细胞生物学的研究范文第1篇

0.009）；单克隆p75NTR阳性细胞再培养2周后，p75NTR阳性细胞率分别降为14.5%（Tca-8113）和5.8%（Cal-27）；p75NTR阳性细胞体外增殖能力显著增强，且具有明显的侵袭迁移能力。结论 p75NTR阳性舌鳞状细胞癌细胞具有肿瘤干细胞的特性。

[关键词] 舌鳞状细胞癌； 肿瘤干细胞； p75神经营养蛋白受体

[中图分类号] R 739.86 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.01.005

Study of the biological characteristics of p75 neurotrophin receptor positive tongue squamous cell carcinoma cells Tong Dongdong1，2， Zhang Fenghe1，2， Yao Yao3， Zhang Zhaotao1，2， Wang Jinbing1，2， Li Qing1，2， Zhang Xinlian1，2. （1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Stomatology Hospital of Shandong University， Jinan 250012， China； 2. Shandong Provincial Key Labo-ratory of Oral Biomedicine， Jinan 250012， China； 3. Dept. of Stomatology， Anhui No.2 Provincial People’s Hospital， Anhui 230022， China）

[Abstract] Objective To study the biological characteristics of p75 neurotrophin receptor positive （p75NTR+） tongue squa-mous cell carcinoma cells which were separated by flow cytometry cell sorting. Methods To determine the biological cha-racteristics of p75NTR+ cells which were separated from Tca-8113 and Cal-27 tongue squamous cell carcinoma cells by flow cytometry cell sorting， including study the capacity of cloning， 3-（4，5）-demethylthiazo（z-y1）-3，5-diphenytetrazoliumromide （MTT） assay， wound healing assay. p75NTR+ cells with non-sorted cells were as control group. Results In Tca-8ll3 and Cal-27 tongue squamous cell carcinoma cell lines， the percentage of p75NTR+ cells were 3.1% and 1.9%. Compared with p75NTR+ cells with non-sorted cells， p75NTR+ cells possess higher capacity of cloning （Tca-8113， P=0.024； Cal-27， P=0.009）. The per-centage of p75NTR+ cells of the progeny cells generated from monoclonal p75NTR+ cells decreased to 14.5% （Tca-8113） and 5.8% （Cal-27） after cultured two weeks. p75NTR+ cells possessed higher proliferation ability and higher metastasis ability than non-sorted cells. Conclusion p75NTR+ cells isolated from tongue squamous cell carcinoma have the characteristics of cancer stem cells.

[Key words] tongue squamous cell carcinoma； cancer stem cells； p75 neurotrophin receptor

肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是肿瘤组织中具有自我更新、多向分化及较强增殖能力的少量干细胞样癌细胞亚群，是肿瘤起源、生长、转移与复发的根源所在。近年来，寻找靶向杀死肿瘤干细胞的抗癌策略已成为研究的热点。其中，选择何种细胞表面标志物来证实舌癌中肿瘤干细胞的存在并完成对肿瘤干细胞的提取和鉴别是首要亟待解决的问题。研究发现p75神经营养蛋白受体（p75 neu-rotrophin receptor，p75NTR）的表达与多种肿瘤的发生和发展相关，并已证实其在全身多种肿瘤中可以作为一种肿瘤干细胞的表面标志物[1]。本实验采用p75NTR对舌鳞状细胞癌细胞系Tca-8113及Cal-27进行标记、检测、分选，并对分选后的p75NTR阳性细胞进行生物学特性研究，探讨p75NTR作为肿瘤干细胞标志物和预测口腔鳞状细胞癌愈后指标的可能性，为深入研究舌鳞状细胞癌的发病机理和寻找新的治疗靶点提供线索。

1 材料和方法

1.1 材料

Tca-8113、Cal-27细胞株来源于口腔舌鳞状细胞癌，由上海交通大学附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室惠赠。Tca-8113细胞株用含10%FBS（杭州四季青生物工程材料研究所）的RPMI1640培养液培养。Cal-27细胞株用含10%FBS（GIBCO公司，美国）的高糖DMEM培养液培养。PE标记的鼠抗人p75NTR抗体及PE标记的小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ抗体均购自美国BD公司。

