蛋白质组学范文第1篇

[关键词] 喉癌；蛋白质组学；双向凝胶电泳

[中图分类号] R739.65 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）06-0031-03

Comparative proteomic analysis of differentiation cancer of larynx

LV Jingyao LI Zhihai CAI Zhiyi

Department of Otolaryngology, Taizhou Hospital in Zhejiang Province, Taizhou 318000, China

[Abstract] Objective To study on differences of human laryngeal carcinoma group expression in high, low cancer group, using online databases of different protein spots of the peptide fingerprint analysis and identification. Methods Analysis and study on ENT pathology retrospectively clinical data from 2011 January to 2011 May in our hospital. Results The fresh specimens of laryngeal carcinoma classified as well-differentiated cancer group and the low differentiation cancer group. The extraction of two groups of tissue protein, for two-dimensional gel electrophoresis, compared to the normal mucosa tissue. Conclusion High differentiation carcinoma and poorly differentiated cancer tissues expression shows, laryngeal cancer cell differentiation and proteomics have very close relationship.

[Key words] Laryngeal cancer; Proteomics; Two-dimensional gel electrophoresis

目前喉癌的发病率约占全身恶性肿瘤的5％，是头颈部肿瘤中较为常见的恶性肿瘤，喉癌的总体生存率低，就算积极投入治疗，现阶段的医疗水平对其生存率并无明显改善。近年来，随着经济的发展，人类的生存环境日趋恶化，喉癌的发病率也呈现逐年递增的趋势。蛋白质组学是从整体上研究其在不同时间和空间中所发挥的功能及蛋白质间的相互作用的一门新兴的学科，其特征就是建立双向电泳差异图谱，采用透视全体基因在特定细胞或组织的动态表达的分析方法，从而达到解释蛋白质功能与细胞生命活动的规律[1-3]。另外,还有部分的实验室将研究的结果建立了数据库，以利于蛋白质组学技术在肿瘤研究的中临床应用。本文选取本院耳鼻喉科2011年1~5月喉癌患者的病理临床资料6例进行回顾性分析与研究，通过运用网上数据库对人类的喉癌组织表达差异中的高、低分化癌组之间的相互差异性的研究，从而达到对不同蛋白点的肽指纹图的分析和鉴定，并总结分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取本院耳鼻喉科2011年1~5月喉癌患者的临床资料6例进行回顾性分析与研究。6例喉癌患者中，男4例，女2例，年龄30～60岁，病理结果显示其病理组织来源于鳞状上皮组织，其中高分化鳞癌2例，低分化鳞癌4例。6例患者均作为蛋白质组研究的组织标本,同时选取对侧未被肿瘤侵犯的正常喉室或室带黏膜作为对照组的正常黏膜，6例配对的癌旁正常喉黏膜组织均距离肿块边缘达5 cm以上。

1.2 研究方法

1.2.1实验的试剂与仪器的备用 组织物备用：将所有选取的喉癌组织及正常黏膜均用冰盐水清洗干净，滤纸吸去多余的液体1 min后将其置于-70℃冰箱保存备用，此项过程的处理需于组织离体后30 min内完成。

试剂备用：选用超纯尿素（urea）、甘氨酸（glycine）、硫脲（sulfocarbamide）、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基磺酸钠（SDS）和低分子量蛋白标记Tris碱、pH 3～10固相化线性17 cm干胶条(IPG strip)购自Bio-Rid公司。CHAPS（两性离子去垢剂）、二硫苏糖醇（DTT）、10固相化线性13 cm干胶条及考马斯亮蓝R-250，以上均购自上海生工公司。

仪器备用：选用低温高速离心机（Beckman公司）、Imagescanner扫描仪（Amersham Pharmacia公司）、真空冷冻干燥仪（Savant speed Vac&UVS400）、Ettan DALT垂直电泳槽（Amersham Pharmacia公司）、Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS质谱仪（Applied Biosystem公司）和IPGphor等电聚焦仪（Amersham Pharmacia公司）等。

1.2.2 具体操作方法 双向电泳样品的制备：从喉癌黏膜组织中提取蛋白质80 mg作为样品，加入组织裂解液，其中尿素7 mol/L，DTT 65 mol/L、硫脲2 mol/L、Tis 50 mmol/L、充入4％CHAPS、1 mmol/L PMSF混合，放置于4℃下20 min，然后加入DNA酶0.1 g/L，置于冰浴上再给予匀浆器以手工匀浆5 min后，吸取其上清液，所得就是组织的总蛋白质，再辅予RNA酶0.025 g/L，取其上清组织进行分装，贮存于-70℃冰箱备用。

BCA法测提取液中的蛋白质浓度：选取BCA蛋白定量试剂盒（按50体积Solution A加以体积Solution B（50∶1）的完全溶解蛋白标准品，再配置适量的BCA工作液，使其最终达到浓度0.5 mg/mL，然后充分混匀蛋白质样品，置于室温24 h内稳定及其标准品均用PBS稀释的BCA工作液中，然后适当增加体积样品于标准品稀释液中，再将稀释后的标准品加入标准品稀释液的将所有标准品中，具体均于各孔中加入LBCA作为工作液，放置30～60 min冷却后达到室温的程度时，再采用酶标仪测进行测定波长的吸光度，予以标准曲线进行计算，其所得出的结果就是样品中的蛋白浓度。

将以上的分析与喉高分化鳞癌和低分化鳞癌相结合，与癌旁正常黏膜组织进行了2-DE比较，并将三组中斑点位置清晰的图像分别进行合成和分析。

2 结果

2.1 双向凝胶电泳结果

如图A所示，图像显示出现低分化癌组中有7个特异表达或表达上调超过3倍的蛋白点，其高、低分化喉癌组织和癌旁正常黏膜组织的大部分蛋白斑点分子量均位于20.1~116 kD及pI 4~8的区域。在高分化癌组中有6个特异表达或表达上调超过3倍的蛋白点出现，位于30～80 kD及pI 4.5～7.5区域中的蛋白质斑点分布非常密集，呈现3块合成胶的表现。将两组进行两两比较之后，发现高分化癌组与正常组的平均匹配率为70．1％，蛋白斑点数约为600～950之间，蛋白质斑点清晰可辨。

如图B所示，运用PD-quest7．0软件分析3组凝胶图。①喉组织的高低分化两组的pH极酸和极碱性蛋白质的含量均较少，有两个蛋白点的位置基本相同；高、低分化癌组中均有特异表达；低分化癌组与正常组的平均匹配率为71.9％。②正常组平均检测的蛋白点为（606±65），在高分化癌组中有4个特异表达或表达上调的蛋白点。

