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克隆技术范文精选

克隆技术

克隆技术范文第1篇

一、克隆技术的发展使克隆人成为可能

上世纪初,韦伯(H.J.Webber)创造了“克隆”这一词,其含义指由单个祖先个体经过无性繁殖而产生的其他个体。由于该词构词简短,容易发音,能清晰表达出准确的意思,因此这一术语很快得到学术界的认同并加以广泛使用[1](P.160)。1952年,科学家开始用青蛙进行克隆实验。从此以后,动物克隆的试验结果不断涌现。1970年克隆青蛙实验取得突破,青蛙卵发育成了蝌蚪。1984年第一只胚胎克隆羊诞生。1997年2月24日,英国罗斯林研究所的科学家用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊。1998年7月,日本科学家利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生。2000年1月,美国科学家宣布克隆猴成功。2000年3月14日,曾参与克隆小羊“多莉”的英国PPL公司宣布,他们成功培育出5头克隆猪。

随着一系列克隆技术突破的完成,克隆人从技术上来讲已成为可能。有的科学家认为,从技术上说克隆人并不比克隆其他哺乳动物更困难。克隆人即将出世的消息也不断传来。意大利著名的“克隆狂”安蒂诺里曾宣布,克隆胎儿将于2003年1月问世。2003年第一期《发现》杂志也把2002年“命名”为“克隆年”,理由是克隆技术在当时已经进入了克隆人的阶段。该杂志断言:“虽然世界不想要克隆人,但克隆人却将要出现。”

但是至今我们没有见到克隆人的问世,原因是尽管克隆技术出现了长足的进步,但是仍然存在着一些目前尚没有解决的问题。在理论上,分化的体细胞克隆对遗传物质重编(细胞核内所有或大部分基因关闭,细胞重新恢复全能性的过程)的机理还不清楚;克隆动物是否会记住供体细胞的年龄,克隆动物的连续后代是否会累积突变基因,以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。在实践中,存在着低着床率、高流产率的问题,维尔穆特研究组在培育“多莉”的实验中,融合了277枚移植核的卵细胞,仅获得了“多莉”这一只成活羔羊,成功率只有0.36%,同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7%和1.1%。此外,生出的许多个体表现出生理缺陷或畸形。以克隆牛为例,日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去[2]。观察结果表明,部分牛犊胎盘功能不完善,其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平;有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育;克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向,这些都可能是死亡的原因。

虽然存在各种各样的问题,但几年来克隆技术的发展表明,世界各科技大国都不甘落后,谁也没有放弃克隆技术研究。同时,克隆人的出现越来越成为可能,人们对其可能产生的伦理问题表现出了空前的担心。

二、克隆技术带来的伦理问题

人们对克隆人可能带来的社会伦理的担心由来已久。1978年科幻小说家D·罗维克写了一本书《克隆人》。书中描述了一位67岁的富商,独身而没有子女。他对遗传工程非常感兴趣,并且了解了科学界没有对外公开的可能引起争议的一系列试验。他愿意花费巨资制造一个他自己的复制品。他找到了愿意为他做克隆人的医生和生物学家,并最终在1976年成功地克隆了一个健康的小男孩。这本书引起了整个西方社会的轰动。这以后人们对克隆人所可能产生的后果更加忧虑。诺贝尔奖获得者乔舒亚·雷德贝格博士认为“在哺乳类或人类中完成这项工作绝不会有特殊困难”,但是“它把人类推到了一场进化上的大骚乱的边缘”[1](P.170)。法国国家医学科学院在1997年6月5日通过决议,认为“克隆体必将构成对人类尊严的侵犯,他将不再被视为一种目的而成为一种手段,我们不再称其为人,而将其视为一种可供操作的物件,它还与以多样性为依托的生物法则格格不入,正是这一多样性促进了人类的进步”。综合起来考虑,我们认为克隆人可能带来如下一系列的伦理问题:

1.用人体来做实验时产生的伦理问题

克隆人的过程中,首先需要将一个体细胞的细胞核取出与一个去掉细胞核的卵子结合,然后将这个卵子植入母体发育。这里首先有一个人的胚胎实验问题。国外某些伦理学家认为这侵犯了人的胚胎的权利,特别是当这种研究用于非治疗性目的时更是如此。也有一部分人认为早期胚胎根本不是人的个体,不存在什么利益需要保护,不存在什么尊严需要尊重[3](P.137)。笔者认为即便这里不存在个人胚胎的权利尊严利益问题,也存在一个全人类的尊严的问题。这里的尊严不仅仅是对人类的尊重,还涉及到人类的生存问题,规避重大灾难的问题。人类繁衍至今,还从来没有自己通过技术制造自己,那只是传说中的女娲和圣经中的上帝干过的事情。这样做产生的后果是什么?我们怎样去把握它?这些都需要伦理学做出深入的研究,规避技术可能带来的重大灾难也正是现代伦理学的任务之所在。

