目前，对于环境中微生物菌群的研究主要分为培养和非培养的方法。培养法是利用不同的选择性培养基结合生化反应鉴定细菌的种类。该方法具有一定的针对性，但是费时耗力，且只能获得可培养微生物的信息，对于那些不可培养的细菌则无能为力[11-13]。非培养的方法主要是通过分子生物学技术，直接从环境中提取细菌基因组DNA，再用分子生物学的方法进行分析研究，如聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PolymeraseChainReaction-DenaturingGradientGelElectrophoresis，PCR-DGGE）、核酸杂交（Hybridization）、高通量测序（High-throughputsequencing）等。目前分析细菌的16SrRNA序列已经成为细菌菌种鉴定的“金标准”。16SrRNA全长为1.5~1.6kb，包括9个“高度可变区”，其中V3区（nucleotides433-497）的位点456-479在细菌间的比对中获得最多的单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs）,能够鉴定110多种细菌[14]。研究者已经利用16SrRNA-V3区结合PCR-DGGE、测序等技术对环境中的细菌进行鉴定及菌群分析研究[9,15]，其中包括对牛奶中细菌的鉴定和菌群分析[11]，并发现牛奶中存在多种细菌，具有较高的菌群多样性。本研究中，我们从市售的常温牛奶和巴氏消毒牛奶中提取细菌基因组DNA，利用通用引物扩增牛奶中细菌的16SrRNA-V3区，荧光实时定量PCR测定样品中细菌总数；通过克隆、测序，获得16SrRNA-V3区的序列信息，再进行序列比对、鉴定菌种。分析不同品牌牛奶中的细菌数量、菌群分布，推测生奶的奶源环境、储存时间及奶牛的健康情况。

1材料和方法

1.1材料与试剂

1.1.1样品收集:从超市购买了4个品牌的5种牛奶，包括高温灭菌奶（常温保质期30天）和巴氏消毒牛奶（2℃~6℃保质期7天），分别标记为A、B、C、D、E。样品ABC为高温灭菌奶，DE为巴氏灭菌奶，C和D是同一品牌的常温奶和巴氏奶，每种牛奶收集了同一批次的3个样品。所有的样品均在2012年5~7月进行取样。

1.1.2试剂：QIAgenDNAStoolextractionkit－购自德国QIAGEN公司，PremixTapVersion2.0、pMD18-TVector－购自日本Takara公司，Cycle-Purekit－购自美国OMEGA公司，TransDH5αCompetentCell－购自北京全式金生物技术有限公司，KAPASYBRFASTqPCRKit－购自美国KAPA公司。

1.2仪器与设备NanodropND1000分光光度计－购自美国Thermo公司，GeneAmpPCRSystem2720ThermaCycler－购自美国ABI公司，BeckmanAllgreX-22R离心机－购自美国Beckman公司，PowerPacBasic电泳仪－购自美国Bio-RAD公司，凝胶成像系统－购自美国AlphaInnotech公司。ABI7300实时定量PCR仪－购自美国ABI公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取取100mL的牛奶样品用Collado[16]等（2009）的方法提取牛奶中的细菌DNA－7150g离心20min，弃掉上层溶液，收集沉淀，用5mLTE（1x）重新悬浮沉淀；7150g离心5min，弃掉上层溶液，沉淀用QIAgenDNAStoolextractionkit（QIAGEN）提取细菌基因组DNA。提取的DNA溶解在50μL的TE（1x）中，用NanodropND1000分光光度计测定DNA浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DN段大小。样品于-20℃冰箱中保存备用。

1.3.216SrRNAPCR用通用引物338F-CCTACGGGAGGCAGCAG，534R-ATTACCGCGGCTGCTGG扩增16SrRNA-V3区[17]。引物由上海生物生工（北京合成部）有限公司合成。PCR反应体系为：PremixTapVersion2.010μL，上下游引物各10μM，模板20ng，补水（PURELABUltra–ELGA纯化水，高压灭菌备用）到20μL。反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，100V，40min，紫外光下观察电泳条带（如图1）。PCR产物用Cycle-Purekit（OMEGABIO-TEK，D6942-01）进行纯化，测定浓度。纯化产物用于随后的克隆实验。