1.2 流式细胞仪检测p75NTR阳性细胞的表达

将生长状况良好并处于对数生长期的Tca-8113细胞制备成单细胞悬液，并且调整细胞密度为1.0×106个·mL-1 。实验分为2组，实验组加入100 μL PE标记小鼠抗人p75NTR抗体，对照组加入等量的PE标记小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ。放入冰里置于震荡箱中蔽光孵育半小时，1 000 r·min-1离心5 min，吸弃上清后Buffer I l mL冲洗吹打（反复冲洗、离心2次），重悬于400 μL PBS中。将加入等量PE标记小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ的对照组先上机调节机器参数，然后取实验组上机检测细胞荧光值，分析p75NTR阳性细胞的百分含量，重复3次取平均值。同法处理Cal-27细胞。

1.3 p75NTR阳性细胞生物学特性检测

1.3.1 以p75NTR为标记分选阳性细胞作为实验组 将生长状况良好并处于对数生长期的较大数量的2种舌鳞状细胞癌细胞（约1.0×108个·mL-1）如上法处理后上机进行高速分选，获得p75NTR阳性细胞，作为实验组。为了保证分选后富集的p75NTR阳性细胞的纯度，分选时选取强阳性区域。重复上机一次，以避免标记物丢失造成的阳性率偏低。并取适量分选后的细胞上机检测p75NTR阳性细胞的纯度。

1.3.2 对照组处理 将同等条件培养的2种舌鳞状细胞癌细胞系细胞制备成单细胞悬液，加入PE标记小鼠抗人p75NTR抗体，放入冰里置于震荡箱中蔽光孵育半小时，再放入离心机离心5 min（1 000 r·min-1），弃上清后Buffer I l mL冲洗吹打（反复冲洗、离心2次），作为对照组备用。

1.3.3 单克隆培养 取对数生长期的2组细胞于超净台中常规消化制成单细胞悬液后，用有限稀释法接种于96孔板中。5%CO2、37 ℃饱和温度环境培养观察细胞贴壁情况，记录仅有一个细胞的孔，并做标记。2周后统计单克隆形成率。收集p75NTR阳性细胞形成的单克隆细胞，培养于培养瓶中，再培养2周后进行p75NTR的流式细胞检测。

1.3.4 四甲基偶氮唑盐比色法[（3-（4，5）-demethylthiazo

（z-y1）-3，5-diphenytetrazoliumromide，MTT]实验 收集2组细胞，分别接种于96孔细胞培养板中（每孔约4×103个细胞）（周边空不加），再各加入200 μL培养液（周边空不加，B3孔只加入PBS作为对照）。培养24 h后，换液，B3孔换200 μL PBS。每孔加入20 μL MTT溶液，培养4 h后吸出上清液，加入150 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置于摇床上低速震荡10 min。以B3孔为调零孔，上酶联免疫检测仪，以490 nm吸光度值量化活细胞数，每次检测一竖列的6个平行孔，每组所得数据取平均值，连续检测7 d。以生长时间为横坐标，以光密度（op-tical density，OD）值为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。

1.3.5 划痕实验 将2组细胞以每孔1×105个的密度接种于六孔板中，待细胞生长到80%～90%时，无菌条件下更换为无血清的培养基，继续培养12 h后，于超净台中用200 μL枪头在每个孔的中间划一条竖直的线，PBS冲洗3遍。每孔加入2 mL完全培养液，倒置显微镜下观察并拍照记录。之后每天换液，拍照，连续8 d。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。各组间的比较采用χ2检验进行分析，P