进而当把这个进行无性生殖的卵子或胚胎植入母体让他成长发育时,其他一系列的伦理问题就又产生了,这主要涉及妇女儿童的权益与尊严问题。在用动物做实验时,一些动物保护主义者和一些伦理学家甚至认为存在着伦理问题,认为这给动物带来了痛苦,伤害了它们的感情。法国国家农学研究院2000年10月21日制定的动物实验伦理学章程中规定:动物是具有感受性的生命体,并具有认知能力与情感。它们具有感受痛苦的能力。从事动物实验者有义务保障它们的身体和待遇状况不受无谓的威胁。避免使它们遭受无价值的痛苦应是实验者思考问题的前提。对人来讲,这个问题就更加突出。如果用人体来做实验,可能伴随着大量的流产问题,这将给这些妇女带来痛苦和伤害;也可能克隆出比例很高的不正常人,比如怪胎、生理上有遗传缺陷的人,这些不幸的事情事先难以预测和阻止。而这些都会给当代或下代人以及社会带来痛苦和负担。这和生物医学伦理中的不伤害原则发生了冲突。这些问题的解决需要技术的大幅度提高和完善。

2.有关人类价值的问题

即使现代分子生物学技术可以使人的基因得以重组优化而能够复制出一些社会精英来,可是技术是一把双刃剑,既然能复制出正面人物,也同样能复制出反面人物。也可能被一些别有用心的人用来复制出大批他可以加以利用的人来,这样他就充当了造物主的角色,克隆出来的人成了他的工具,从而人的价值和尊严也将荡然无存。从伦理学来看,这种克隆人导致的人自身不被看作是目的,而沦落为一种工具,无疑是对人的尊严的一种挑战,康德认为人“要这样行动,以便将人类,包括你自己及其他所有的人,永远只当作目的而不是单纯的手段”[4](P.372)。而这种目的的克隆正是把人当作工具和手段,是不符合伦理学原理的。从技术价值的角度来看,科学技术是人类征服和改造自然的工具,是用来为全人类谋求福祉的,它的价值也在于此。现在用克隆技术产生出个别人要加以利用的人来,这样的话,人性即将被改变,科学技术对全人类的价值将不复存在。

马克思主义创始人关于人的价值的思想,正是从批判把人工具化、手段化,把人降格为物的角度提出的。马克思抨击私有制(尤其是资本主义)贬低人的价值和尊严时写道:“对我来说,你是生产那在我看来是目的的物品的手段和工具,而你对我的物品也具有同样的关系。……我们每个人实际上把自己变成了另一个人心目中的东西;你为了占有我的物品实际上把自己变成了手段、工具、你的物品的生产者”[5](vol42,P.36)。显然,马克思反对把人工具化、手段化。马克思主义主张人的尊严应当受到尊重,认为它是历史的产物并且随历史的发展而发展。马恩强烈批判资本主义的工业社会将人异化为机器的奴隶,成为少数人谋取利益的工具,而认为人类本身的自由和全面发展应该是人的自身的目的或人的本质。马克思说“一个种的全部特性、种的类的特性就在于生命活动的性质,而人的类特性,恰恰就是自由的自觉的活动”[5](vol42,P.96)。他主张建立一个与“人类本性”相一致的、将人当作真正目的的未来社会。他写道:在这个必然王国的彼岸,作为目的本身的人类能力的发展,真正的自由王国,就开始了[5](vol25,P.927)。当克隆技术成熟的时候,我们能不能正确使用它来为人类服务,从人出发而复归为人,以人为本,这将是对我们的考验。

3.当代人的选择和克隆人的社会定位问题

从理论角度讲,我们可以使用基因重组技术把我们认为是决定好的性状的基因组合起来,从而产生出我们认为最优秀的人。在这里一个伦理问题又产生了,所谓的“好”是我们当代的理解,是我们自己现时的标准。下一代人和我们具有同样的理解吗?答案是否定的。德国著名哲学家伽达默尔阐述了视界的不同和变化的问题。有无数不同的视界,造成不同的理解和判断。而又绝不会有封闭的视界。在他看来,“人类生活的历史运动在于这个事实,即它决不会完全束缚于任何一种观点,因此,绝不可能有真正封闭的视界。倒不如说,视界是我们悠游于其中,随我们而移动的东西”[6](P.768)。所以我们认为是“好”的特征他们可能不接受。举一个例子来说,唐代妇女以胖为美。如果以这种审美观点克隆胖美人,当她长大后发现不被人认为很美,她乐意吗?既然克隆人与我们具有不同的理解,我们有什么权利将我们上一代人的价值标准,我们的善恶观念和审美观念,通过技术的方法强加给他们呢?克隆技术为我们提供了选择的可能,但是这种选择的权利我们怎样去使用?我们能做好造物主吗?准确的答案和方法目前还没有。在人类进化的若干年中,正是由于遗传具有不确定性,才构成了对人类的重要保障,以防止任何可能发生的出于他人意愿或目的、对个人命运进行预定的行为。如果早就能对个人命运进行控制,人类社会现在究竟是什么样子我们不得而知。出于对人类负责的态度,我们使用克隆技术要慎之又慎。

