin C基因片段位于20 号染色体上,其基因序列在大多数组织中能稳定表达。cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的一员。半胱氨酸蛋白酶包括木瓜蛋白酶家族中的组织蛋白酶(主要存在于溶酶体中) 和Ca2+激活蛋白酶家族中的Ca2+激活蛋白(主要存在于细胞质内) 。它们在细胞内肽类和蛋白质代谢特别是胶原代谢中起重要作用。

Cys C的测定方法很多,包括单向免疫扩散法、酶免疫测定法、时间分辨荧光免疫法、放射免疫法、乳胶颗粒增强免疫比浊法等。

2 CystatinC的临床应用

2.1 Cys C与肾移植:肾脏移植目前已成为治疗终末期肾病最有效的方法,因此肾脏移植手术后移植肾的功能监测成为临床工作之重点。2002年4月在德国马尔堡召开的国际专家会议上[3],与会专家一致认为,Cys C不受身高、性别、年龄、肌肉量的影响。王盛华等人的研究结果说明:健康人与非肾移植感染患者的Cys C浓度差异无统计学意义,故认为Cys C也不受感染因素影响。该研究还发现,Cys C在肾移植后诊断急性排斥反应时明显优于血清肌酐(serum creatinine,Scr),即Cys C比Scr提前(2.7±1.8)d升高;与排斥前比较,Cys C升高148.9%,远高于Scr的43.9%。Le Bricon等也曾报道,Cys C在排斥时比Scr升高得更早、更明显。

王盛华等人还发现,肾移植术后Scr缓慢下降,1周左右转阴(低于判断值122umol/L)而Cys C术后3d内迅速下降,尤以第1天为著,可达69.2%,第2天91%的患者即转为阴性(低于判断值1.79mg/L),也有报道肾移植术后Cys C可立即下降(293±1.7)%。Cys C的这一优势在诊断加速性排斥反应时得以发挥优势效果,而Scr虽有升高,但处于术后下降的背景中,不易观察;而Cys C可立即由阴性转为阳性,变化明显。

2.2 Cys C与肝脏疾病:Cys C与肝炎、肝硬化、肝癌: Cys C与肝脏疾病的关系少有报道。慢性肝病在发展成为肝硬化或肝癌的过程中,细胞外基质蛋白量的改变是一个非常显著的特征。肿瘤的生长和转移需要对周围基底膜和组织成分的降解。因此,细胞外基质合成与降解的失衡是肝硬化、肝纤维化,甚至肝癌发生的重要因素。有研究表明,基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制物(MMPs和TIMPs)是肝病中细胞外基质合成与降解的失衡原因之一。除MMP系统外,其它蛋白酶解系统也参与肝纤维化的形成,例如组织蛋白酶活性升高。国内有相关报道,Cys C在肝脏疾病患者中显著升高,且慢性肝炎、肝硬化和肝癌均有不同幅度的升高变化,推断Cys C与肝病的严重程度相关。

2.3 Cys C与糖尿病肾损害:糖尿病肾损害的主要病理改变为肾小球基底膜受损,而作为全部肾功能单位滤过率的总和,GFR是评价肾功能受损的一项好的指标,国内外很多研究都说明Cys C在评价肾损害比Scr要更为灵敏、特异。

尿微量清蛋白对早期糖尿病肾病诊断有重要价值,但最近一些临床研究发现,伴微量清蛋白尿的糖尿病患者仅有30%-45%,在10年内进展到临床糖尿病肾病。有人对23例仅尿mAlb一项为阳性,46例仅Cys C为阳性和其阳性而同时伴尿mAlb为阳性而未进行治疗的糖尿病患者进行跟踪调查测定,6个月内复查上述指标两次,结果发现前者有7例病人两次测定结果转为阴性,后者仅有2例两次测定结果恢复正常,证实单用尿mAlb诊断早期糖尿病肾病存在一定比例的假阳性,而Cys C的特异性较强,血清Cys C联合尿mAlb测定可提高糖尿病早期肾损害诊断的正确率[4]。2.4 Cys C与妊娠高血压综合征:妊娠高血压综合征(简称妊高征)一直是产科的疑难杂症之一。国内有研究显示,血清UA、Cr在中重度妊高征患者中较正常未孕者明显增高(P

2.5 Cys C与格林-巴利综合征(Guillain Barre syndrome, GBS):格林-巴利综合征(Guillain Barre syndrome, GBS)是以周围神经和神经根的脱髓鞘及小血管周围淋巴细胞及巨噬细胞的炎性反应为病理特点的自身免疫性疾病。在发展中国家发病率比较高,其病因和发病机制尚不明确。大量的实验证明,GBS患者脑脊液中存在蛋白质的异常表达,这为我们研究GBS提供了一个独特的窗口。目前,国内外已开始将蛋白质组学技术应用于研究GBS患者脑脊液,从总体水平找到一些与GBS相关联的蛋白质[6],但是这些蛋白与GBS的关系尚未完全明确。

