煎饼是中国传统食品之一。目前对于煎饼的研究多围绕新产品的开发，生产过程中仍采用自然发酵，导致生产周期长、发酵过程不易控制、产品质量不稳定等问题。由于多采用传统作坊式生产，卫生状况也跟不上现代食品企业的卫生要求，使得这种具有鲜明文化特色的传统食品长期处于原始落后的发展阶段[1]，亟待实现其产业化生产。国内外对食品中的微生物的分离鉴定已进行了一些研究，如酱油[2]、传统米酒、绿橄榄[3]。发酵是煎饼生产中的重要环节，对煎饼风味形成和产品质量有重要影响。酵母菌是发酵煎饼生产过程中重要的微生物，其具有改善产品风味、延缓酸败、增加营养成分及抗淀粉老化等作用。姚岭柏[4]、庞彰等利用微生物酶浸泡荞麦米饭能提高米饭的糊化度，使米饭抗老化能力提高。OLESENPT[5]等分别用翰逊氏德巴利酵母和产阮假丝酵母生产发酵香肠，发现其有助于促进风味的形成。本研究旨在通过对煎饼自然发酵糊中的酵母菌进行分离鉴定，以获得适合发酵煎饼规模化生产的优良菌株[6]。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1试验材料

煎饼发酵糊采自本溪寨香生态农业有限公司煎饼生产车间的以大米、大豆、玉米、小米为原料的杂粮发酵煎饼。分离纯化培养基：YPD培养基(酵母浸出粉-蛋白胨-葡萄糖-琼脂培养基)、麦芽糖培养基、玉米粉琼脂培养基、PDA培养基。理化鉴定培养基：糖发酵培养基、碳源同化培养基、氮源同化培养基、无维生素培养基、产类淀粉培养基、高葡萄糖培养基、尿素分解培养基。

1.1.2试验仪器

HG303-恒温培养箱、Gl01-1A型电热鼓风干燥箱：南京实验仪器厂；立式高压蒸气灭菌锅；数显恒温水浴箱：北京市光明医疗仪器厂；PHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪器厂；OLYMPUS显微镜；DL-CJ2v单面净化工作台；720型分光光度计：尤尼柯仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1酵母采集和扩大培养

将无菌操作采集的样品ZX-2010，浸入灭好菌的YPD液体培养基中，于25℃进行72h扩大培养[7]。

1.2.2酵母菌分离纯化

利用梯度划线法在YPD固体培养基上进行划线分离，分离纯化3代。再改用稀释梯度分离法，用0.9g/100mL生理盐水进行稀释，稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66个梯度，然后在YPD平板上用玻璃推子将菌液推平，每种涂3个平板，28℃培养72h。从平板中挑取单个菌落进行平板划线分离，28℃培养72h，镜检后，挑取形态不同的单菌落转接5次，所得菌种接于斜面试管培养基于4℃冰箱保藏。

1.2.3酵母菌形态学观察

采用美兰染色法，观察菌落大小，菌落质地、菌落颜色、菌落表面特征、菌落边缘、隆起度等特征[8]；子囊孢子形态观察[9]、掷孢子的形成观察、假菌丝的观察、无丝状营养细胞的显微镜观察[8]。

1.2.4碳源同化试验

液体试管法：每管加无碳基础培养基5mL，加被测试的碳源(蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙醇、可溶性淀粉、D-木糖、半乳糖、甘油、柠檬酸、乳酸、肌醇、海藻糖)。接入新鲜菌液1mL，25℃培养1周后，观察。

1.2.5氮源同化试验

将测试酵母进行饥饿培养，以消耗细胞内多余的氮源，防止出现假阳性结果。将活化好的菌株接种在无菌碳基础培养基上，加入被测氮源(亚硝酸钠、硝酸钾、赖氨酸)，25℃培养5d。

1.2.6糖发酵试验

将葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、海藻糖、纤维二糖等6种糖，分别用酵母发酵，25℃培养2周，观测其发酵结果。

1.2.7其他生理生化试验

无维生素培养试验，高糖培养试验，产类淀粉试验，尿素分解试验[8]。

1.2.8酵母菌耐酸能力测定

将YPD液体培养基调节pH值为3、4、5、6、7分别接种分离酵母菌，28℃培养72h，以未接种的各酸度培养基作空白，于波长560nm处测定A值[10]。

1.2.9酵母菌糖化能力的测定

将分离到的菌株，分别制成质量分数为5%的酵母浸出溶液后，用DNS法测糖化酶活力[11]。分别取1mg/mL葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8mL加入DNS试剂2mL，沸水浴加热2min，冷却，在540nm波长下测定吸光度A值，制成葡萄糖标准曲线。用1%淀粉液、缓冲液、蒸馏水、酵母浸出液稀释后加入DNS试剂混合，沸水加热2min，在540nm波长下测定吸光度A值。从标准曲线查出葡萄糖浓度数，求出糖含量。