1.3.3序列信息分析测序获得的序列在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast进行16SribosomalrRNAsequences（bacteria）的比对，当MAXindent≥98%时，记录该序列对应的细菌属名和一致的始末位点。用BioEdit软件对所得的序列根据一致位点提取16SrRNA-V3区的扩增序列，用ClustalX（1.83）进行序列比对。RDP-classifier在线软件rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp对所有序列进行菌属鉴定，对每个样品的菌属进行归类。用“1-ΣH2”（H是每种菌属占样本所有菌属的百分比）来评估每个牛奶样品中的DNA菌群多样性[18]。PAUPversions4.0软件构建N-J系统发生树。

1.3.416SrRNA基因的Real-TimePCR定量细菌总数提取的牛奶中细菌DNA用于模板定量细菌总数，DNA克隆获得的pMD18-16SrRNA重组质粒用于标准品的制备。10倍梯度稀释的质粒用于实时定量PCR中标准曲线的生成。反应体系为：KAPASYBRGreenMasterMix（2×）10μL，上下游引物各4μM，模板20ng，补水到20μL。反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性3s，60℃延伸40s，共40个循环。数据结果用7300SystemSDSSoftware进行分析。每孔3个重复。

2结果分析

2.1DNA提取与PCR扩增我们成功提取了5种牛奶的15个样品的细菌基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳的结果显示，DNA呈现弥散状，没有明显的主带。用16SrRNA-V3区的通用引物对全部样品进行PCR扩增，均得到约为190bp的扩增片段，阴性对照无扩增条带（图1）。在15个PCR扩增产物中随机选择了5个（每个品牌选择一个样本）进行T-A克隆。每个样品得到了至少1000个克隆，随机选取100个克隆进行测序（表1）。

2.2牛奶中的细菌总数利用检测细菌的16SrRNA基因数量来反映牛奶中细菌总数。结果显示，所有牛奶样品中均含有大量的16SrRNA基因片段。考虑到不同种类细菌中16SrRNA基因的拷贝数在2~15个[19]，我们对绝对定量获得的数据进行最小化和最大化处理（各样品中的细菌16SrRNA基因按照最小拷贝数和最大拷贝数计算），所得结果和国家标准进行比较（图4）。按照每个细菌含有最少16SrRNA基因拷贝数计算获得最大细菌总数，各品牌牛奶样品中最大细菌总数均低于国家标准。

2.3菌种鉴定及菌群结构分析我们对5个牛奶样品的500个克隆进行了测序，成功的获得了472条16SrRNA-V3区的序列，其中有131种不同的序列。样品A和B得到93条序列，其中A中有20种不同的序列，样品B中有25种不同序列。C、D、E分别得到95、96、95条序列，不同的序列数目为39、51、32（表1）。菌属鉴定的结果表明，472条序列中的452条序列可以鉴定到五个纲的17个属：芽孢杆菌纲（Bacilli）占12%、黄杆菌纲（Flavobacteria）占3%、β-变形菌纲（Beta-proteobacteria）占2%、放线菌纲（Actinobacteria）占1%和γ-变形菌纲（Gamma-proteobacteria）占82%（表1）。另外的20条序列只能鉴定到纲的水平，分别为黄杆菌纲（5%）、β-变形菌纲（5%）和γ-变形菌纲（90%）。可以明确鉴定到属的序列中，有58条序列鉴定为革兰氏阳性菌，分属于棒状杆菌属（Corynebacterium），厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）和链球菌属（Streptococcus），占总序列的12%。其中Corynebacterium只在样品E中检测到1个克隆；所有的10个Anoxybacillus克隆都是在D样品中检测得到，且与A.kestanbolensis有99%以上的相似性。在样品C和E中都检测到Streptococcus，分别占其所测序列的1%和49%。C样品中的Streptococcus序列鉴定为嗜热链球菌属（S.thermophilus）；E样品中的46个Streptococcus克隆全部与无乳链球菌（S.agalactiae）有100%的相似性。革兰氏阴性菌的序列占所有序列的83%，分属于14个属：假单胞菌属（Pseudomonas），不动杆菌属（Acinetobacter），沙雷氏菌属（Srratia），气单胞菌属（Aeromonas），黄杆菌属（Flavobacterium），水栖菌属（Enhydrobacter），嗜冷菌属（Psychrobacter），希瓦尔氏菌属（Shewanella），金黄色杆菌属（Chryseobacterium），肠杆菌属（Enterobacter），詹森菌属（Janthinobacteriu），无色杆菌属（Achromobacter），微小菌属（Microvirgula），戴米提亚菌属（Demetria）。其中Pseudomonas最多，占全部序列的46%，其次为Acinetobacter，占23%，而且这两种细菌都以较高比例存在于在所有样品中。Pseudomonas和Acinetobacter在各个样品中检测到的比例分别为：A（71%，16%）、B（75%，13%）、C（30%，43%）、D（40%，17%）、E（16%，25%）（表1，图3）。Serratia在样品A（8%）和B（5%）中检测到；Aeromonas存在于样品B（1%）、C（1%）、D（13%）和E（1%）中；Flavobacterium在样品C（8%）和D（3%）中发现。C样品中有3%的序列为Enhydrobacter，比对结果显示，与气囊栖水菌（E.aerosaccus）有≥99%的序列相似性。样品C克隆中有3%为Shewanella，序列比对结果证明为腐败希瓦尔氏菌（S.putrefaciens）。样品C和D中检测到Psychrobacter，分别占比例为3%和1%。Chryseobacterium分布在样品C和E中。Janthinobacterium在C和D中分别占1%和4%。