克隆人如果真的产生出来了,如何处理各种社会伦理关系将显得十分尴尬。假定一对夫妇使用丈夫的遗传物质克隆了一个小男孩,那妻子是这个小男孩的生身母亲吗?如果说是,小男孩并不带有她的遗传物质。而说不是,他确由她所生。而对于丈夫来讲呢?小男孩是他儿子呢?还是另一个他自己?这样,世代的秩序和个人身份的确立被打乱了。而这种秩序和定位是构成人和社会的最基本的部分,我们每个人都历练于其中,如果这种秩序和定位产生了混乱,人和社会的意义将发生偏移。这个问题如何解决呢?对这些问题,还没有一套社会认同和接受的伦理规范。

总之,克隆技术给我们带来了各种各样的伦理问题,许多问题是我们以前没有遇到过的,甚至有些是根本性的问题。和对待其他事情一样,对待这些问题有两种极端的态度,一种是恐惧,一提到克隆人,想到它可能带来的严重后果,便谈虎色变,避而远之,坚决禁止;另一种是对新事物表现出强烈的兴趣,不惧怕后果,不顾各种阻挠,大力发展。这两种做法都不足取。后者遭到了社会有识之士包括许多科学家在内的反对,而前一种态度则貌似一种理性的负责的态度,实则不然。技术是能禁止的了的吗?伦理原则必须要固守以前的框架吗?

三、克隆技术的发展与科技伦理的开放性

对于克隆技术可能带来的一系列伦理问题,许多组织和国家都作出了强烈的反应。联合国教科文组织在1997年11月11日的全体会议中通过《关于人类染色体的一致宣言》,在其正文第11条中规定“那些损害人类尊严的行为,诸如以生殖为目的的克隆技术,应当予以禁止”。美国伦理咨询委员会在1997年6月呈交给美国总统的一份报告中阐明了他们的立场:“不论是在公共范畴还是私人领域,试图以克隆方式,即通过移植体细胞核的方法制造一个婴儿,对于任何一个人来说都是从精神上不能接受的。”

来自不同层面的许多声音要求禁止人类克隆,然而,事实上几年来克隆技术的发展表明,世界各科技大国谁也没有终止克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性,在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月,英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告,表明英国政府将重新考虑这一决定,他们认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举,关键在于建立一定的规范让它为人类造福。这表明了克隆技术还是要发展,不能因为可能产生的伦理学问题而禁止它的发展,问题的关键在于怎么发展。这就涉及到技术发展规律和伦理学的开放性问题。

技术是一把双刃剑,既有对人类有利的一面,也有其可能产生不利的一面。克隆技术也是如此,它可能给人类带来巨大的利益,这构成了它向前发展的巨大动力;但它也可能给人类带来严重的后果,这是人们对其产生忧虑并限制其发展的原因。由于利益的存在,全面绝对的禁止无从谈起。上述英国政府的态度和开篇提到的联合国大会关于禁止克隆人决议未获通过的事实说明了这一点。而目前采取的限制手段也不可能阻挡住克隆技术的发展。

首先,科学和技术一经产生,它的发展就具有了内在的动力和一定的规律,就不是我们可以通过强制而随意控制和消灭得了的。技术的发展本身有其内在的逻辑性,它具有在积累的前提下自我创新的能力,在一定规模上自我增长的能力,通过调整自身的状态和趋势适应环境的能力,自我扩大应用层面和范围的能力等[7](PP.48—51)。技术的运动是积极和开放的,即使人类介入并加以控制,其自身的规律和作用仍然存在。科学史上的许多事实可以证明这一点。譬如避孕套刚发明的时候,许多人反对使用,但是很快就普及开来。

其次,科学技术的创造和发明主体——科学家对未知的事情具有强烈的探索欲望。诺贝尔奖获得者、著名美籍华人、实验物理学家丁肇中教授在为南京航空航天大学作学术报告时说过一段话:“科学很大一个作用是满足人的好奇心,这是人和动物的最大区别”。出于好奇而进行研究是科学家的本性,甚至他们中有一部分人对克隆人有强烈的兴趣。政府不让搞,他们偷偷摸摸也要搞。这也是克隆技术不易控制的一个重要因素。