有研究表明,Cystatin C可作为疼痛的脑脊液生物学标记物,持续的疼痛诱导神经系统Cystatin C的合成与释放]。然而,本实验GBS组中Cystatin C相对于对照组表达明显下调,可能与GBS的主要症状的瘫痪与麻痹影响有关。

2.6 Cys C与心血管动脉粥样硬化(AS):目前基础研究证明动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症过程,发病机制涉及细胞外基质降解与血管壁重构。

有关专家应用免疫染色法与免疫杂交法发现动脉粥样斑块中cystatin C含量较正常血管减少,而组织蛋白酶S及K却过度表达,认为cystatin C的缺失以及蛋白水解酶与其抑制剂的失平衡可能是AS的发病机制之一。Sukhova等对ApoE-1-小鼠的实验研究结果也直接证明AS形成时cystatin蛋白酶/蛋白酶抑制剂失衡。经研究发现CHD患者血清cystatinC浓度明显低于对照组,表明了CHD患者存在低cystatin C血症,这一结果支持cystatin C的缺失可能是AS的发病机制之一的结论,表明cystatin C对CHD患者可能有一定的保护作用。

3 Cys C的临床应用展望

Cystatin C在体内产生速率稳定,影响因素极少, ,测定Cys C对疾病指导诊断及治疗,具有重大的临床意义Cys C在临床上的应用已经不再局限于评价GFR了,它在很多疾病中的关联也越来越明显了。虽然目前的研究结果中还存在着很多的推测,但是随着分子诊断学的发展,很多的难题定会得到解决。同时它将会广泛应用于临床其他指标的评价,其在疾病的发生、发展中势必会发挥越来越大的作用。

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蛋白酶抑制剂范文第5篇

【摘要】 目的 探讨血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（cystatin C）在诊断早期糖尿病肾病(DN)中的价值。方法 测定糖尿病正常蛋白尿组（A组），糖尿病微量蛋白尿组（B组），糖尿病大量蛋白尿组（C组）的血清cystatin C和血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr），对各项指标比较分析。结果 cystatin C值C组明显高于B、A组，B组高于A组，cystatin C在三组之间差异均有统计学意义（P＜0.05）；BUN、Scr在A、B组中无显著性差异，但C组患者的BUN和Scr明显高于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 血清cystatin C是诊断早期DN的理想指标。

【关键词】 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 糖尿病肾病

【Abstract】 Objective To explore the diagnostic value of serum cystatin C in early stage diabetic nephropathy.Methods Determination of diabetic normal albuminuria group (A)， diabetic microalbuminuria group (B group)， a large number of diabetic proteinuria group (C)， cystatin C serum blood urea nitrogen (BUN)， serum creatinine (Scr)， the various indicators Comparative analysis.Result Cystatin C value of the group C was significantly higher than group B and A， group B than group A.Cystatin C IN the three groups was statistically significant differences (P＜0.05); BUN， Scr in the A， B group， no significant differences， but Group C with BUN and Scr were significantly higher than A， B group， the difference was statistically significant (P＜0.05).Conclusion Serum cystatin C in early diagnosis of diabetic kidney disease is the ideal targets.

【Key words】 Cystatin C Diabetic nephropathy

糖尿病肾病(DN)是糖尿病微血管病变的重要组成部分之一，一旦病情进展至临床肾病期，治疗效果差，是导致糖尿病病人死亡的主要原因之一。早期发现DN，及早采取治疗性干预措施可延缓甚至逆转病情，因此及早诊断DN至关重要。目前主要以尿白蛋白排泄率作为DN的诊断和分期标准，但该法受发热，尿路感染，高血糖等多种因素的影响，因此寻求其他简便易行的诊断指标是今后的研究方向。近年国外有研究指出［1］，血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cystatin C）是反映肾小球滤过率良好而敏感的指标，国内亦有报道［2］其诊断早期DN的敏感性高。为了探讨Cystatin C在早期DN中的诊断价值，作者自2007年3至9月分组对DN病人的cystatin C与血尿素氮(BUN)，血清肌酐(Scr)进行测定，并分析比较，其结果如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 糖尿病正常蛋白尿组（A组）病人43例，男23例，女20例；平均年龄45.6岁，平均病程5.3年，24h尿白蛋白排泄＜30mg；DN微量白蛋白尿组（B组）病人24例，男13例，女11例；平均年龄47.3岁，平均病程8.5年， 24h尿白蛋白排泄30～300mg；DN大量白蛋白尿组（C组）病人15例，男8例，女7例；平均年龄60.4岁，平均病程11.7年，24h尿白蛋白排泄>300mg。均为本院内分泌科住院病人。糖尿病的诊断符合1999年WHO糖尿病的诊断标准。所有病人均无心血管、呼吸系统及急慢性感染等合并症，以上各组病人年龄、性别、病程经比较均无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法 病人入院后留取24h尿，测定24h尿白蛋白定量，抽取静脉血5ml分离血清，分别检测cystatin C，BUN，Scr。24h尿白蛋白测定采用德国BN Prostec特定蛋白分析仪，免疫速度比浊法测定，试剂为原产微量白蛋白试剂盒；血清cystatin C浓度测定采用日立7060全自动生化分析仪，乳胶颗粒增强免疫比浊法测定，为北京九强公司生产的试剂盒，血清BUN，Scr测定采用日立7060全自动生化分析仪酶法测定，试剂盒购自日本第一化学株氏社。