将喉癌高低分化组织中共同的特异性标志物与癌旁正常黏膜组织相比：高低分化癌组中均有5个特异表达或表达上调的蛋白点，结合肉眼观察得出；低分化癌组平均检测的蛋白点为（832±49）个，高分化癌组的平均检测蛋白点（846±57）个。

2.2 蛋白质点的鉴定结果

在相同的实验条件和参数的情况下，从差异蛋白质斑点中分辨最清楚的蛋白点上选取一对组织中表达相差3倍以上的点，然后在喉癌及正常黏膜组织凝胶图像中进行标记，重复三次操作，以酶自降解峰进行校正，然后对5对组织中具有相同变化的蛋白点处进行切取并进行MALDI-TOF-MS分析，结果视为差异蛋白质点。最后将所获得的肽质量指纹图以空白胶作阴性对照，软件识别其有效肽片段峰后查询数据库，获得了肽质量指纹图。差异表达蛋白质的生物学功能初步分析获得蛋白质分子量及等电点，与网上的双向凝胶电泳数据库对比分析发现，组中与数据库中基因存在相似的位点。见表1。

3 讨论

随着科学的高速发展，人类的基因组全序列测定理论和技术也得到了长足的发展和完善，近年来，后基因组时代的功能基因组学发展迅速，能从组织或细胞蛋白质的整体和动态水平的全新角度来研究疾病的发病机制[3]。而作为功能基因组学重要内容之一的蛋白质组学（proteomics）[4]也被广泛应用于人类疾病的发病机制、治疗和药物筛选的研究之中，并取得了可喜的成果。而蛋白质组学研究的迅速发展，源于双向凝胶电泳技术[5]的创立和有效运用，其对组织成分的复杂性及人体的个体差异的独特分析作用，已被作为当前分离组织细胞蛋白质组的核心技术来运用，在细胞系的研究发展史上起到关键性作用[6]。

本实验对组织标本的选取及对样量进行了多次的摸排的研究，使其重复性大大增加。在样品制备和双向胶的制备以及考染过程等尽量保持统一性，最终获得了高分化、低分化喉癌组织及癌旁正常黏膜组织等三种组织中固相pH梯度2-DE图谱，而且图像清晰、分辨率高和具有极高的重复性,可反复试验。

样本的收集和处理实验过程中由于蛋白质的样品会被特异组织蛋白质污染，要想获得图像清晰、分辨率高和重复性好的2-DE图谱则需要做好样本的收集和处理，以避免受到污染而影响实验结果[7]。需要特别注意的是新鲜组织样本取得之后，一定要用滤纸吸干样本上表面所黏附的水分，在样本清洗滤干后，应立即去除其他组织，并用生理盐水彻底洗去表面的血液及黏液，以免发生组织蛋白降解和结构破坏的现象。

样品的制备中减少分离步骤因为盐的浓度过高会降低等电聚焦的电压，其蛋白质样品的制备是2-DE中最为关键的一步，甚至会损坏IPG胶条破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用；而降解酶的活性会造成2-DE获取的直接失败，所以为了避免蛋白质在抽提过程中被丢失和破坏，处理这一步的结果好坏会直接影响到2-DE图谱的显示。提取样品蛋白质过程中使其处于完全变性状态，应尽可能提高样品的溶解度，必须考虑除去影响蛋白质可溶性和2-DE重复性的物质，样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。所以，抽提最大量的总蛋白，常常会释放出各种蛋白酶和蛋白质修饰的酶类，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子，以及加蛋白酶抑制剂等，会明显减少蛋白质的损失。所以，实验应尽量在低温下进行，以避免大分子的存在阻塞凝胶孔径，以达到减少对蛋白质的人为修饰的目的。

在样品数量增加的时候，除了会引发双向电泳图谱的畸变外，影响2-DE的结果。蛋白质具有凝集和沉淀的特点，而这些特点则会造成丰度较高的点，特别是在第一向电泳的时候会更加明显。如果再加大以上样品量时能够增加凝胶上点的数目，以至进行第二向的电泳时，当样品量过大时则会出现丰度高的蛋白质点掩盖丰度低的蛋白质点的现象，最后从而产生2-DE图谱上水平和垂直的条纹。

在上样量为1 mg总蛋白时，会导致2-DE图谱上的分辨率下降，只有这样才会在第一向电泳完毕后才能够获得清晰、分辨率高和重复性好的2-DE图谱。另外，需在IPG胶条在第二向电泳平衡两次后，测定样品蛋白质的浓度。

每次15 min的双向凝胶间的界面精密接触时，其水的纯度对染色结果会造成明显的影响，表现为在第一次平衡时会出现减少电内渗的现象，不能单纯缩短平衡的时间，否则会出现接触不好或两者之间有气泡的出现，所以遇到这个问题时，需使用去离子水（电导

比较肿瘤组织与正常组织中的蛋白质在表达数量的差异时，对喉癌和喉正常组织进行了三次重复性2-DE实验。实验结果发现，寻找与癌变机制相关蛋白的关键就是寻找与癌变相关的特异蛋白质和获得分辨率较高的组织参考图谱，而发现肿瘤分子标记的有效途径就是重复蛋白斑点数目的匹配率需在85％以上。

以癌旁正常的黏膜组织作为对照物，因为高分化与低分化喉癌的图谱之间存在较好的可比性。在2-DE实施分离和可视化的蛋白质数量多少能局部反映组织蛋臼质组的改变，代表了喉癌与正常组织的差异性。本研究运用了目前蛋白质组学研究中所使用的进行蛋白质分离纯化技术中最为常用的一种技术――2-DE技术，充分运用其作用机制，通过调节固相的pH梯度干胶条的等电点区间或应用大面积SDS-PAGE胶，能同时分离展示细胞或组织中成百上千的蛋白质，从而最终达到进一步提高差异蛋白质点的分析和鉴定目的，并能通过一向等电聚焦使不同的蛋白质按等电点聚集的特性，最后使更多的蛋白质得到较为清晰和高分辨率的展现，局部地反映部分组织蛋白质组的改变。

4 结论

本研究在喉癌组织和正常喉黏膜组织的蛋白质表达图谱的获得中发现，经质谱分析及生物信息学技术能初步鉴定喉癌组织的部分差异蛋白质，并能通过凝胶图像的分析找到喉癌组织和正常喉黏膜组织之间的差异蛋白，而其中有部分蛋白可能与喉癌发生发展具密切相关关系[7]。而这些差异蛋白能否作为喉癌诊断的标记物和治疗靶标，建立喉癌蛋白质组数据库，尚需进一步研究。本研究为整体上认识喉癌以及探索喉癌早期诊断和早期治疗的研究提供一定的理论依据。

