本文作者：丹彤包秋华孟和毕力格王俊国张和平作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

乳酸细菌广泛分布于自然界中，是一类利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌通称。传统发酵乳食品中分离的乳酸菌一般被认为是安全的细菌，早在人们认识乳酸菌之前，就已将其广泛应用于发酵酸乳、制作奶酪、食品防腐、保藏等方面。这些乳酸菌在酸奶发酵过程中产生多种代谢产物，包括乳酸、胞外多糖、风味物质以及人体营养所必需的多种维生素等。这些菌体及其代谢产物具有改善乳制品的风味，提高制品营养价值，调节肠道菌群平衡，维持和保证肠道菌群最佳优势组合及稳定性，抑制肿瘤和免疫赋活等生理功能[1]。酸奶是以新鲜的牛奶为原料，经过2种或2种以上的乳酸菌发酵制成的产品。目前，主要应用于酸奶制造的乳酸菌发酵剂有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。这2种发酵剂在酸奶发酵过程中相互作用，产生的代谢产物赋予发酵乳特有的风味、质地、口感和营养价値。发酵乳中风味物质的成分及含量受诸多因素的影响，其风味物质的形成主要受原料中成分、加工过程中条件变化及发酵剂种类的影响。为了提高乳酸菌在发酵过程中生产主要风味物质乙醛、双乙酰的能力，国内外一些学者对乳酸菌合成乙醛、双乙酰的代谢途径及其代谢调控方式开展了大量的研究工作。这篇综述主要描述了乳酸菌在酸奶发酵过程中产生的风味物质，以及主要风味物质乙醛、双乙酰的代谢途径和其调控机制。

1酸奶发酵剂生产的风味物质

乳酸菌在碳水化合物的代谢过程中能生产乙醛、丙酮、乙偶姻、双乙酰等多种挥发性芳香化合物[2]。这些风味物质主要由挥发性、非挥发性酸以及羰基化合物组成，其中，羰基化合物对发酵乳的风味有显著影响。在单一乳酸菌发酵的发酵乳中，主要羰基化合物的含量为乙醛(2.0~41.0μg/mL)、双乙酰(0.2~2.3μg/mL)、乙偶姻(2.2~28.2μg/mL)、乙醇(0.2~9.9μg/mL)以及丙酮(1.8~3.4μg/mL)[2]。这些羰基化合物在发酵乳中的含量和种类决定着产品的风味。在酸奶的发酵过程中乳酸菌生产的风味物质种类繁多，除上述风味物质之外，还有很多生产量很低的芳香化合物。这些芳香化合物因为嗅觉阈值的差异，很难评价它们在形成酸奶风味中的作用。Ott等[3]在酸奶中首次发现了有强烈气味的1-辛烯-3-酮、1-壬烯-3-酮、3-甲硫基丙醛、2-甲基四氢噻吩-3-酮、2E-壬烯醛以及愈疮木酚等6种化合物。在这项研究中，作者首次使用光谱分析法鉴定了1-壬烯-3-酮。1-壬烯-3-酮在酸奶中的含量很低，但由于1-壬烯-3-酮在酸乳中很低的香气阈值并不影响该化合物在形成酸奶风味中的作用。乙醛是乳酸菌在酸奶发酵过程中产生的特征风味物质，在酸奶中的含量要远远高于其他挥发性芳香化合物。目前，国内生产的酸奶主要是以乙醛风味为主的醛香性酸奶。在形成发酵乳制品的滋味与香味的风味物质中，双乙酰(又名丁二酮)也被认为是起关键作用的重要芳香化合物之一，是奶油、干酪、奶酪、酸奶以及很多需要奶油味的非乳产品中的一种重要风味物质。一般认为，酸奶中主要风味物质乙醛由保加利亚乳杆菌发酵产生，双乙酰由嗜热链球菌发酵产生[4]。当酸奶中乙醛含量低时，双乙酰在发酵乳中占主导地位，形成具有独特奶香味的发酵乳[5]。Rysstad等[6]发现在山羊乳酸奶中乙醛含量明显低于普通酸奶，而双乙酰的含量和普通酸奶中的双乙酰的含量基本相同，说明在山羊乳酸奶的风味物质中，双乙酰是起关键作用的重要芳香化合物。目前，关于酸奶风味物质的代谢调控研究主要集中在乙醛、双乙酰等主要的风味物质上。