2.4优势菌群的系统发育树分析各牛奶样本中不但检测到的菌属不同，即使是同一菌属，其序列（菌株）也存在差异，图4a是所有Pseudomonas序列构建的N-J系统发育树，发现样品A、B的序列集中在上端的分支上，中间的分支中大部分序列出自样本E，而样品C、D的序列集中在下端的分支上。说明同一品牌牛奶中的细菌可能具有更近的亲缘关系。图4b是所有Acinetobacter序列构建的N-J系统发育树，与图4a情况相似，同一品牌牛奶中的序列相似性更高。

2.5市售牛奶中细菌的多样性我们发现各个样品中能够明确鉴定的属为：A到D依次为5个、5个、11个、8个、8个，各个样品中有一定差异。为了更好了解牛奶样本中的细菌多样性，我们利用各样品中所有的序列进行了多样性分析。5个样品A、B、C、D、E的值分别为0.61、0.65、0.93、0.94、0.74，平均值为0.78。可以看出，A和B的菌群多样性明显低于C和D。

3讨论

3.1基于16SrRNA-V3区克隆测序鉴定细菌菌群用分子生物学技术直接从环境中提取细菌DNA并对其进行分析，再结合PCR扩增等方法研究环境中菌群多样性及结构是近年来国内外比较常见的研究方法。如林海龙等[19]对中药废水污泥中的菌群结构的分析，Rasolofo等[10]、Raats等[9]对生奶中细菌菌群结构以及冷藏过程中的菌群结构的变化情况的分析。几乎所有这些研究都基于基本的培养法获得生牛奶（即原料奶）中细菌的单克隆，再通过大量培养后提取细菌的基因组DNA进行PCR鉴定。然而市售牛奶，尤其是高温灭菌的市售牛奶，细菌DNA在牛奶中已经成游离状态，对DNA提取的要求比较高。所以如何从市售牛奶中提取到可以用于PCR扩增的DNA成为整个研究成功的关键。本研究通过增加牛奶的使用量，利用提取粪便中细菌DNA的试剂盒成功的从市售牛奶中提取到细菌DNA，并对这些DNA进行细菌16SrRNA-V3区的PCR扩增，成功获得了目的产物（图1）。通过T-A克隆和测序分析，得到了不同品牌的5种市售牛奶中菌群的16SrRNA-V3序列信息，并对其进行比对、鉴定。所得结果表明，用该方法可以提取到市售牛奶中的细菌DNA，所提基因组DNA可以用来进行下游的实验研究。

3.2各品牌牛奶中的细菌总数均处于相对较高水平牛奶中细菌总数是评价牛奶质量的一个重要标准。虽然牛奶中不可避免的存在一些细菌[1-3]，但是各种细菌的大量存在势必影响牛奶的品质[25]。我们的实验结果表明各个品牌牛奶中细菌总数均低于国家标准，然而相比较于乳业发达国家的105个/mL细菌数量，各牛奶样品中细菌总数均处于相对较高水平（图2）。这与我国部分奶源依赖散户养殖，饲料质量和卫生状况都不佳造成细菌总数不易控制，长时间储存导致的细菌繁殖，以及规模化养殖管理不善不无关系[21]。因此，监督部门应加强管理，促使国内奶制品产业环境进一步得到改善。