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蛋白质组学范文第2篇

【关键词】 蛋白质组学；中医证候；中医诊疗；中医药现代化

随着人类基因组序列的完成，人类已经由基因组时代进入后基因组时代。基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性使基因组学研究成功迈入到功能基因组学研究。蛋白质组学遂成为后基因时代的研究前沿和热点领域。将蛋白质组学引入中医证候学研究，必将进一步为证候分类、辩证标准的选择和个体化等提供可靠的依据，对于发展中医药学，走中医药现代化之路具有深远的影响。本文综述了蛋白质组学研究的主要关键技术及其与中医证候学研究的相关性。

1蛋白质组及蛋白质组学

1994年澳大利亚的Wilkin和Williams等第一次提出了蛋白质组（Proteome）概念[1、2]，指由一个基因组，或一个细胞、组织所表达的全部蛋白质。蛋白质组学（Proteomics）以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质间相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律[3]。蛋白质组研究是为了识别及鉴定一个细胞或组织所表达的全部蛋白质以及它们的表达模式，是对基因组研究的重要补充，是生物体在蛋白质水平上定量、动态、整体性的研究[4]。蛋白质组研究数据与基因组数据的整合，将在后基因组研究中发挥重要作用。

2蛋白质组学研究技术

2.1双向凝胶电泳技术

1975年，意大利生化学家O’Farrell在对大肠杆菌、老鼠及几尼猪的蛋白质研究中，发明了双向电泳技术[5]（ISO-DLAT），具有高分辨率、快速、简便等优点。双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一，其原理是在相互垂直的方向上，它利用蛋白质等电点和分子量的不同运用等电聚焦和聚丙烯酰胺凝胶电泳把复杂的蛋白质混合物在二维平面上分离。

2.2生物质谱技术

1906年，Thomson发明了质谱，在随后的几十年里，质谱技术逐渐发展成为研究、分析和鉴定生物大分子的前沿方法[6]。质谱技术的原理是先将样品离子化，再根据不同离子间的荷质比（m/z）差异来分离蛋白质，并确定其分子量[7]。到20世纪80年代，因两项软电离质谱技术―基质辅助激光解析电离质谱技术（MALDI）和电喷雾质谱技术（ESI）的发明，使得质谱技术取得了突破性进展。这两种质谱技术具有高灵敏度、高通量和高质量的检测范围等特点，使得在pmol（10-12）乃至fmol（10-15）的水平上准确分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能[8]。

2.3 蛋白质芯片

蛋白质芯片是用于研究蛋白质功能模式的一种鉴定方法[9]，是指在固相支持物（载体）表面固定大量蛋白探针（抗原、抗体,受体、配体、酶、底物等），形成高密度排列的蛋白质点阵[10]，可以高通量地测定各种微量纯化的蛋白质的生物活性，以及蛋白质与生物大分子之间的相互作用[18]。蛋白质芯片具有快速、高效、微型化、自动化、高通量的特点。

2.4生物信息学

生物信息学是在生命科学、计算机科学和应用数学的基础上逐步发展形成的一门新兴交叉学科，运用数学和计算机手段进行巨量生物信息资源的收集、存储、处理、搜索、利用、共享、分析与解析的科学[11]，它由数据库、计算机网络和应用软件3部分组成[12、13]。蛋白质组信息学研究方法主要包括蛋白质序列比较分析，蛋白质结构-功能的研究，点突变的设计及家族鉴定，蛋白质空间结构预测，建模和分子设计以及分析蛋白质与蛋白质相互作用的数据库[14、15]。

3中医证候学与蛋白质组学

中医证候是指疾病发生和演变过程中某阶段以及患者个体当时所处特定内、外环境本质的反映，它以相应的症、舌、脉、形、色、神表现出来，能够不同程度地揭示病因、病位、病性、邪正盛衰、病势等病机内容，为辨证论治提供依据。中医的“证”是指疾病在演变过程中各种病理因素在体质、自然环境、社会心理等因素和多种矛盾综合作用于机体的整体反应，是诊察和思辨所得。而蛋白质组学摒弃了经典分子生物学研究个别基因的习惯，从蛋白质组整体水平上阐述“一种基因组所表达的全套蛋白质”，以建立对生命现象的整体认识。这与中医学的“整体观”具有高度的一致性，且蛋白质组学研究方法的整体性和系统性与中医基础理论的整体观和系统性又极为相似[16]。因而，将蛋白质组学应用于中医证候学研究，不仅能反映一系列症状的物质背景，而且能进一步了解不同蛋白组分的在证表现差异和激烈程度[17]，将是揭示证实质的最有效手段[18]。

在证候理论指导下，运用功能蛋白质组学的方法，通过探讨证候，特别是同病异证或异病同证的蛋白质差异表达及翻译后的修饰情况，揭示与某一证候形成相关的所有蛋白质及其特征，在整体蛋白质表达的水平上阐明证候的本质，则可称为证候蛋白质组学[19]。这种将蛋白质组学应用于“证”的研究，能够沟通“实体结构”和“功能模拟”的桥梁，整体上比较不同疾病、同病异证之间的蛋白质图谱差异，探索蛋白质表达图谱与中医分型的系统的、有规律的联系。

4展望

运用蛋白质组学技术对中医证候进行研究，为寻找“证侯”的标志蛋白质，揭示中医“证”理论中蕴藏的科学内涵，阐明中医诊疗的分子机理，最终在分子生物学水平上解释生理和病理奠定了基础[20、21]。中医证候是辨证论治的基础和核心，依据蛋白质组学的理论和技术来探索中医学理论的基本内涵、中医证候蛋白质组学以及从蛋白质组学水平探索中药药效的机理，都可能成为中医药理论和治疗研究的突破口。中医学的发展与现代科学蛋白质组学的交叉，一方面可使中医学吸取新的思想，取得进一步发展的动力，另一方面又因其独特的理论与视角，也可为蛋白质组学乃至现代科学的研究与发展提供新的思路[19]。

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蛋白质组学范文第3篇

在以前关于疾病的分子学基础的研究探索中，基因组成为人们最初探索研究的焦点。基因中编码的信息被转录进mRNA，然后进一步加工、处理、修饰连接，从而用很少的原材料就可以产生众多与原来基因材料相同的蛋白质。蛋白质组包括所有来源于个体完整基因遗传密码的蛋白质。蛋白质组学在基因组中编码了什么和蛋白质中翻译了什么之间架起了联系的桥梁。和核酸相比，蛋白质更能代表细胞的功能产量。蛋白质因此反映了细胞的真实情况，而且不同的蛋白质表达可以帮助在疾病状态中界定健康状态[1]。

对一个已给定细胞的全部或有选择性的蛋白质表达的蛋白质组特点进行研究能够描述蛋白质组中的一系列信息[2]。据估计，人类蛋白质组由超过50万个蛋白质组成，而这些蛋白质起源于人类基因组中的35 000个基因[3-4]。与单独研究基因相比，蛋白质组更具复杂性和潜在的特异性。对蛋白质组进行的相关研究一般可以分为两类：①阐述蛋白质表达；②阐述蛋白质功能。