就目前的一些伦理学原则来讲,也并没有要求我们全面停止这项技术的研究。现代功利主义对待这些问题采用的是“冒险—获利”原则,它要求对研究和应用技术进行详尽的分析,作出综合性评价,估算研究或试验所带来的利益是否超过了可能受伤害的危险,冒险相对于利益及获得知识的重要性来说是否合理。获利大于伤害即是可行的。康德反复强调的是要充分考虑“人的尊严”、“人的自主权”、“个人的自决权”。德国著名哲学家哈贝马斯提出了协商伦理学的原则,它通过社会各方的对话和反思,建立起相应的伦理道德原则,并使各方在其中实现自己的预期利益。在这里反复强调了对人的利益和需求的理解,提出以理性应对科学研究对人类带来的风险和分担社会责任的思想。协商伦理不再认为道德具有绝对的特性,它可以随社会环境而改变。“道德是为人创造的,而不是人为了道德”。由于和现时的伦理学不符而禁止克隆技术研究,与以上伦理学精神相悖。所以,与其要严格禁止克隆技术的发展,不如遵循因时而异的态度加以控制并引导其发展。

社会伦理观念具有一定的传统性和保守性,但是,新技术的快速发展会带来新鲜事物,产生新的情况,必然对已有的观念提出挑战。思想史表明,随着时间的推移,人们会逐渐适应新的思想,增加对那些存有疑虑的技术的信任。时间本身在这个过程中没有发挥直接的作用,而是新事物的不断涌现促使产生了新的观念,新的观念逐渐深入人心。近些年来,伦理学家对新的生物伦理学理论进行了有益的探讨。对他们提出来的一些问题,公众也进行了激烈的辩论,这为理论和实践的结合提供了契机。伦理学应该根据面临的实际情况,提出新的价值观和行为规范去对待新事物的发展。

克隆技术范文第2篇

1材料与方法

基因DNA模板、PCMV阳性血清、表达载体pET32a(+)均由四川农业大学动物生物技术中心提供,2月龄健康雄性白兔(体重2kg)购自雅安市某家兔养殖基地。克隆载体pMD19-TSimple,限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、T4DNA连接酶、IPTG、蛋白质Marker购自大连宝生物工程有限公司;、质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、购自北京天根生化科技有限公司;N,N’-亚甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、SDS、TEMED、考马斯亮蓝R-250、2-巯基乙醇、溴酚蓝、琼脂糖、甘油、氨苄青霉素、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、硫酸铵等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司,其他化学试剂均为分析纯。引物的设计与合成应用.0b等分子生物信息软件对PCMVgB基因及其编码氨基酸序列进行生物信息学分析,并选择gB基因2305~2574bp优势抗原表位区作为目的序列,参照NCBI上的猪巨细胞病毒gB基因序列(登录号:FJ844360.1),应用Oligo7.0软件设计引物P1、P2,在引物P1、P2的5′端分别引入酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ,用于PCR产物与表达载体的连接,并在引物P1、P2酶切位点后分别引入起始密码子ATG和终止密码子TAG。P1/P2扩增的目的片段长270bp,上述引物送上海Invitrogen生物技术有限公司合成,引物序列如下(下划线处为EcoRⅠ酶切位点),下划线处为HindⅢ酶切位点)。PCMVgB基因优势抗原表位区的PCR扩增以gB基因DNA为模板,分别以P1、P2为上游引物和下游引物,对PCMVgB基因优势抗原表位区进行体外扩增。PCR反应的程序为:94℃预变性,经30个循环后,于72℃延伸8min。基因优势抗原表位区表达载体的建立及重组蛋白的表达与纯化将PCR产物于琼脂糖凝胶电泳后,利用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段,将目的片段连入pMD19-TSimple克隆载体并转化入E.coliDH5α后抽提质粒,进行质粒基因组测序,并使用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切,将酶切后的目的片段连接入pET32a(+)载体,并命名重组质粒为pET32a(+)-gB,转化入E.后将重组表达菌命名为E.。使用浓度为0.2mg/L的IPTG诱导E.重组表达菌表达后,将表达产物通过组氨酸标签融合蛋白纯化柱进行纯化,并测定纯化后的蛋白质浓度。PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白的反应原性分析以纯化的PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白作为抗原,PCMV阳性血清为一抗,以HRP标记的羊抗猪IgG为二抗进行试验,并设置PCMV阴性血清对照组,鉴定PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白的反应原性。多克隆抗体的制备及抗体效价的测定使用纯化后的PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白与弗氏佐剂按1∶1体积比进行乳化后制成油乳剂,对健康家兔进行免疫,第4次免疫完成后对试验家兔采取心血,将血液收集至离心管中,先于常温倾斜放置30min,再转至37℃培养箱中放置1h,最后转入4℃冰箱中放置过夜,于4000r/min离心15min分离血清。将分离的血清无菌进行分装后于-20℃保存备用,并避免反复冻融。以纯化后的PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白(质量浓度为0.62μg/mL)作为抗原,以琼脂扩散试验验证经PBS缓冲液稀释后的多克隆抗体效价。鉴定以纯化的PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白作为抗原,制备的多克隆抗体作为一抗,HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行Western-blot鉴定,以免疫前的家兔血清作为阴性对照,鉴定该多克隆抗体的反应性。

