【摘要】目的探讨人工合成的CpGODN对不同物种的免疫刺激活性，开发具有广谱免疫刺激活性的CpGODN。方法将特定的CpGODN单独或与不同的抗原联合分别免疫鸡和小鼠，用ELISA检测不同时间鸡和小鼠特异性抗体的滴度。结果CpGODN均能诱导鸡和小鼠产生抗原特异性抗体，且抗体水平明显高于对照组(P<0.05)。结论这种CpGODN在一定程度上具有广谱免疫刺激特性。

【关键词】CpGODN；种属特异性；疫苗

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheimmunestimulationactivityofCpGoligodeoxynucleotidestodifferentspeciesanddevelopCpGoligodeoxynucleotidesthatpossessbroad-spectrumimmunestimulationactivity.MethodChickensandmicewererespectivelyvaccinatedwithCpGoligodeoxynucleotidesorsynergisticallywithdifferentantigens,andthentitersofspecificantibodyinthebloodserumsofchickensandmiceweredetectedwithELISA.ResultsCpGoligodeoxynucleotidescouldinducethegenerationofantigenspecificantibodyinchickensandmice,andthelevelofantibodiesingroupswhichuseCpGODNasadjuvantishigherthanthatinthecontrolgroup(P<0.05).ConclusionCpGODNthatwemaderestrictivelypossessesbroad-spectrumimmunestimulationactivity.

Keywords:CpGODN；multispeciesspecificity；vaccine

包含CpG基序的人工合成的寡核苷酸（ODN）作为免疫刺激信号可以被动物的免疫系统所识别，随后CpGODN刺激人类和多种动物产生天然的和获得性的免疫应答。CpGODN主要通过TLR9活化免疫系统，产生Th1型免疫应答。因此，CpGODN作为佐剂已广泛应用于感染性疾病、肿瘤的预防和治疗［1］。但CpGODN存在种属特异性问题，这一问题限制了动物实验结论的外推性［2］。所以，寻找和开发具有广谱识别特性的CpGODN具有重要的应用价值。本文主要通过观察鸡和小鼠血清中特异性抗体的变化来评价CpGODN对不同抗原的免疫增强效果，进而确定这种CpGODN是否能够克服物种限制性这一问题。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物健康1日龄小鸡，健康50日龄SPF鸡，购自广东省农科院；2月龄BALB/c小鼠,雌性,体质量20g左右，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号：2003A074。

1.1.2试剂10mg/mL猪囊虫抗原、猪囊尾蚴DNA疫苗VTS76、VR1020、CpGODN由本实验室保存［3,4］，SPAHRP购自上海生物制品研究所。

1.2动物分组及免疫方案

1.2.1鸡实验组取健康1日龄小鸡，随机分成A、B、C三个组，每组20只，各组饲养条件相同。7日龄时各组处理如下：A为对照组，不作任何处理；B组滴鼻免疫VTS76疫苗（100μg/kg）；C组滴鼻免疫VTS76疫苗（100μg/kg）,并同时颈部皮下注射免疫佐剂CpGODN（100μg/kg），21日龄时B、C组按相同的处理加强免疫1次。

1.2.2BALB/c小鼠实验组BALB/c小鼠60只,随机分为3组,每组间隔2周免疫2次。采用肌肉注射法,将质粒DNA溶液注射到小鼠两侧股四头肌。A组注射VR1020100μg/kg作为阴性对照;B组注射VTS76（100μg/kg）;C组注射VTS76和CpGODN各100μg/kg。

1.3抗原特异性抗体检测96孔培养板用碳酸氢钠缓冲液(15mmol/LNa2CO3,35mmol/LNaHCO3,PH9.6)适当稀释的猪囊虫抗原包被，4℃过夜孵育。用含Tween20的PBS(0.1mol/LPBS，0.1%Tween20)洗涤3次，每次3min；每孔加入100mL经PBS(0.1mol/LPBS，1%BSA)适当稀释的待测血清，37℃孵育2h。PBS洗涤5次，每孔加入100mL、1∶40稀释的SPAHRP，37°C孵育2h。PBS洗涤5次，每孔加入100mLTMB底物（含0.1mg/mL3’3’5’5’四甲基联苯胺的磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5.4，用前加5mL30%H2O210mL），37℃孵育1h。每孔加入50mLH2SO4(0.2mol/L)终止显色反应。BioRad3550测定A450读数。待测样品A值大于阴性对照平均A值的3倍为阳性。

1.4统计学分析各实验组数据比较均采用方差分析，P<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1CpGODN对鸡血清中猪囊尾蚴特异性抗体滴度的影响C组在初次免疫1周后可以检测到特异性抗体，但抗体滴度很低；在初次免疫2周和二次免疫1周后，B组和C组特异性抗体滴度明显上升，且C组显著高于B组(P<0.05)；二次免疫后2周，B组还有明显上升，而C组已进入平台期，维持在一个较高的水平，两组之间差异无显著性(P>0.05)。对照A组在各个时间点均未检测到特异性抗体。以上结果表明，CpGODN能够显著增强VTS76疫苗诱导的体液免疫应答水平。见图1。