2 结果

2.1 流式细胞仪检测p75NTR阳性细胞的表达

舌鳞状细胞癌细胞株Tca-8113、Cal-27细胞中，p75NTR阳性细胞的比例分别为3.1%和1.9%。

2.2 流式细胞分选及纯度检测

分选后p75NTR阳性细胞的比例分别为98.1%（Tca-

8113）和97.4%（Cal-27）。这表明目的细胞阳性率比较高。

2.3 单克隆培养

2组单克隆形成能力的比较见表1。从表1可见，只有小部分细胞能持续分裂增殖。实验组的单克隆形成能力高于对照组（Tca-8113细胞，P=0.024；Cal-

27细胞，P=0.009）。这表明p75NTR阳性细胞具有自我更新和分化能力。单克隆细胞再培养2周后，Tca-

8113的p75NTR阳性细胞率降为14.5%，Cal-27的p75NTR阳性细胞率降为5.8%。

2.4 MTT实验

细胞生长曲线（图1、2）表明：2组细胞第1天生长情况无明显差异，从第3天之后实验组细胞较之对照组细胞体外增殖能力明显增强，第5天及第7天时更加显著（P

2.5 划痕实验

划痕后7 d，实验组较对照组具有明显的愈合能力（图3、4）。Tca-8113实验组到第8天已经基本被细胞长满，而对照组却仍有空白区域（图5），Cal-

27实验组到第5天已经基本长满划痕区域，完全长满需要7 d（图6）。这说明实验组具有明显的侵袭迁移能力。

图 1 2组Tca-8113细胞生长曲线（MTT实验）

Fig 1 Cells growth curve of Tca-8113 of two groups （MTT test）

图 2 2组Cal-27细胞生长曲线（MTT实验）

Fig 2 Cells growth curve of Cal-27 of two groups （MTT test）

图 5 2组Tca-8113细胞不同时间的划痕距离比较

Fig 5 The comparison of scratch distance in different times of Tca-

8113 of two groups

图 6 2组Cal-27细胞不同时间的划痕距离比较

Fig 6 The comparison of scratch distance in different times of Cal-

27 of two groups

3 讨论

肿瘤干细胞是肿瘤起源、生长、转移与复发的根源所在。近年来，通过对其生物学特性的研究，寻找靶向杀死肿瘤干细胞的抗癌策略成为研究的热点。p75NTR是一种神经营养因子的低亲和力受体，可通过不同的信号传导通路诱导细胞发生增殖、分化、迁移、凋亡等生物学行为。近年来，研究发现p75NTR的表达与胃癌[2] 、视网膜成神经细胞瘤[3]、前列腺癌[4]、胰腺癌[5]、黑色素瘤[6]等多种肿瘤的发生和发展相关，并已证实其在全身多种肿瘤中可作为一种肿瘤干细胞的表面标志物[1]。本实验检测发现p75NTR在舌鳞状细胞癌细胞系Tca-8113及Cal-27中都有阳性表达，且其阳性率分别为3.1%和1.9%。这与以往报道中肿瘤干细胞数量相当[7-8] 。

肿瘤细胞的克隆形成能力与其致瘤能力呈正相关[9]，并且只有肿瘤干细胞具有单克隆形成能力和强致瘤性[10-11]。本研究单克隆培养实验发现两个细胞株的p75NTR阳性细胞的体外单克隆形成能力相对于未分选的细胞均显著增强，符合其是具有自我更新能力的肿瘤干细胞的理论。同时，本实验利用流式细胞仪检测发现单克隆4周后的p75NTR阳性细胞的p75NTR阳性率明显下降，其分化产生了大量p75NTR阴性细胞，该结果说明p75NTR阳性细胞具有较强的克隆形成能力并具有一定的分化潜能。

本研究用MTT法对舌鳞状细胞癌细胞株Tca-8113和Cal-27中的p75NTR阳性细胞及未分选细胞的体外增殖能力进行测定，发现p75NTR阳性细胞的生长速度明显快于未分选的细胞，这也表明p75NTR阳性细胞具有较强的增殖能力，符合其作为肿瘤干细胞的特性。侵袭转移是恶性肿瘤最重要的生物学行为，是导致手术、放疗、化疗失败和患者死亡的主要原因。划痕实验证明p75NTR阳性细胞具有更强的迁移能力。由于2种细胞的生长速度差别较大，所以在划痕实验中没有做同期的横向比较。