2讨论

自1950年PCMV在英国被发现以来,该病毒就因为其免疫抑制特性以及能够通过跨物种器官移植而感染人与其他动物而备受关注,但由于该病毒分离困难,导致了对该病毒的研究一直落后于其他疱疹病毒科病毒。囊膜糖蛋白B(gB)是PCMV重要的跨膜糖蛋白,也是特定细胞毒T淋巴细胞的主要靶蛋白,是淋巴因子激活的自然杀伤细胞的识别对象,且gB蛋白具有良好的免疫原性,并在诱导机体体液免疫和细胞免疫中起着重要作用,对该蛋白进行研究有助于了解PCMV的感染机制,为该病毒感染的防治奠定了基础。本试验构建了pET32a(+)-gB高效重组表达质粒,应用原核表达系统以可溶性形式高效表达了PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白,成功表达并纯化了PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白,并验证了其具有良好的反应原性,可以作为间接ELISA检测的包被抗原,通过琼脂扩散试验和Western-blot试验,也证实了制备的多克隆抗体可以与gB蛋白特异性结合。本研究为进一步分析PCMVgB蛋白的生物学特性,建立PCMV抗体血清学诊断方法奠定了重要基础,为制备早期检测PCMV抗体的检测试剂盒奠定了基础。

作者:江一帆刘骁单位:四川农业大学

克隆技术范文第3篇

国内已有的研究文献,只是对仲裁器PUF进行了改进,但并没有提高仲裁器PUF在不同芯片中的差异性以及系统的稳定性,也未对具体的应用进行描述。对此,本文设计了由多路仲裁器PUF电路、多数表决器和运算门阵列三部分组成的防克隆电路,用以解决上述问题。

1多路仲裁器PUF电路设计

仲裁器使用D触发器,D触发器不易进入亚稳态。即使信号传输的延时差小于D触发器建立时间,它的输出也是一个稳定的状态,不是‘1’就是‘0’。但根据以往研究者的资料和实际实验测试,使用了D触发器的仲裁器PUF存在以下的问题:相同电路在不同芯片间的传输延时差异性减小,张俊钦等人测得该差异产生的概率约为11.2%;针对此问题,文中共设计了8支仲裁器PUF电路。每支仲裁器PUF由128个开关单元组成,结构完全一致,但选择位F(0...127)不同。左半部分为8支仲裁器PUF,右半部分为其中一支仲裁器PUF的局部放大图。F[0]~F[10]为一部分选择位,“信号输入”代表仲裁器PUF的输入端,“信号输出”代表仲裁器PUF的输出端。每一支仲裁器PUF电路都通过运算门阵列与被保护电路的输出进行运算。因此,只要有一支电路的延时差发生差异,最终的输出都会发生变化。而最终的输出发生变化的概率,即8支电路中至少有一支在不同芯片中产生延时差异的概率为1-1-0.()1128=61.34%。理论上,PUF的数量越多,上述的概率就越高,但考虑到FPGA资源有限,过多的PUF电路会占用过多的空间,因此只设计了8支电路,而此概率已远远高于D.Lim等人得到的23%的概率。在设计中,通过分析不同的选择位对应的响应,确定每支PUF电路的选择位,使得输出结果中,各有4支电路的输出为‘1’和‘0’,保持了‘1’和‘0’的均衡性,从而加大敌方破解的难度。经过实验,使用8支电路达到了预期的效果。此外,仲裁器PUF的输出取决于上下两条线路的延时差,而电路的布局布线对延时有很大的影响。每次进行重新编译时,布局布线都有可能发生改变,导致延时差发生变化,从而引起输出的改变。同时,即使在同一块芯片中,也可能存在着工艺不均匀的情况,所以仲裁器PUF布局在不同的位置,就可能会产生不同的输出。考虑到这点,在实际操作中,本文使用了Altera公司QuartusII的高级功能逻辑锁(LogicLock),将设计好的仲裁器PUF电路锁定在了芯片的固定区域内,减小了布局布线及芯片不均匀产生的影响,同时给被保护电路的设计留出了足够的芯片资源,使得两者不会产生干扰,还有利于团队的分工和协作,提高效率。