表达蛋白质组通过细胞中的活动基因和存在于靶器官中的基因来评价细胞的蛋白质产量。它揭露了健康状态和疾病状态两者间有差别的蛋白质表达。表达蛋白质组相关技术的应用使得能够通过包括组织、血清、尿和腹水在内的多种途径来研究蛋白质的表达。研究蛋白质组的最常用的技术包括2DE、质谱以及其他形式的光谱测定法与MALDI、SELDI的联合应用和其他技术平台。

表达蛋白质组学已经被用于发现和确认疾病的生物标记物。生物标记物可以分为三个主类：诊断生物标记物、预后生物标记物、预测生物标记物。诊断生物标记物可以帮助传统的医学逻辑方法诊断疾病，尤其是倘若肿瘤已发生了转移而且肿瘤的最初来源又不能确定时。虽然有效的诊断标记物可以有助于癌症的早期发现从而减少介入诊断过程的需要，但是已有的真正的诊断生物标记物却是很少。β-人绒毛膜促性腺激素作为一个诊断是否怀孕的生物标记物早已被应用于实践；另外比如用于鉴别前列腺癌的前列腺特异抗原(PSA)或者鉴别卵巢癌的CA-125的灵敏度和特异度较低一些。预后的标记物，如激素受体，血管病标记物和增殖繁殖标记物可以提供关于疾病的可能临床起因或者恶化情况的信息，也可以指导治疗计划方案的制定[5-6]。最终预测标记物能够预言疾病的起因和最佳治疗方案。例如，乳腺癌的表达雌激素受体，最好用抗雌激素如他莫西芬或者芳香酶抑制剂[7-8]。

功能蛋白质组评价蛋白质之间交互作用的活化状态，而且能够被用来绘制某细胞内众多的信息表示途经网的形态图。阐明蛋白质-蛋白质的相互作用是非常有用的。新发现的相互作用可以帮助寻找癌症中新的蛋白质和新的致癌基因，或者为共同的下游事件由两个不同的信息网共享来提供证据。更多的关于众多路径交叉的信息能够帮助针对这些路径进行直接干预治疗的发展[9]。功能蛋白质组利用MALDI/SELEI技术以及与新的蛋白质组织微观陈列的连合应用。

基因组学领域关注的是对每个蛋白质核甘酸密码的描绘，但是每个蛋白质的基因密码并不是对蛋白质功能的完全预言。在它们所处的微环境中，当细胞受复杂的通信传递系统的影响时，多种体内因子就能够改变活动水平或蛋白质功能。蛋白质-蛋白质相互作用、翻译后修饰以及蛋白质和DNA或者RNA之间的交互作用都可能改变蛋白质的活性，而这些通过它的转录水平能够被预测。功能蛋白质组学在细胞的微环境中研究蛋白质的相互作用，从而决定了一个蛋白质如何完成它特异的细胞工作。对功能蛋白质组学的展望是：以疾病支撑蛋白结构为基础，通过对超离常规或高表达蛋白质的研究，能够达到治疗癌症的目的。另外，蛋白质分子靶向疗法的反应可以用来帮助监测靶向疗法的功效和寻找利用相同蛋白质途径进行治疗的其他潜在的可行方法。

靶向分子的发现-尽管很多靶向药物的靶点是蛋白质，在被设想用靶向药物作用的超过3000个蛋白质中只有500个白质已经运用了靶向治疗方法[10]。对蛋白质组学的研究可以识别新的靶子，也可以帮助对已知药物的深入研究，许多小分子体外实验已经宣布对特定的蛋白质靶子有着特异性。这些小分子将十分错综复杂并可以影响体外多种蛋白质，这点已经非常明显。Imatinib是一个经典的药物例子。它最先预想的靶点是病理性慢性骨髓性白血病(CML)熔和蛋白BCR-ABL，但是进一步实验却发现它的靶点还有酪氨酸激酶系列中的Ⅲ型受体-酪氨酸激酶C-KIT血小板起源生长因子受体。它能够靶向抑制C-KIT和C-KTT突变异种的能力，对胃肠道间质瘤中有很好的疗效。SDS-PAGE和MS可以用来隔离与药物有相互作用的不同蛋白质。通过用已知药物在蛋白质排列中作为“诱饵”(诱导剂)，然后找到新的潜在治疗靶点。例如：MAPK抑制剂的蛋白质组学分析，SB203580，蛋白质激酶C抑制剂GF109203X，在分子水平揭示了包括RICK和细胞周期蛋白依赖激酶2在内的众多的潜在靶向分子[11-12]。细胞同样可以作为药物，前处理蛋白质组的肿瘤生长对比曲线可以用作对蛋白质靶点的证明和确认。这种技术也可以运用于阐明肿瘤细胞的耐药机制。

通过集中对比研究分析，上调蛋白质的蛋白质组和发现的已知小调蛋白质的抑制剂的正常组织，就能够发现治疗的靶点。例如：Hu等[13]用SELDI-TOF-MS发现热休克蛋白70在卵巢癌细胞排列中是十分有规律的，可以用热休克蛋白70抑制剂发育障碍细胞株。在大鼠体内外的实验已经完成了毒性方面的研究，包括急性淋巴母细菌白血病、急性骨髓白血病、结肠癌、肝癌和乳腺癌[14-15]。

靶向疗法的监测反应：蛋白质组学有引起监测和专注患者的抗癌治疗反应的潜在作用。继发疾病的传统疗法是关注于一系列假设的研究。这些研究很容易出现错误，因为放射线学者在专业知识和影象学技术方面有太多的不同。同时，由于患者的病情各不一样导致治疗措施的不同，尤其是肿瘤大小发生改变的情况下就更为突出了。瘤标记物依照标准的技术来测量，例如CA-125，癌胚抗原，CA-199，已经作为患者疾病检测的一部分，但是它却充满了未可预知的敏感度和特异度。在治疗癌症方面，分子靶向疗法的快速运用也许将会改变临床关于有效治疗的观点，因为这些作用物相比细胞毒素来说，它们是抑制细胞生长的。因此，如果是这样笔者可能不会看到疾病相同程度的减弱。病程长而病情稳定的癌症患者，如果用分子靶向药物治疗，他们的病情就能够得到控制，这种概念可以用蛋白质组的方法来加以解释。后处理的血清或瘤的蛋白质组分析能够证实靶向目标和途径抑制作用，从而改善治疗措施。