2乙醛的合成途径及其基因调控

发酵乳中乙醛的含量是评价酸奶质量的重要指标之一。早在1950年Pette等[7]就提出了乙醛是形成酸奶风味物质的主要成分。Hamdan等[8]也得出了类似结论，指出高浓度的乙醛是形成酸奶良好风味的重要前提。Sandine等[9]报道了在发酵乳中乙醛的浓度只有高于8mg/L时，才能产生具有良好风味的发酵乳。发酵剂菌株的质量和活力对酸奶质量及酸奶中风味物质的含量起着关键性的作用。利用基因工程和代谢工程技术改良现有的发酵剂菌株，构建高产乙醛的菌株，是国内外研究学者关注的焦点之一。

2.1乙醛的合成途径

在乳酸菌生产乳酸的发酵过程中，乙醛可由氨基酸、核酸及丙酮酸代谢产生(图1)。在乳酸菌的碳代谢过程中，丙酮酸是重要的代谢中间产物。乳糖经糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶(PDC)的催化作用下合成乙醛。丙酮酸还可在甲酸裂解酶(PFI)和丙酮酸脱氢酶(PDH)的催化作用下，转化成乙酰辅酶A，生成的乙酰辅酶A在乙醛脱氢酶(ADH)的催化作用下，生成乙醛。在酸奶发酵过程中乳酸菌生产乙醛的代谢途径和菌体自身的酶有关。例如丙酮酸脱羧酶多发现于酿酒酵母和运动发酵单胞菌中，在酸奶发酵剂保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌中几乎没有关于丙酮酸脱羧酶的报道。Raya等[10]在2株保加利亚乳杆菌和2株嗜热链球菌中，都没有检测出丙酮酸脱羧酶活性。说明在酸奶发酵过程中，丙酮酸生成乙醛或丙酮酸经由乙酰辅酶A生成乙醛的代谢途径可能不存在。脱氧核糖5-磷酸在脱氧核糖醛缩酶(DERA)的催化作用下生成乙醛和3-磷酸甘油醛，并且这个催化过程是可逆的。很多菌种都有关于具有脱氧核糖醛缩酶的报道。Kim等[11]对来源于类芽孢杆菌的脱氧核糖醛缩酶做了详细研究。该酶和来源于地芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌的脱氧核糖醛缩酶有很高的同源性。酶学性质测定的结果表明，当培养基中乙醛浓度为100mmol/L时，脱氧核糖5-磷酸的产量达到最高，说明脱氧核糖醛缩酶能催化脱氧核糖5-磷酸和乙醛之间的转化。Raya等[10]也报道了在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的发酵过程中检测出明显的脱氧核糖醛缩酶活性，说明在酸奶发酵过程中，脱氧核糖5-磷酸生成乙醛的代谢途径可能存在。在酸奶发酵过程中有些氨基酸先转化成中间体代谢产物丙酮酸然后合成乙醛，但也有些氨基酸如苏氨酸在苏氨酸醛缩酶(TA)酶的催化作用下可直接降解生成乙醛。其中，苏氨酸生成乙醛被认为是乳酸菌生产乙醛的主要代谢途径。苏氨酸醛缩酶广泛存在于自然界生物体内，在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌中均有关于具有苏氨酸醛缩酶活性的报道。国内外一些研究学者把研究乙醛代谢途径的焦点集中在苏氨酸醛缩酶上，对苏氨酸醛缩酶的调控做了大量的研究工作。在乙醛的代谢途径中，乙醛在乙醛还原酶(ALDH)催化作用下生成乙醇，降低酸奶中乙醛的含量。Koo等[12]对肠膜明串珠菌的乙醛还原酶和乙醛脱氢酶做了详细的研究。认为在肠膜明串珠菌中，乙醛还原酶和乙醛脱氢酶醛是一个多功能酶(醛醇脱氢酶，ADHE)，编码醛醇脱氢酶的adhE基因全长2685bp，编码886个氨基酸，序列分析的结果表明该酶的氨基酸序列和其他已发表的氨基酸序列有很高的相似性。在推导出的醛醇脱氢酶氨基酸序列上发现2个保守区域，分别编码乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛还原酶(ALDH)。Koo等[12]还将adhE基因克隆到表达质粒中，然后转入到EscherichiacoliBL21，构建了醛醇脱氢酶基因工程菌。酶活检测结果表明，醛醇脱氢酶具有乙醇脱氢酶和乙醛还原酶的活性。在其他乳酸菌中也有很多关于乙醛还原酶和乙醛脱氢酶活性的报道。Raya等[10]在2株保加利亚乳杆菌和2株嗜热链球菌的发酵过程中都没有发现明显的乙醛脱氢酶活性，但从其他2株嗜热链球菌中却检测出明显的乙醛还原酶活性。说明在一些嗜热链球菌中，生产的乙醛有可能作为中间产物在乙醛还原酶的催化作用下被还原成乙醇，从而降低发酵乳中风味物质的含量。