2多数表决器为保证系统稳定

要求仲裁器PUF在同一芯片中对同一激励的响应保持恒定。在实际应用中,气温变化与电压不稳是电子设备面临的两个最大难题,仲裁器PUF也不能例外。尽管D.Lim等人测得仲裁器PUF在同一芯片中对同一激励的响应发生变化的概率只有0.7%,但该数据是在温度范围为40~70℃,电压变化幅度为±2%的情况下测得的。若电子设备要求必须能在极端环境下正常工作,上述测试环境下的数据显然不能满足要求。因此必须进行电路设计,保证输出的稳定性。借鉴文献提到的方法,对每一支仲裁器PUF在同一激励下的多次响应进行寄存,然后对寄存的响应进行多数表决。由此可以有效避免因外部环境变化而对输出产生的影响。其中多数表决器由VHDL写成,并生成符号(symbol),与仲裁器PUF在原理图环境中进行编译,

3运算门阵列运算门阵列是防克隆的重要部分

由与门、或门组成,每个逻辑门都连接着一根仲裁器PUF的输出线与一根被保护电路的输出线。若逻辑门连接的仲裁器PUF的输出为‘1’,则该逻辑门为“与门”;若仲裁器PUF的输出为‘0’,则该逻辑门为“或门”

二实验结果与分析

将上述设计方案在AlteraCycloneII系列EP2C8Q208C8N上进行了验证,开发软件为Quar-tusII,开发语言为VHDL,被保护电路取为经典的DDS正弦信号发生器电路,该DDS正弦信号发生器为10bit输出。DDS的输出与仲裁器PUF的输出经过“运算门阵列”的运算之后,使用Quartus的嵌入式逻辑分析仪SignalTapII,观察输出波形。经过实验,分析仪SignalTapII,观察输出波形。经过实验,得到更换FPGA前后的输出结果。图10中,上面的波形为正常的DDS正弦波,下面的为更换了同型号的另一块FPGA之后的输出波形。通过比较可以发现,更换芯片之前正弦波输出正常;而更换之后,由于制造工艺的差异,仲裁器PUF的输出产生了变化,导致经过运算门阵列运算之后,原本正常的正弦波输出发生了改变。结果证明,所设计的防克隆电路具有实用性和有效性,可以在保护武器装备安全方面发挥一定作用。

三结论

克隆技术范文第4篇

下游引物P,下划线处分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。上述引物由大连宝生物工程有限公司合成。L基因的克隆与鉴定以绵羊痘病毒基因组DNA为模板,采用50μL体系进行PCR扩增。将纯化的PCR产物与mple克隆载体连接,并将连接产物转化至DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆培养后小量制备质粒进行酶切鉴定,并测序。绵羊痘病毒E3蛋白的生物信息学分析将测序结果应用NCBI数据库ORFfinder程序推导出相应的氨基酸序列,并应用Weblab服务器中法对SPPVE3蛋白和VVE3蛋白的核苷酸和氨基酸序列进行比对。二级结构、蛋白质柔性区域分析分别使用软件的法和法进行预测。蛋白中氨基末端和羧基末端2个功能域的三级结构使用SWI服务器进行预测。重组载体的构建及重组蛋白的诱导表达、纯化E3L重组载体和表达载体pGEX4T-1分别用酶切后,经琼脂糖凝胶电泳检测后用凝胶回收试剂盒回收目的条带,16℃连接过夜,并转化至DH5α感受态细胞。毒株绵羊痘病毒古浪株由中国农业科学院家畜疫病病原生物学国家重点实验室分子免疫与环境控制课题组分离、鉴定和保存。主要试剂TaqDNA聚合酶、载体、大肠杆菌菌株连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ均购自大连宝生物工程有限公司;pGEX4T-1表达载体表达菌、GST结合树脂和硝酸纤维素膜购自公司;氨苄青霉素、IPTG、弗氏佐剂和辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗山羊IgG购自Sigma公司;HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自公司;化学发光底物购自公司;X光底片、显影及定影液均购自柯达公司;其他试剂均为进口分析纯。引物的设计与合成根据GenBank中登录号为的基因组序列,利用软件设计了1对引物,预期扩增产物的大小为534bp。上游引物P,挑取阳性克隆培养后小量制备质粒进行酶切鉴定,并测序。将鉴定正确的重组载体转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞,37℃振荡培养至时,加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导培养离心10min收集菌体,处理后进行检测。用裂解缓冲液重悬诱导表达的菌体,在冰浴条件下进行超声破碎(超声5s,停8s)至溶液澄清,离心,分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE,分析重组蛋白SPPVE3的可溶性。重组蛋白使用Novagen公司的GST结合树脂进行纯化。重组蛋白鼠抗血清的制备及分析选取周龄的BALB/c小鼠进行免疫:初次免疫时,用纯化后的重组蛋白SPPVE3与等量弗氏完全佐剂混合,经乳化后皮下多点注射;第14天,用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合,乳化后加强免疫。二免后第14天采血,分离血清,用纯化的重组蛋白SPPVE3包被ELISA板,进行间接ELISA试验,测定血清效价。