综上，笔者认为p75NTR可作为舌鳞状细胞癌干细胞的一种表面标志物。由于本课题组前期实验发现p75NTR在正常舌组织中是阴性表达的[12]，那么针对p75NTR这个新的靶点对肿瘤进行的治疗就不会对正常舌干细胞构成伤害。当然，针对临床应用还需要更深入的研究，但是相信随着研究的不断进展，其将有望为舌癌的临床预防和诊治开辟新的思路和策略。

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细胞生物学的研究范文第2篇

病理性瘢痕包括增生性瘢痕(Hypertrophic Scar，HS)和瘢痕疙瘩(Keloid，K)，是因成纤维细胞增殖，生长失控、胶原过度沉积导致真皮纤维化。K表现为侵袭性瘤样生长，而HS却随时间推移有自然软化趋势，可见在形成机制方面还有不同之处。虽然目前病理性瘢痕形成的机制还不太清楚，但这方面的研究却方兴未艾，本文就近年来对病理性瘢痕发生机制的研究综述如下。

1　病理性瘢痕形成的机制研究

1．1　肌成纤维细胞在瘢痕形成中的作用：正常创面愈合过程中的创面收缩或过度愈合引起的病理性瘢痕以及各种纤维化疾病中，肌成纤维细胞(Myofibroblast，MFB)的作用越来越受到学者们的广泛关注。MFB最主要的特征是胞质中出现完整的细胞骨架结构，包括微丝、微管系统。它除了表达胞浆肌动蛋白外，还可以与以下四种主要表型共同表达：①波型蛋白(vimentin)；②波型蛋白和结合蛋白(desmin)；③波型蛋白和a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)；④波型蛋白、结合蛋白和a-SMA。并且还证明MFB可以表达不同的平滑肌肌浆球蛋白重链(MHC)，表明MHC表型对进一步鉴别分化好的MFB不同表型意义较大。而a-SMA是体内MFB最常见的标志，其次是波型蛋白，因此可用a-SMA鉴定MFB。

在增生性瘢痕及纤维化病灶中，a-SMA阳性的MFB持续存在。免疫组化显示a-SMA阳性的MFB主要存在于HS结节状结构中，而K中则几乎不存在MFB。因为瘢痕疙瘩的特性为几乎不萎缩也不发生挛缩，内含粗大的胶原纤维，而增生性瘢痕则会发生萎缩也易挛缩，内含散乱的细胶原纤维，所以有理由认为瘢痕的挛缩与其中所含的MFB有关。另外，在证实了胎羊、胎鼠等在胎内前2／3的时间伤口不产生瘢痕，而到后1／3时间伤口会出现瘢痕愈合基础上，Estes等通过透射电镜及免疫组化方法研究了孕早期及孕晚期胎羊伤口MFB发生情况，发现孕75天制作的伤口中无a-SMA，而在100～120天制作的伤口中大量表达。电镜下可见细胞中微丝逐渐增多、排列也渐规则，并发现伴有连接纤维形成，说明MFB在瘢痕形成过程中可能起到一定作用。

1．2　病理性瘢痕形成和细胞凋亡的关系：细胞凋亡为细胞的一种主动性细胞自杀行为。在生理情况下，细胞凋亡起到调节细胞数量、便于形态发生、去除有害或异常细胞、清除已完成功能的细胞等作用；在病理情况下，凋亡不足或过度，均可导致疾病发生。最近有研究证实，人体的系统性硬化疾病中，存在成纤维细胞的凋亡增加及细胞外基质的增加。通过电子显微镜与原位末端DN断标记技术发现，肉芽组织向瘢痕组织转变期间，随着伤口的愈合，肌成纤维细胞和血管细胞的凋亡增加，并推测凋亡缺乏可能在病理性瘢痕的形成发展中发挥了重要作用。通过TUNEL及免疫组经技术发现，增生性瘢痕中存在细胞凋亡现象，增生性瘢痕消退过程中，成纤维细胞数量的减少与成纤维细胞的增加相一致。由此可认为，MFB凋亡不足和增加，是增生性瘢痕产生和消退的原因。Luo，Funayama等研究发现在瘢痕疙瘩组织中同时存在细胞增生、坏死和凋亡。Mcssadi等通过标记定量研究发现，正常皮肤成纤维细胞凋亡率比瘢痕疙瘩高2倍，凋亡相关基因表达也下降。Chen等通过基因芯片对8400条人基因研究检测发现，普通瘢痕与瘢痕疙瘩相比，有402条基因的表达有区别，其中有250条基因上调，152条基因下调，有8种凋亡基因表达过低。由此推断，瘢痕疙瘩不能正常凋亡并持续产生胶原，是其不断增生的原因之一。