美国国家健康检验所NCI的内部实验项目中，PRA技术现已在进行卵巢癌的Ⅱ期临床试验。而瘤样本的生物化学反应立即优先运用分子靶向疗法进行治疗,病情不断发展的卵巢癌患者与此同时，也应该用imatinib和Gefitinib等抑制剂进行治疗。瘤的活组织检查样品运用EGFR，磷酸化EGFR和下游信号分子AKT/磷酸化AKT和 ERK/磷酸化-ERK进行分析。蛋白质组学的结果证明Gefitinib在抑制初想靶点上是有效的，而且也获得了初想的下游信息。另一个用相同做的试验是检测imatinib针对卵巢癌旧病复发的治疗作用。瘤体活组织检查的RPAs 前处理和后处理揭示了靶向抑制剂和与疾病反应相比的毒性反应更有关联性。磷酸化-KIT和EGFR的后处理水平和血小板起源生长因子受体与疲劳紧密相关。

蛋白质组学可以在分子影像学新领域中作为X线照射技术的补充。肿瘤密度和显微镜下的异像可以和特殊的蛋白质组剖面图联系起来，通过非侵入性的X线照射技术手段来确定它们的生物学结构。Hobbs等根据MRI、X光线照射表现有不同活组织检查区域描绘了多发性成胶质细胞瘤。他们发现在MRI下，每类肿瘤的变种都和一个特别的蛋白质组剖面图对应。蛋白质组学的剖面图谱和典型的影像图谱联合一起运用，可以减少某些肿瘤侵入性活组织检查的需要，而且可以成为供患者治疗手段的一种选择。

个体针对治疗-通过对所有类型的恶性肿瘤和非恶性肿瘤疾病的人口统计与分析，得出一个结论“世界上没有两个相同的癌症患者”。通过诊断患者类似的恶化状况，疾病位置和促成因素，能够对特定的疾病做出不同的反应。蛋白质组学提供的关于特定肿瘤的描述和每一个患者蛋白质靶点的不同而使分子疗法个性化。恶性克隆基因组的差异可能与抗癌治疗方法的不同有一定的联系。有一个关于基因组信息测验的随机试验已经被证实和完善。例如：第21个基因的排列方式已经被按预期设想的运用到对乳腺癌的分类实验中。然而，通常一个细胞的基因密码不能反映变态蛋白质的DNA转录；致癌细胞个体的功能紊乱发生在DAN翻译和或者翻译后修饰过程中，导致细胞功能中变态蛋白质功能的过程包括：分裂、增殖、凋亡、侵入、转移和存活。蛋白质激酶和磷酸酯是控制细胞周期和细胞内分子信号网络的关键，在癌症的发生，发展以及治疗中，它们的功能紊乱扮演了非常重要的角色。

Irish等用急性骨髓性白血病细胞化学疗法前后的相关分析来证明了这个原理。对患者的样品进行了分析发现了重要的信号转导途径，包括STAT和MAPK在样本中有着不同的磷酸化作用，可以分为4种不同的磷蛋白剖面图，而且都有着特殊的诊断指征和化学治疗反应。每一个都有类似的变态细胞生长，包括Flt3突变，这就显示了蛋白质组学如何与基因组学联合应用获得更多的肿瘤生物学图片。

个别肿瘤的大量丰富的蛋白质剖面图可以指导联合分子疗法的决择，在细胞信号传导途径过于活跃或低迷的特殊患者中，在较低的治疗剂量的靶向干预手段就可以有效地控制其活性。笔者利用贝伐单抗――一种单克隆内皮生长因子(VEGF)抗体，联合sorafenib一类RAF抑制剂，通过Ⅰ相研究方法来论证这种假设的可靠性。RAF激酶是VEGF的下游受动器，与加强两个因子的抗VEGF作用相比，笔者选择进行连续地靶向干预VEGF路径。最初，在VEGF路径信号加强的肿瘤中，如：卵巢癌中，两个因子的联合运用，显示出非常好的活性，同时，协同毒性也比单因子治疗剂量的毒性低。治疗前的瘤蛋白质组学分析将调查论证包括RAF激酶在内的VEGF途径是否在患者身上取得较好的治疗效果和是否提供了正确恰当的针对治疗方法。

蛋白质组学的临床实用性是一个仍有待挖掘其潜在作用的新兴领域，它通过用血清或体液蛋白质，找到可诊断的生物标记物或者通过分析一个特殊疾病中的特定蛋白质的变态反应而找到新的治疗方法，它就提供或预示着这种希望。临床蛋白质组学一方面可以预测疾病愈后还需要多少积极地治疗，也可以缩短或减少没有必要的治疗；另一方面，也可以帮助患者决定是否有必要做高风险治疗的需要。另外，临床医生可以利用患者的特异蛋白质组剖面图来合理选择分子疗法，可以蛋白质组学分析来监测疾病的变化。然而，仍然有许多困难需要克服，许多难关需要攻克，比如：笔者一直努力尝试把蛋白质组学研究运用到笔者诊断和治疗范例中。蛋白质组学技术需要进一步发展，精化处理庞大的人类蛋白质组，同时，为了让结果可信和可以重复使用，应该建立统一的实验标准。当这些难关被攻克了，蛋白质组学就能够引导具有最大治疗作用和最小毒性的药物进行个体治疗。

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蛋白质组学范文第4篇

关键词：蛋白质组学；肝癌；双向凝胶电泳

就肝癌而言，蛋白质组学是一种有效的研究方法，其能够从整体，动态，定量的研究肝癌过程中蛋白质的种类和数量的变化，有利于肝癌特异性标志物的筛选，肝癌治疗靶点的确定，判断其是否转移及其术后的转归，进一步深入了解肝癌的发病机制，为其诊断、治疗、预后带来新的思路。

1 寻找诊断标志物和药物靶点

肿瘤标记物是特征性存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质，或是宿主对肿瘤反应而产生的物质，这些物质存在于肿瘤细胞和组织中，也可以存在于体液中。运用蛋白质组学技术研究肝癌，将肝癌患者和正常状态下的蛋白质表达谱进行对比，找到肿瘤状态下表达的蛋白质，作为肝癌早期诊断和预后的特异性标志物，为肝癌的诊断治疗提供新的依据。现在，人们已经在细胞、血清和组织水平三个层面开展了蛋白质组学研究。

1.1细胞水平的研究 任何疾病在出现病理变化之前，细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应的相应的变化。所以通过对细胞的总蛋白进行动态观察可筛选出肝癌的差异蛋白作为标志物。

1.2血清水平的研究 理想的生物学标志应该具有特异、敏感、有预见性、高浓度，在临床前和临床阶段起桥梁作用，可以通过非侵入性操作测定等。因为体液中的蛋白质能够反复的获得，并且包含许多未知的生物学标志，这可能与疾病早期蛋白质水平出现的细微的变化有关，因此，在血清水平寻找生物学标志将是较好的选择。