2SPPVE3L基因的序列分析与结构预测经测序分析

SPPVE3L基因全长534bp,编码177位氨基酸,分子质量约为。使用法分析,基因与VVE3L基因的核苷酸序列具有50.8%的一致性,在氨基酸水平上具有34.9%的一致性(50.0%的相似性。从功能结构域的氨基酸序列分析蛋白的氨基酸末端序列与E3蛋白ZDBD相比具有28.2%的一致性(47.4%的相似性),而羧基末端与DRBD相比具有41.9%的一致性(52.7%的相似性)使用法预测蛋白的二级结构,发现α-螺旋主要存在于位氨基酸;β-折叠主要分布于位氨基酸;利用法预测蛋白质柔性,结果表明较大的柔性区域分布于位氨基酸。根蛋白结构预测服务器,对SPPVE3蛋白的氨基末端和羧基末端2个潜在的功能结构域氨基酸序列进行蛋白三级结构的同源建模。构建的氨基酸区域分别为3~71和102~173位氨基酸,参考模板分别为E3蛋白的Z-DNA结合域和PKR的dsRNA结合域。序列一致性分别为40.58%和26.027%,E值分别为E-21和1.8E-16,表明模型构建可靠。重组质粒的鉴定及重组蛋白的诱导表达与纯化经酶切鉴定(见图6)及测序鉴定,表明E3L重组载体构建正确。含有重组载体的BL21(DE3)pLysS重组菌在浓度为1mmol/L条件下诱导4h后,经E电泳分析,显示在46ku处表达出一条明显的条带,分子质量与预期大小一致。经可溶性分析,表明重组蛋白主要以可溶形式存在于菌体中,经GST结合琼脂可纯化出目的条带重组蛋白SPPVE3鼠抗血清的制备分析用绵羊痘病毒标准阳性血清和制备的鼠抗血清对SPPVE3蛋白进行分析,结果显示所制备的鼠抗血清可以与重组蛋白发生反应。对制备的重组蛋白SPPVE3鼠抗血清进行间接ELISA检测,其效价为。

3讨论

克隆技术范文第5篇

蛹期开始将雌雄分开饲养,羽化后喂以5%的蜂蜜水。养虫室温度为26℃,相对湿度为70%~80%,光周期16D∶8L。总RNA的提取及cDNA第一链的合成为测定气味结合蛋白基因的组织表达谱,取3龄幼虫头部和去除头部的剩余组织,取3日龄雌雄成虫的不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足、翅),其中,雄虫触角收取30对,雌虫触角收取40对,其他组织适量,重复3次。组织收取后立即放入液氮中,-70℃保存备用。按照说明书,用SVTotalRNAIsolationSystem提取总RNA,然后用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链,-20℃保存备用。RACE扩增利用本研究组委托深圳华大科技有限公司测得的二化螟基因组数据,与GenBank中的OBP序列进行比对得到CsupOBP1基因的cDN段。根据片段序列,设计合成5''''GSP和3''''GSP引物。依据扩增试剂盒操作说明,进行RACEcDNA第一链的合成及PCR扩增。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,目标条带经AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收后,连接到pEASYTM-T3载体上,然后转化到Trans1-T1感受态细胞中。转化后的菌落经蓝白斑筛选,挑取单个白色菌落放入含有0.1%Amp的LB培养液中,在250r/min、37℃下震荡培养12~16h后,采用质粒提取试剂盒(Omega,USA)提取质粒,送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。