3.3不同品牌牛奶中的菌群结构不同Tatsuro等[22]用通用引物扩增16SrRNA-V3区的结果显示Lactobacillus和Staphylococcus是牛奶中的主要菌群，Lafarge等[12]也得到的相同的结果；与此不同，Delbes等[11]的结果则表明牛奶中的优势菌群是Clostridium和Lactobacillus；我们在市售牛奶中检测到的优势菌群是Acinetobacter和Pseudomonas，这与部分研究者的检测结果一致[9,10]。即使同为优势菌群，我们发现它们在5个样品中所占比例也不尽相同（图3）。然而在E样本中，Acinetobacter和Pseudomonas已非优势菌群,进化树的聚类分析显示同一属的细菌中，来自同一样本的细菌序列具有更高的相似性，其亲缘关系更近（图4）。各个样本中的非优势菌的种类也不同，如Serratia存在于样品A和B中，在样品C、D检测到了Janthinobacterium，只在样品E中检测到了Streptococcusagalactiae（表1）。Vacheyrou等[23]的研究表明大量的微生物菌群转移是从牛棚到挤奶室，然后到牛奶中，而且牛奶中存在的大部分细菌都能在乳头表面发现。因此我们推测不同品牌牛奶中菌群结构的差异是由于奶源不同所造成的，而奶源环境中的菌群结构存在较大差异。

3.4牛奶中的致病菌乳腺炎是世界奶牛养殖业中发病率最高、造成经济损失的主要疾病之一。其病因多为细菌感染。RiffonR等[24]根据感染特点提出环境感染和接触感染的观点。环境感染的主要病原菌为大肠杆菌（E.coli），其次有停乳链球菌（S.dysgalactiae）、乳房链球菌（S.uberis）和副乳房链球菌（S.parauberis）等；接触感染的主要病原菌是金黄色葡萄球菌（S.auresu）和无乳链球菌（S.agalactiae）。我们在样品E中不仅检测到，且检测到近一半的序列（49%）为S.agalactiae，说明该品牌的该批次生奶可能受到了严重污染。所以我们怀疑E样品奶源已有患有乳腺炎的奶牛，尽管这些奶牛可能没有表现乳腺炎的病症。

3.5牛奶中的耐冷细菌耐冷细菌是牛奶的主要腐败菌，它们被定义为能在7℃生长的细菌[25]。许多的研究者已经报道，在牛奶冷藏过程中耐冷细菌会大量繁殖，从而影响牛奶质量。在农场和加工厂，制冷技术在保证牛奶品质的同时，也为耐冷细菌的生长提供了选择条件[26]。所以随着生奶低温保存的时间延长，耐冷细菌的数目就会随之增多。Raats等[9]利用基于16SrRNA克隆测序的DGGE对生牛奶在制冷条件下细菌菌群的变化进行研究。结果表明，在农场到乳制品加工厂的冷藏过程中，Gammaproteobacteria是主要的细菌类群，尤其是耐冷细菌Pseudomonas占总数的46%~63%。Rasolofo等[10]的结果则显示，随着牛奶冷藏时间的延长，Gammaproteobacteria和Bacilli成为两大主要的细菌类群，分别占总细菌株的40.3%和40%。我们的结果显示，C、D样品中Pseudomonas占全部序列的30%和41%，这与文献报道的结果基本一致。多样性分析表明样品A和样品B在5个样品中多样性低（分别为0.61和0.65），聚类分析发现其不同的序列数少且集中在一起。Pseudomonas的序列数分别占A和B样品总体的71%和75%，其中相同的序列数分别为56和54，占A和B样品中Pseudomonas序列的86%和79%。因此我们推测生奶在加工为市售牛奶前，样品A和B比样品C、D、E低温储存的时间更长，使得耐冷细菌Pseudomonas大量繁殖，结果降低了牛奶中细菌的菌群多样性。本研究中，我们利用16SrRNA-V3区的序列信息分析了4个品牌市售牛奶的细菌菌群结构。结果证明16SrRNA-V3区克隆测序方法可从乳品生产销售的终端产品中检测细菌群落，使牛奶监测不再仅限于生奶阶段；同时检测结果也可以提供某些奶源信息。本研究表明各品牌牛奶中的细菌总数均处于相对较高水平，各品牌牛奶间菌群分布不同，菌群多样性存在明显差异—原因可能来自奶源环境、生奶储存时间以及奶牛自身的健康状况，要确定具体原因需进一步验证。

作者：李引强律娜吴俊朱宝利张庆波王秋涯高可心单位：河北联合大学基础医学院中科院微生物所病原微生物与免疫学重点实验室清华大学附属中学中国人民大学附属中学