2.2乙醛的基因调控

苏氨酸在苏氨酸醛缩酶的催化作用下生成乙醛的代谢通路被认为是乳酸菌生成乙醛的主要代谢途径，受到国内外一些研究学者的广泛关注。Chaves等[13]报道了在嗜热链球菌中，具有苏氨酸醛缩酶活性的丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)能催化苏氨酸和甘氨酸、乙醛之间的相互转化。Chaves等在培养基中补充适量的L-苏氨酸，发酵后乙醛的含量明显增加，说明在这项研究中使用的嗜热链球菌具有苏氨酸醛缩酶的活性，在发酵过程中能过分解过量的L-苏氨酸生成乙醛。在这项研究中作者还构建了编码SHMT的glyA基因缺陷菌株，发现glyA基因缺陷菌株在酸奶发酵过程中乙醛生成量明显低于野生菌株，说明苏氨酸生成乙醛的代谢途径是乳酸菌生产乙醛的主要代谢途径。苏氨酸醛缩酶的活性很不稳定，容易受外界条件的影响。Lees等[14]报道了当培养温度从30℃上升到37℃或42℃时，嗜热链球菌苏氨酸醛缩酶的活力明显下降，而保加利亚乳杆菌苏氨酸醛缩酶具有耐热性，在42℃的培养条件下，依然能保持很高的活力。酸奶的发酵一般是在43℃培养温度下进行，在这个培养温度下，保加利亚乳杆菌苏氨酸醛缩酶的活力要高于嗜热链球菌苏氨酸醛缩酶的活力，一般认为酸奶发酵过程中生产的乙醛主要来源于保加利亚乳杆菌。在乙醛代谢途径中，还有一些关键酶在乙醛代谢过程中起着调控作用。Bongers等[15]在乳酸乳球菌中成功地表达了来源于运动发酵单胞菌中的pdc基因(编码丙酮酸脱羧酶)和来源于乳酸乳球菌的nox基因(编码NADH氧化酶)，大幅度提高了发酵乳中乙醛的产量。目前，对乙醛基因工程方面的研究主要集中在glyA、pdc、nox等几个主要基因的调控上。在一些乳制品中，在发酵过程中产生的乙醛容易被乙醛还原酶还原成乙醇，降低了乳制品中乙醛的含量。因此，利用现代生物技术改变乳酸菌中乙醛的代谢通路，在筛选、构建乙醛还原酶缺陷型菌株的基础上，过量表达一些关键基因，可以提高乳制品中乙醛的产量。当然，这些尝试也为酸奶、奶酪等乳制品的开发提供广阔前景。

3双乙酰的合成途径及其基因调控

双乙酰作为酸奶中主要风味物质，在形成酸奶风味中起着重要作用。双乙酰一般由嗜温乳酸球菌生产，包括乳酸乳球菌丁二酮亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、链球菌和热链球菌等[4]。但也有学者认为在酸奶发酵过程中保加利亚乳杆菌是生产双乙酰的主要菌株[8]。目前，关于乳酸菌风味物质双乙酰的研究工作大多集中于双乙酰的合成途径及其产量调控上。