图1免疫鸡特异性抗体滴度的动态变化（略）

Fig.1Dynamicchangesoftitersofspecificantibodyagainstofimmunizedchickens

2.2CpGODN对小鼠血清中猪囊尾蚴特异性抗体滴度的影响B组和C组在初次免疫1周后可以检测到特异性抗体，但抗体滴度很低(1∶20)。二次免疫后1周，B组和C组免疫小鼠的抗体滴度均明显上升，但差异无显著性(P>0.05)。二次免疫后的第2周到第3周，C组的特异性抗体滴度明显高于B组(P<0.05)。对照A组在各个时间点均未检测到特异性抗体。结果表明，CpGODN能够显著提高猪囊尾蚴DNA疫苗的体液免疫应答水平。见图2。

图2免疫小鼠特异性抗体滴度的动态变化（略）

Fig.2Dynamicchangesoftitersofspecificantibodyofimmunizedmice

3讨论

CpGODN的种属特异性是指特定序列的CpGODN仅对特定种属的免疫细胞具有免疫刺激活性。早期研究发现，对人类TLR9产生最佳刺激效果的CpG基序是GTCGTT，而对小鼠TLR9最佳的CpG基序是GACGTT。将对人免疫细胞具有强刺激活性的ODN作用于鼠的免疫细胞时，仅显示出很弱的免疫活性，甚至无免疫活性，反之亦然［5］。CpGODN的种属特异性与TLR9的有效识别有关，即特定种群的TLR9仅识别特异的CpGODN序列。研究还发现，TLR9单个氨基酸的改变都会影响CpGODN的免疫刺激效果［6］。

目前，对于TLR9对ODN的识别方面有了更深入的认识。由于天然的磷酸二酯(PD)修饰ODN易于降解，所以目前应用较多的CpGODN均为磷硫酰（PS）修饰的ODN。而TaraLR［7］认为TLR9识别CpG基序的物种特异性仅限定于磷硫酰（PS）修饰的ODN，而天然的磷酸二酯骨架却不受影响。因此，人类和小鼠的细胞并没有进化到可以识别天然DNA中不同的CpG基序。我们采用的CpGODN是将60bp磷酸二酯（PD）修饰的ODN与pUC18载体体外连接，构建为重组质粒pUC18ODNs。这种磷酸二酯（PD）修饰的ODN可能更真实地模拟天然的包含CpG基序的非甲基化的ODN，克服TLR9识别CpG基序的物种特异性，从而提高自身对多种属的免疫刺激活性。

KandimallaER［8］设计了一种具有潜在的免疫刺激活性并能克服物种特异性识别效应的二核苷酸基序RpG。包含GARGTT和GTRGTT基序的ODN能够活化J774细胞的NFκB通路，同时诱导小鼠和人类细胞分泌大致相等水平的细胞因子。与CpGODN相比，RpGODN能够同时被HEK293细胞中的小鼠TLR9所识别。该种RpGODN还能诱导其它多个物种的外周血单个核细胞的增殖。此研究揭示了我们可以通过对寡核苷酸进行结构改造或修饰绕过TLR9识别的物种限制性，达到诱导多种属产生免疫应答的目的。

本研究结果表明，本研究所制备的CpGODN能够同时提高鸡和小鼠的体液免疫应答水平，这一研究结果为开发具有广谱免疫识别特性的CpGODN提供了重要的线索。当然，目前的研究还有待进一步深入，包括扩大物种的实验范围（特别是哺乳动物），同时研究体液免疫和细胞免疫应答水平。

【参考文献】

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［3］孟民杰，高荣，沈斌，等.小鼠对猪囊虫抗原基因TS76的免疫应答［J］.中国兽医学报，2002，22（3）：241-250.

［4］MENGMJ，GUOXL，DAIF，etal.TheimmuneresponsesoftheDNAvaccinationforTaeniaSolium［J］.ChinJMedLabTechnol,2006,2(2):81-87.

［5］BAUERS，KIRSCHNINGCJ，HACKERH，etal.HumanTLR9confersresponsivenesstobacterialDNAviaspeciesspecificCpGmotifrecognition［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2001，98(16):9237-9242.

［6］DALPKEA,FRANKJ,PETERM,etal.Activationoftolllikereceptor9byDNAfromdifferentbacterialspecies［J］.InfectImmun,2006，74(2):940-946.

［7］TARALR,MATTEWJS,DAVIDA,etal.Humecuttingedge:speciesspecificTLR9mediatedrecognitionofCpGandNonCpGphosphorothioatemodifiedoligonucleotides［J］.TheJournalofImmunology,2005，174:605-608.

［8］KANDIMALLAER，BHAGATL，ZHUFG，etal.AdinucleotidemotifinoligonucleotidesshowspotentimmunomodulatoryactivityandoverridesspeciesspecificrecognitionobservedwithCpGmotif［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2003，100(24):14303-14308.