1.3 统计学分析 应用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清cystatin C，BUN，Scr结果比较 三组病人cystatin C，BUN，Scr结果见表1。cystatin C值C组明显高于B、A组，B组高于A组，cystatin C在三组之间差异均有统计学意义（P＜0.05）；BUN、Scr在A、B组中差别无统计学意义，但C组病人的BUN和Scr明显高于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。表1 各组cystatin C、BUN、Scr的测量结果

2.2 血清cystatin C和BUN，Scr诊断早期DN的比较 以尿微量白蛋白（＞20μg/min）作为诊断早期DN的金标准，血清cystatin C（＞0.96mg/L）诊断早期DN的敏感性为87.31％，而Scr＞134μmol/L为34.26％，BUN＞134mmol/L为30.52％。血清cystatin C诊断早期DN的敏感性高于Scr和BUN，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

在临床工作中，如何准确地评估糖尿病肾功能情况，特别是对糖尿病早期肾功能损害程度的判定，对及早干预糖尿病肾病(DN)的进展有非常重要的作用。目前临床中常用的反映肾小球滤过功能的指标有BUN、SCr、24h尿肌酐清除率（CCr），但均有一定的局限性，且不同程度地受到一些肾内或肾外因素的影响。由于肾脏强大的代偿功能，在肾功能轻度受损时BUN、SCr可无变化，当BUN、SCr高于正常时已表明60%～70%的有效肾单位受到了损害，因此BUN、SCr敏感性较差，不能作为肾脏早期功能受损的指标。此外BUN、SCr还受到蛋白摄入量、体内代谢水平及某些药物的影响，不能真实地反映肾小球滤过功能。24h CCr虽然是反映肾小球滤过功能较敏感的指标，但也有一定的局限性，也会受一些因素的干扰，如肾小管能分泌少量的肌酐，使测得的结果较实际肾小球滤过率高;此外尿液收集、记录不准确，部分尿液丢失，尿液储存不当，特别是在高温下，尿酸会向肌酐改变，以上因素对结果均有影响。

近年国外有研究指出，血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cystatin C，Cys C）反映肾小球滤过率的水平较BUN、SCr为好［1］。Cys C是一种非糖基化的碱性蛋白产物，分子量为13559，由120氨基酸组成，是体内最重要的半胱氨酸蛋白酶抑制剂之一。Cys C是人体内的有核细胞产生，生产率稳定，不受个体肌肉量、性别、年龄、肾前因素和慢性炎症的影响［3，4］，血清Cys C几乎完全由肾小球滤过，被肾小管分解代谢，而不被肾小管重吸收及分泌［1，4］。Cys C自1985年发现，已逐渐应用于临床，通过对血中Cys C的测定来反映肾小球的滤过率（肾脏功能），不需收集尿液，只需一份血标本，且重复性良好。据报道，血Cys C浓度与肾小球滤过率的相关性明显优于SCr，因而能更精确地反映肾小球滤过率，特别是在肾功能仅有轻度减退时，血Cys C的敏感性远优于SCr［1～3］［5～9］。本文结果显示：cystatin C值C组明显高于B、A组，B组高于A组，cystatin C在三组之间差异均有统计学意义（P＜0.05）；BUN、Scr在A、B组中差别无统计学意义，但C组患者的BUN和Scr明显高于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。血清cystatin C诊断早期DN的敏感性高于Scr和BUN，差异有统计学意义（P＜0.05）。综上所述，血清cystatin C与尿微量白蛋白相关性好，敏感性高，是诊断早期DN的理想指标，其检测方法简单、快捷、方便，值得临床推广和应用。

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