Comunale等利用蛋白组学技术分析比较了HBV相关肝癌患者和、慢性肝炎患者以及正常人血清，发现部分蛋白核心高度的岩藻糖基化，包括AFP在内的19种岩藻糖基化蛋白明显升高，并且这些岩藻糖基化蛋白在AFP阴性的肝癌患者中也明显升高，其价值可能优于AFP，可以进一步作为肝癌早期检查的血清标志物，为进一步筛选肝癌早期诊断特异性标志物提供了新的研究依据。

2 蛋白质组学在判断肝癌转移中的作用

转移是影响癌症患者生存的首要因素，有人将癌症转移作为本世纪迫切需要迫切攻克的生命科学问题之一。通过不同转移潜能的肝癌细胞株的蛋白建立表达谱，比较蛋白差异，以筛选肝癌转移的出关键蛋白质分子。

S.J.Ding等通过对MHCC97-H和MHCC97-L的蛋白分析，发现了56个有显著差异的蛋白，其中22种在细胞株MHCC97-H中表达增加，36种表达降低，还发现在细胞株MHCC97-L中不表达的四种蛋白，是MHCC97-H的专属表达蛋白。他们还通过进一步的实验发现CK19在肝癌细胞的过表达与其转移相关，由此推测CK19的血清水平可能对某些肝癌患者的疾病进展有一定的影响，所以CK19可能成为预测肝癌转移的有用的标志物，为临床肝癌转移的治疗提供帮助。

3 蛋白质组学在肝癌发展不同分期诊断中的应用

不同分期的疾病有不同的治疗的策略才能达到最佳的治疗效果，寻找不同分期肝癌标志物蛋白，对肝癌患者的不同分期诊断和治疗有重要的指导意义。

本课题组通过双向凝胶电泳技术对中晚期原发性肝癌各组总蛋白进行蛋白质组表达谱的建立，得到重复性较好，背景较为清晰的7cm凝胶电泳图谱，并进行PDQUEST软件比对发现共有10个差异点在两组中有所改变，其中，晚期上调8个，下调2个。预测可能此差异蛋白可能作为不同分期诊断的蛋白标志物，需要进一步的质谱分析和研究。

4 蛋白质组学在肝癌的治疗、术后复发及预防中的应用

目前，手术切除仍然是肝癌治疗的重要手段，肝移植是肝癌可能治愈的主要方法。临床上小肝癌直径小于3cm其术后5年生存率为85%，小于5cm为65%，较大肝癌治疗原则是先进行介入治疗再手术治疗。但是临床上很多患者诊断肝癌时已是晚期，尽管在进行手术治疗的同时，也进行介入治疗、免疫治疗、化学治疗及中药治疗等辅助治疗，但其术后的总体复发率仍很高，是影响肝癌预后的主要因素。肝癌的复发是一个多因素、多环节、多阶段的过程，其确切机制尚不明确。

柏斗胜等将质谱技术应用于肝癌复发组和未复发组的差异表达蛋白研究，得到有定量信息的蛋白有149个，其中在复发组表达上调两倍以上的蛋白共29个，表达下调2倍以上的蛋白共23个，这些蛋白主要参与体内代谢、氧化还原和信号传导等过程。Fiorentino等用免疫组化的方法对依耐性细胞周期素激酶抑制剂p27、E-钙粘连蛋白、β-连接蛋白、细胞周期相关性核抗原（MIB-1）表达水平进行监测，分析这些指标和术后肝癌复发、预后的关联性。研究发现MIB-1增殖指数升高、E-钙粘连蛋白表达降低、核内β-连接蛋白表达是肝癌复发的三个独立的危险因素，三个危险因素同时出现对肝癌转移复发的预测准确率高达99%。

5 现状与发展前景

蛋白质组学研究的是各种动态变化的蛋白质之间以及与疾病之间的相互关系，它作为后基因组时代标志性的新研究领域，已广泛渗入到生命科学和医药领域。蛋白质组学研究范围的不断扩大及其相关技术的不断成熟和发展，为肝癌的诊断、治疗及预后的研究带来了新的思维方式，从组织、血清和细胞整体水平寻找肝癌诊断、转移、发展和治疗的生物学标志。随着蛋白质组学在技术上和理论上的逐步完善以及现代生物技术和信息技术的快速发展，它将在肝癌及其他生命科学研究中发挥越来越重要的作用，为肿瘤的发现、诊断、治疗及预后创造更理想的平台。

蛋白质组学范文第5篇

【摘要】 通过整合差速离心和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativePAGE)技术，建立了能有效分离20S蛋白酶体（20S core particle，CP）的方法。与传统纯化方法比较，此方法具有经济、快速的特点，并且能够对不同组织细胞来源的CP进行分离。利用本方法对人红细胞来源的CP亚基进行了2DE分离和MALDITOF/TOF MS鉴定。结果显示，可鉴定出33个具有不同相对分子量和等电点的蛋白点，此数量远远多于CP亚基的14种。此外，利用非变性/变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（native/SDSPAGE）技术，比较了来源于酵母、小鼠肝脏、人红细胞、人胰腺癌细胞系SW1990和PANC1的CP及其亚基在电泳行为方面的差异，进行了蛋白酶体异质性初探。

【关键词】 蛋白酶体，异质性，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，差速离心，细胞系

1 引言

20S蛋白酶体（20S core particle，CP）以不同的方式与其它蛋白酶体相关激活因子，如19S调节颗粒、11S调节颗粒（又称PA28）和PA200结合（未经特别说明，以下所称“蛋白酶体”包括CP以及CP与上述不同激活因子结合后形成的复合体），介导胞内蛋白降解并参与细胞周期调控、DNA修复、染色体稳定、转录激活、信号转导和抗原提呈等过程[1～3]。CP是一个相对分子量约为700 kDa的蛋白质复合体，由14种亚基组成，分别称为α1～α7，β1～β7，并共同形成一个桶状结构α7β7β7α7。

传统的生化分离方法和基于抗体的免疫亲合层析技术目前仍然是CP分离的主要技术手段。前者作为经典的分离纯化方法，一般涉及选择性硫酸铵沉淀、甘油密度梯度离心以及液相色谱等步骤[4，5]，操作繁琐耗时。免疫亲合层析技术由于其操作简便，并可在数小时内完成，正越来越多地被应用于CP分离[6，7]。然而，免疫亲合层析技术涉及的抗体一般价格较贵，而且对不同物种来源的CP需要使用不同的抗体，限制了对某些物种来源的CP的研究。本研究采用了差速离心结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（nativePAGE）的方法对人红细胞内源性CP进行分离，然后利用蛋白质组学技术对CP各个亚基进行分离和鉴定；此外，利用非变性/变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（native/SDSPAGE）技术对来源于酵母、小鼠肝脏、人红细胞、人胰腺癌细胞系SW1990和PANC1的5种CP进行了蛋白酶体异质性研究。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂和材料