2序列分析

测定为了明确二化螟OBP1基因的组织表达谱,利用ABI7500Real-timePCRSystem进行了相对表达量测定。内参基因为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因和转录延长因子4(E2F)基因,用于实时荧光定量PCR的引物序列。RT-qPCR反应体系为模板2.0μL,超纯水补足至20μL。采用两步法标准程序进行扩增:95℃预变性30s;95℃5s,60℃34s,共40个循环。反应后进行溶解曲线分析,以排除非特异性PCR产物的污染,空白对照模板以超纯水代替cDNA。蛋白的原核表达与纯化根据二化螟OBP1阅读框序列及表达载体pET-30a(+)设计带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点(以下划线标示)的引物序列。以成虫触角cDNA为模板,采用高保真性和高扩增效率的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase,按照PrimeSTAR说明书进行PCR扩增。将PCR产物回收,再连接到pEASYTM-T3载体中并转化到Trans1-T1感受态细胞中,提取质粒DNA并测序验证。将含有目的片段的重组质粒DNA和pET-30a(+)质粒DNA分别进行双酶切,然后将目的片段连接到pET-30a(+)载体,再转化到Trans1-T1感受态细胞中。用含抗生素卡那霉素的LB平板进行筛选,挑取阳性克隆,小量提取质粒进行测序。经测序验证后的质粒转入大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受态细胞中,涂板培养后挑取单菌落接种于5mLLB培养液(含Kan50μg/mL)中,37℃振荡培养过夜。次日,将所得菌液按1/100(v/v)的比例接种于新鲜的LB培养液(含Kan50μg/mL)中,37℃振荡培养,当细胞生长至OD600=0.6时,加入IPTG(终浓度为1mmol/L),37℃下250r/min振荡培养5h。将菌液8000×g离心20min后收集沉淀(菌体),加入预冷的Resuspensionbuffer(20mmol/LTris-HCl,0.5mmol/LNaCl,pH7.将沉淀重新悬浮,超声破碎后用12000×g离心15min,分别收集上清及沉淀,用SDS-PAGE检测重组蛋白是否为可溶性蛋白。重组蛋白的纯化使用装有填料的亲和层析柱XK16/20,对纯化后的重组蛋白进行肠激酶酶切以切除His-tag标签,酶切后的重组蛋白再次过亲和层析柱。纯化后的目的蛋白经过透析(除盐)、冷冻干燥后,保存于-70℃备用。

3荧光竞争结合实验

缓冲液中,配成蛋白溶液,测定浓度。荧光探针1-NPN和气味物质(植物挥发性化合物,见表2)溶于甲醇中,使其终浓度为1mmol/L,作为工作液。以1-NPN为探针,利用荧光竞争结合实验测定气味物质和OBP间的亲和力已有很多报道(Zhouetal.,2004b;Heetal.,2011;Qiaoetal.,2011;孙红岩等,2011;LiuNYetal.,2012;LiuSJetal.,2012;张婷等,2012;Lietal.,2013)。首先测定CsupOBP1与1-NPN的结合曲线。将蛋白溶液加入20mmol/L的Tris-HCl缓冲液中,使其终浓度为2μmol/L,按和20μmol/L的浓度梯度加入1-NPN,每次加入后反应2min,在337nm激发,记录荧光发射情况,利用其荧光值计算出该蛋白与1-NPN的结合常数,然后利用竞争结合实验测定气味物质和蛋白的结合能力。在竞争结合实验中,蛋白和1-NPN的浓度均为2μmol/L,反应时间为2min,在337nm激发,记录荧光值(初始荧光值)。然后将被测气味物质按终浓度和20μmol/L的浓度梯度加入到1-NPN和蛋白的混合液中,每次加入后反应2min,记录荧光值。对于浓度在20μmol/L时相对荧光值降到60%以下的气味物质,再进行2次重复试验,以3次重复计算有关参数;对于结合能力较低的气味物质,第一次测定后不再进行重复试验。计算荧光值降低到初始荧光值一半时气味物质的浓度,即IC50值,利用公式Ki=IC50/(1+[1-NPN]/K1-NPN)计算各气味物质的结合常数,其中[1-NPN]为未结合的1-NPN浓度,K1-NPN为1-NPN与二化螟OBP1的结合常数(Banetal.,2003)。

4EAG反应测定

触角电位仪为荷兰Syntech公司生产,刺激控制器(型号CS205)的工作条件为直流电、增益200,气流速度为3mL/s。其他参数及详细测定步骤参见Yang等(2009)。被测气味组分用正己烷配制成200ng/μL的工作液,以正己烷为对照。实验时,用微量进样器取5μL滴到滤纸片上(25mm×7.5mm),放置5min待溶剂挥发后装入巴斯德管内并用封口膜封闭两端,在室温下挥发5~10min后将封口膜去除并将巴斯德管链接到气路装置,进行EAG反应测定。测定试虫为暗期5~8h的2日龄未交配蛾,每个气味组分测定雌雄虫各6头(重复)、每头虫测定1根触角,每个组分在一根触角上连续测定3次(间隔30s)。不同组分(包括对照)的测试顺序在6根触角(重复)间轮换,以消除测定顺序对结果的影响。数据统计与分析在Real-timeqPCR测定中,用Q-Gene软件进行表达量的计算(Mulleretal.,2002;Simon,2003),用SAS9.0进行数据统计分析,采用t检验进行幼虫不同组织及成虫雌雄间基因表达量的差异显著性分析;采用单因素方差分析及多重比较,检验二化螟对不同植物气味EAG反应间的差异。

5结果与分析