3.1双乙酰的合成途径

在乳酸菌中生成双乙酰的代谢途径主要有柠檬酸代谢途径和糖酵解代谢途经。一些乳酸菌特别是乳球菌能利用乳糖、柠檬酸生成丙酮酸，再合成双乙酰(图1)。在乳糖合成双乙酰的代谢途径中，过量的丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶(α-ALS)的作用下合成α-乙酰乳酸乳酸。α-乙酰乳酸在酸性条件下，化学氧化脱羧生成双乙酰。双乙酰很不稳定，在双乙酰还原酶(AR)的催化作用被还原为乙偶姻。在柠檬酸生成双乙酰的代谢途径中，丙酮酸和α-乙酰乳酸是重要的中间产物。柠檬酸在柠檬酸裂解酶的催化作用下生成草酰乙酸，草酰乙酸可直接生成α-乙酰乳酸，也可通过脱羧反应生成丙酮酸。丙酮酸进一步脱羧生成活性乙醛(乙醛-TPP)，活性乙醛与丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶作用下合成α-乙酰乳酸,通过化学氧化脱羧作用生成双乙酰。α-乙酰乳酸也可在α-乙酰乳酸脱羧酶(α-ALDC)的作用下脱羧生成乙偶姻。由于牛奶中柠檬酸的含量很低，一般认为发酵乳中的双乙酰主要通过糖酵解代谢途径生成。

3.2双乙酰的基因调控

在酸奶发酵过程中双乙酰产量和几个关键酶的活力密切相关，这些酶包括：柠檬酸裂解酶(ACLY)、草酰乙酸脱羧酶(OXAD)、α-乙酰合成酶、NADH氧化酶(NOX)、α-乙酰乳酸脱羧酶、双乙酰还原酶等。运用分子生物学技术使这些酶失活或超量表达，能增加中间产物丙酮酸、α-乙酰乳酸的积累，能改变双乙酰代谢途径，提高双乙酰的产量。其中，国内外一些学者为了改变α-乙酰乳酸流向乙偶姻的代谢通路，把研究的重点集中在筛选、构建一些α-乙酰乳酸脱羧酶缺陷型菌株上。Aymes等[16]用随机诱变的方法筛选出α-乙酰乳酸脱羧酶缺陷型的乳酸乳球菌丁二酮亚种菌株，在厌氧条件下，双乙酰的产量要远远高于野生菌株双乙酰的产量。Monnet等[17]为提高嗜热链球菌双乙酰的产量，在添加α-酮基丁酸、亮氨酸或α-酮基丁酸、亮氨酸、异亮氨酸的培养基上，用定向突变方法挑选出α-乙酰乳酸脱羧酶缺陷型的嗜热链球菌。在微氧条件下，α-乙酰乳酸脱羧酶缺陷型菌株双乙酰的产量比野生菌株提高了近3倍。一些研究学者在筛选、构建α-乙酰乳酸脱羧酶缺陷型菌株的基础上，还对上述的一些调控双乙酰生产的关键基因进行超量表达，运用联合调控等方法对提高双乙酰的产量进行了尝试。Hugenholtz等[18]在α-乙酰乳酸脱羧酶缺陷型的乳酸乳球菌中，在有氧条件下超量表达调控NADH氧化酶的nox基因，大幅度提高了双乙酰的产量。目前关于双乙酰的基因调控的研究大多集中在糖酵解、柠檬酸代谢途径的一些关键基因的调控上，随着这些研究的深入应该能生产出更多符合消费者需求的新产品。

4存在的问题及展望

在酸奶生产过程中，发酵剂的作用非常重要，是酸奶产品产酸和产香的基础和原因。酸奶质量的好坏主要取决于酸奶发酵剂的品质类型及活力[19]。通常使用的酸奶发酵剂保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在代谢过程中能维持良好的共生关系，使酸奶获得良好的风味。但两个菌种的许多菌株也存在着不同程度的拮抗作用，在代谢过程中会产生有机酸、双乙酰、过氧化氢、细菌素等生长抑制因子，影响发酵剂的平衡生长，导致嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌间表现出非协同生长的现象，影响酸奶的风味质量。酸奶的风味不仅受发酵剂种类的影响，还受接种量、培养条件以及风味物质的种类、含量和比例的等多各种因素的影响[20]。虽然酸奶中发酵剂仍存在一些问题，但随着人们对乳酸菌风味物质代谢途径的深入了解及分子生物技术的发展，利用基因工程手段改良现有的发酵菌种和挖掘新的发酵菌种，选育出能适合工业化生产的优良发酵剂菌株，不断提高酸奶的风味质量，促进乳制品工业的发展。