QSTAR XL四极杆飞行时间串联质谱仪（美国Applied Biosystems公司），配有电喷雾离子源（ESI）及Analyst QS 1.1数据处理系统；X'TremeSimple Nano Ultra高效液相色谱系统（美国MicroTech Scientific公司），与QSTAR XL四极杆飞行时间串联质谱仪联用；Autoflex III基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱仪（MALDITOF/TOF MS，德国Bruker Daltonics公司），配有MTP AnchorChip样品靶和BioTool 3.1蛋白搜库软件（含Mascot蛋白搜索引擎的链接：matrixscience.com/）；二维凝胶电泳（2DE）系统（美国GE Healthcare公司），包括Ettan IPGphor III等电聚焦仪及DALTsix垂直电泳设备；超速离心机Optima XL80 （美国Beckman Coulter公司），配有SW 50.1离心转子。

乙腈、甲酸和三氟乙酸（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；α氰基4羟基肉桂酸（CHCA）、牛甲状腺球蛋白（相对分子量约为670 kDa，作为nativePAGE的相对分子量指示标准品）、酸洗玻璃珠（425～600 μm）和AgNO3(SigmaAldrich公司)；红细胞蛋白酶体标准品（含CP和26S蛋白酶体，美国Biomol公司）；测序级胰蛋白酶（罗氏公司）；二维凝胶电泳所需试剂和等电聚焦胶条IPG DryStrip（24 cm，pH 3～10，非线性，美国GE Healthcare公司）。

在常规YPD培养基（含1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖）中培养的CG1945酿酒酵母；2月龄SPF级C57BL/6J小鼠的肝脏；人红细胞（北京市红十字会血液中心）；在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养的人胰腺癌细胞系SW1990；在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养的人胰腺癌细胞系PANC1。

2.2 实验方法

2.2.1 差速离心 在2 g酵母、2 g小鼠肝脏（已碾碎）、2 mL红细胞、2 g SW1990和2 g PANC1细胞中，分别加入4 mL裂解液（40 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（TrisHCl）， pH 7.5）， 5 mmol/L MgCl2， 0.5 mol/L NaCl， 1 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）， 1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）， 10 mmol/L NaF和10 mmol/L Na4P2O7），4 ℃放置1 h（在酵母裂解液中加入酸洗玻璃珠进行机械振荡破碎），然后进行差速离心：115000×g，150 min，吸取上清；再对此上清液进行离心，243000×g，240 min，小心倒去上清液，用300 μL溶液（20 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）， 5 mmol/L MgCl2， 100 mmol/L NaCl， 1 mmol/L DTT）将沉淀重悬后，离心去除不溶物，此上清液即为部分纯化的含CP的蛋白质混合物样本（crude CP，cCP）。

2.2.2 NativePAGE、native/SDSPAGE和2DE nativePAGE按照文献[8]的方法进行。native/SDSPAGE的操作步骤：将经过nativePAGE后含CP的蛋白条带切下，用乙腈完全脱水后，加入50 μL溶液（250 mmol/L TrisCl（pH 6.8），20%甘油，2% SDS，40 mmol/L DTT和痕量溴酚蓝）。再加入300 μL水，静止60 min，吸取上清液，此步骤重复2次。将合并后的上清液真空抽干至一定体积（约50 μL）后，进行12.5% SDSPAGE分离。2DE的操作步骤：CP条带经脱色（50%乙腈和25 mmol/L NH4HCO3）和乙腈脱水后，加入550 μL溶液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2% 3[3(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS），1.2% DestreakTM试剂和0.5% IPG Buffer（pH 3～10， 非线性）），将条带用镊子充分碾碎后再进行第一维等电聚焦电泳分离，之后进行第二维12.5% SDSPAGE分离。

2.2.3 蛋白酶切 切下经nativePAGE分离后的CP银染条带，用15 mmol/L K4Fe(CN)6和50 mmol/L Na2S2O3溶液将其脱色后，再进行胰蛋白酶酶切[9]，并将此酶切上清液进行LCMS/MS鉴定。切下2DE胶上蛋白点，按照文献[9]的方法进行脱色和酶切。

2.2.4 液相色谱串联质谱分析（LCMS/MS） MicroTech Scientific MN15C18WSS75EU反相色谱柱（15 cm×75 μm， 3 μm）；流动相A：2%乙腈和0.1%甲酸水溶液；流动相B：100%乙腈和0.1%甲酸溶液；洗脱条件：0～60 min，5%～20% B；60～90 min，20%～30% B；90～120 min，30%～90% B；流速：0.3 μL/min；QSTAR XL四极杆飞行时间串联质谱仪ESI喷雾电压：2.6 kV；扫描范围： m/z 400～1500；数据依赖性扫描模式（informationdependent acquisition model），即进行1个全扫描后，选择3个信号强度最高的肽段离子进行MS/MS扫描。

2.2.5 基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱（MALDITOF/TOF MS） 取胰蛋白酶酶切后上清液1 μL，点样于MTP AnchorChip靶上，室温自然干燥后，加上1 μL 0.67 g/L CHCA（用含70%乙腈和0.1%三氟乙酸的溶液配制），待完全干燥后进行MALDITOF/TOF MS鉴定。

3 结果与讨论

3.1 CP的分离

为了证明整合差速离心和nativePAGE能有效分离CP，本研究直接对经差速离心后得到的红细胞cCP进行了nativePAGE分离，并用AgNO3染色。如图1A所示，cCP经5.5% nativePAGE电泳1 kV·h后，在泳道cCP中观察到一条带的电泳迁移距离与蛋白酶体标准品中的CP（泳道M）相近。为了证明泳道cCP中的蛋白条带为含CP条带，切下该条带，并进行胶内胰蛋白酶酶切和LCMS/MS鉴定。结果显示，亚基α2序列中的 GYSFSLTTFSPSGK， LVQIEYALAAVAGGAPSVGIK， KLAQQYYLVYQEPIPTAQLVQR和LAQQYYLVYQEPIPTAQLVQR，α3序列中的HVGMAVAGLLADAR，SLADIAR和EEASNFR以及α4序列中的LAAERRNIHK得到了LCMS/MS鉴定，其中GYSFSLTTFSPSGK的MS/MS图谱如图1B所示，表明此质谱鉴定结果是可靠的。以上结果表明，通过整合差速离心和nativePAGE能对CP进行有效的分离。

图1 人红细胞CP的分离以及LCMS/MS鉴定（略）

Fig.1 Isolation and mass spectrometric identification of human erythrocyte 20 S core particle(CP)