2结果与讨论

2.1结果

2.1.1菌株的形态学鉴定

煎饼糊经过自然发酵，采用YPD培养基从样品中共分离纯化出5种优势酵母菌株，分别标记为1#、2#、3#、4#、5#，观察分离菌株的菌落及菌体形态特征，结果见表1。酵母菌的菌落形态均为圆形，表面大多光滑湿润有光泽、边缘整齐、菌落均呈乳白色、不透明，菌体多为圆形或椭圆形。各菌株均有芽殖现象，且均有假菌丝，均不产生掷孢子。

2.1.2酵母菌的生理生化鉴定

样本ZX-2010分离纯化菌株的糖发酵试验见表2，碳源同化试验见表3，氮源同化试验见表4，其他生理生化试验见表5。其中3#、5#半乳糖同化阳性、硝酸盐同化反应阴性、无维生素不生长、不分解尿素等特征符合假丝酵母属的特征；1#号赖氨酸同化阴性、硝酸盐同化反应阴性、尿素水解阴性等特征符合酿酒酵母特征；2#葡萄糖发酵阴性、淀粉生长阳性符合褶皱酵母特征；4#无维生素生长阴性符合发酵毕赤酵母特征；3#淀粉生长阳性、0.01%放射菌酮生长阳性等符合热带假丝酵母特征。根据上述菌落和菌体的形态学鉴定以及生理生化试验结果，对照《酵母菌的特征与鉴定手册》[8]对酵母菌进行鉴定，结果为1#菌为酿酒酵母，2#菌为褶皱假丝酵母，3#菌为热带假丝酵母，4#菌为发酵毕赤氏酵母，5#菌为滑假丝酵母。

2.1.3酵母菌耐酸能力的测定

在煎饼发酵过程中，酵母菌往往需要耐受杂菌所造成的酸性环境，通常发酵煎饼糊的最终pH值可降到4。因此试验测定酵母菌在不同pH值下生长情况，可以更好地了解其对酸性环境的耐受能力结果见图1。如图1可见，酵母菌在pH值为3时均不生长，最适条件都在pH值为5~6。其中1#、2#、3#菌株长势较好，而其他菌株都受到不同程度的影响。因此选择1#、2#、3#适合作为发酵煎饼发酵菌。2.1.4酵母菌糖化活力的测定煎饼经发酵后产生的糖的含量直接影响煎饼的风味和口感，因此酵母菌的糖化能力是鉴定酵母菌株的重要指标，酵母菌糖化所得到的葡萄糖含量见表6。如表6所示，1#、2#、4#产糖量分别为0.854、0.639、0.716mg/mL，产糖能力明显高于其他菌株。

2.2讨论

自然发酵属于多菌种混合发酵，含有多种酵母菌，发酵过程中多种微生物共同作用产生丰富的风味物质[12]。发酵煎饼中的主要微生物所产生的代谢产物具有类脂酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等酶活性。酵母菌的脂肪酶和蛋白酶能分解原料中的脂肪和蛋白质，有利于煎饼摊制成型的形成。其中酿酒酵母的数量最多，酿酒酵母也广泛存在于传统发酵食品中[13-14]，如面包、香肠等面食及肉食品中，酵母菌有利于改善谷物发酵制品的风味和口感，去除发酵制品的不良风味，而且能改善产品的风味和延长保质期。发酵煎饼中的酵母菌也有类似的作用，酵母菌等含有丰富的α-淀粉酶和糖化酶，发酵过程中酵母菌产生的酶将淀粉分解成各种糖类物质，发酵过程降解淀粉产生醇、酸、酯、醛、酮等多种风味物质[15-16]，使发酵煎饼经摊制后有自然的发酵香味，同时发酵过程产生的淀粉酶使一部分淀粉分解成葡萄糖，在煎饼摊制过程中与蛋白质发生美拉德反应也使煎饼的色泽更加诱人。这就是发酵煎饼品质优于不发酵煎饼的原因之一。

酵母菌除了对风味有明显的影响外，在加工性质及保藏品质方面也有积极的影响[17]。发酵过程可以一定程度上降低煎饼糊的黏度，使其在加工时减少搅拌阻力，有利于煎饼摊制成型。淀粉经过发酵，一部分淀粉粒分解成小分子的多糖和单糖，降低了淀粉的糊化温度[18]，在煎饼摊制的过程中减少加热时间。在保藏中可延长产品保质期，延缓产品老化。通过对分离结果分析表明，煎饼自然发酵糊中的主要微生物为酵母菌，因此发酵温度保持在28~30℃，酵母菌的生长最旺盛，发酵效果最好，也能有效地控制杂菌的生长，防止发酵煎饼糊酸度过大抑制酵母菌的生长，从而减少杂菌对煎饼的风味和口感的影响[19]。

3结论

从自然发酵煎饼中分离鉴定出的5种优势菌株分别是酿酒酵母、褶皱假丝酵母、热带假丝酵母、发酵毕赤氏酵母、滑假丝酵母。通过耐酸能力和糖化能力测试，酿酒酵母、褶皱假丝酵母、热带假丝酵母、发酵毕赤氏酵母作为发酵煎饼的适合的发酵菌株。