(A) CP经5.5% nativePAGE后得到分离（5.5% NativePAGE isolation for CP）; (B) α2亚基序列GYSFSLTTFSPSGK的MS/MS图谱（MS/MS spectrum of GYSFSLTTFSPSGK of subunit α2）。

3.2 CP亚基的蛋白质组学表征

为了证明利用本分离方法得到的CP是由14种亚基组成的完整复合体（α7β7β7α7），以及为了能够利用蛋白质组学技术在亚基水平上研究蛋白酶体异质性（Proteasome heterogeneity），将来自nativePAGE上的CP进行了2DE分离，并将分离得到的亚基进行胰蛋白酶酶切和MALDIMS/MS鉴定。表1为每个蛋白点的质谱鉴定结果，除包含肽质量指纹图谱（Peptide mass fingerprinting，PMF）信息外，还至少有一个肽段得到MS/MS鉴定。如图2和表1所示，经2DE分离和质谱鉴定后，33个具有不同相对分子量和等电点（pI）的蛋白点得到了鉴定，此数量远多于CP亚基的14种，表明其中大部分亚基存在着不同的亚型（Isoform）。如图2所示，除α5， β5和β6外，其余亚基都含有不同的亚型。但此结果并不表示α5， β5和β6不含亚型，因为在对其它物种来源的CP亚基的研究中发现，血吸虫和大鼠肝脏中的α5和β6都存在不同亚型，大鼠肝脏和人红细胞中的β5也存在2种亚型[8，10，11]。产生上述结果的主要原因可能是2DE的pI分辨能力还不足以完全分离细微pI差别的亚型，或者在第一维等电聚焦电泳过程中碱性端（接近阴极）聚焦不好。翻译后修饰、信使RNA（mRNA）选择性剪切、点突变、蛋白质功能性水解和半胱氨酸侧链巯基化学修饰（如磺酸化、丙酰胺化等）等原因使CP亚基在2DE图谱上呈现出多种不同的亚型。

研究证明[4，12]，蛋白酶体也存在多种不同的亚型，并且各种亚型具有不同的物化性质（如相对分子量、pI以及翻译后修饰等）和蛋白降解功能，此现象称为蛋白酶体异质性。Schmidt等[11]通过高分辨率阴离子交换色谱得到了5种CP亚型，对其中2种亚型进行了蛋白质组学分析比较，发现免疫型β亚基在第4种CP亚型中含量较高；Drews等[12]利用自由流电泳技术高分辨率的特点，对小鼠心脏和肝脏内的CP进行pI分离，发现小鼠心脏CP主要集中在pI 5.26，分布范围为pI 5.10～5.33；而肝脏内CP主要集中在pI 5.05，分布范围为pI 5.01～5.29。结合文献报道，蛋白酶体异质性产生的主要原因可能来自以下5个方面：（1）来自不同种属的个体、同一种属的不同个体、甚至同一个体不同细胞组织以及在不同生理或疾病状态下的蛋白酶体（见3.3节）；（2）蛋白酶体亚基存在多种不同的亚型。由于多种不同亚型的存在，使其组装的产物——蛋白酶体也具有多种不同的亚型，此为蛋白酶体异质性产生的主要原因；（3）当β1， β2和β5亚基被免疫型β1i、β2i和β5i亚基取代后，形成的免疫蛋白酶体具有不同的活性和功能；（4）外部调节蛋白（如激酶和磷酸酶等）对蛋白酶体活性和功能具有调节作用[13]；（5）蛋白酶体相关激活因子，如19S调节颗粒、11S调节颗粒（包括PA28α、PA28β和PA28γ）和PA200对蛋白酶体结构和功能的调节作用。

图2 CP亚基的2DE分离（略）

Fig.2 Twodimensional gel electrophoresis(2DE) profiling of CP subunits

表1 上述图2中33个蛋白点的质谱鉴定结果（略）

Table 1 Mass spectrometric identifications of 33 spots of CP subunit isoforms in Fig.2

3.3 5种不同来源CP的蛋白酶体异质性

采用相同的离心条件同时处理酵母、小鼠肝脏、人红细胞、SW1990和PANC1细胞的裂解液，得到5种cCP样本，并对其进行nativePAGE分离。如图3A所示，5种不同来源的CP在nativePAGE胶上表现出不同的电泳迁移率，依次为酵母>小鼠肝脏>红细胞≈SW1990≈PANC1，此结果也充分解释了来自不同种属的CP具有不一样的物化性质（即蛋白酶体异质性），即在相对分子量、带净电荷数或分子大小等方面的差异，导致CP具有不同的电泳行为。将染色的CP条带切下，然后进行第二维12.5% SDSPAGE分离，并采用AgNO3染色，结果如图3B所示。CP亚基相对分子量主要分布在20～30 kDa范围内。哺乳动物来源的这4种CP亚基之间的条带分布无明显差异；但与酵母来源的CP亚基相比较，哺乳动物来源的CP亚基分布在一个较窄的相对分子量范围内（即亚基条带重叠显著），且部分亚基相对分子量比酵母来源的CP亚基大，此差异可能是导致酵母来源的CP在nativePAGE中具有最大电泳迁移率的主要原因。此结果在一定程度上支持了上述关于蛋白酶体异质性产生原因的阐述。此外，除了CP亚基，亦可观察到其它蛋白条带，尤其是在酵母中。这些蛋白可能是正被蛋白酶体降解的底物蛋白，或者是与蛋白酶体相互作用的蛋白。由于该CP分离方法涉及的纯化条件相当温和（包括裂解、差速离心和nativePAGE分离条件），在纯化过程中将可能同时得到与蛋白酶体相互作用的蛋白，它们的存在可能使蛋白酶体的结构或功能发生改变，详尽的结果有待进一步研究证实。

图3 来源于酵母、小鼠肝脏、人红细胞、SW1990和PANC1细胞的CP及其亚基电泳行为比较（略）

Fig.3 Electrophoretic behavior comparison of CPs and CP subunits from yeast， mouse liver， human erythrocytes， SW1990 and PANC1 cells

(A) 5种不同来源的CP经5.5% nativePAGE后得到分离（5.5% NativePAGE isolation for 5 CPs）; (B) 将得到的CP进行第二维12.5% SDSPAGE分离（Second dimensional 12.5% SDSPAGE separation for CP subunits）尤其酵母来源的CP其电泳迁移率远大于其它种属来源的CP。

4 结论

通过整合差速离心和nativePAGE技术，对5种不同来源的CP进行了分离，表明本方法适合于分离不同组织细胞来源的CP，兼具快速、经济和有效的特点。而且，本研究利用蛋白质组学技术对CP亚基进行了分离和鉴定，并对蛋白酶体异质性进行了初步探讨。此研究结果为进一步阐明蛋白酶体的结构和功能提供了分子理论基础。

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