1．3　Bcl-2对病理性瘢痕的影响：病理性瘢痕均是以细胞增殖所致的疾病。Bcl-2是参与细胞增殖与凋亡的重要调节基因，对细胞凋亡具有直接抑制作用，并能促进细胞的存活。我们的调查表明：Bcl-2可促进成纤维细胞的增殖，抑制成纤维细胞的凋亡。减少凋亡，延长存活的作用，必然导致胶原蛋白合成沉积增多，从而促使皮肤纤维化发生。

1．4　氧自由基和病理性瘢痕的形成：氧自由基是体内各种代谢反应的中间产物，化学性质活跃，很容易与其他分子或自由基发生氧化还原反应，生成新的自由基，由此引发连锁反应，它具有重要的生理功能，同时也与人体多种疾病密切相关。丙二醛(MDA)是自由基与生物膜中的多价不饱和脂肪酸作用发生脂质过氧化反应生成的终产物，它的产生与脂质过氧化平行，测定其含量不仅可反映脂质过氧化的程度，同时也间接反映了机体细胞损伤的程度。李伟人等通过测定病理性瘢痕中丙二醛的含量，发现增生性瘢痕与瘢痕疙瘩中丙二醛含量均较正常人皮肤明显升高(ρ＜0．05)，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩比较无差异(ρ＞0．05)，表明在病理性瘢痕中脂质过氧化程度加重，局部组织细胞由于遭受自由基攻击也可能发生了一定程度的损伤。而引起病理性瘢痕局部自由基产生和清除失衡的原因可能与生成增多有关。Wan等的研究也表明病理性瘢痕中与自由基生成有关的补体C3和游离铁含量明显高于正常皮肤。在成熟瘢痕中丙二醛含量与正常人皮肤比较无差异，则可能是因为自由基生成与清除已恢复平衡，从而脂质过氧化程度也趋于正常。同时我们也注意到，与成熟瘢痕相比增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中MDA含量非常显著升高(ρ＜0．01)，提示通过减轻脂质过氧化程度可能有助于防治病理性瘢痕的形成。

2　瘢痕疙瘩形成机制的研究

K是继发于皮肤损伤，如创伤、烧伤或手术后，以胶原过度沉积为特征的皮肤疾病。其形成机制的研究，目前在细胞、分子生物学及遗传学方面比较活跃。

2．1　抗瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的研究：K组织中成纤维细胞(fibroblast，FB)过度增生，大量的细胞外基质沉积和向正常皮肤侵袭、生长从而形成K，其原因是瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid derived fibroblast，KFB)凋亡受阻引起的。Saed等在所有KFB的p53exon4编码72位点，检测到精氨酸脯氦酸的置换，而HS和K患者正常皮肤等标本未发现异常，提示p53基因为KFB后天获得性突变的高发区，并且该基因精氨酸／精氨酸纯合型患者耳部K的发生率明显增加，而脯氨酸／脯氨酸纯合型患者发生HS的几率增加。卓阳等认为，p53脯氨酸等位基因频率的检测，可作为K高危个体的判断标志。鲁峰在20％(2／10)的K标本中发现，fas exon9编码区的“A”碱基的移码突变，提示编码fas“死亡区”结构基因的突变，可导致fas蛋白功能丧失和K细胞凋亡障碍。Bel-2、c-jun和c-fos原癌基因与FB的增殖有关。在增生期，HS和K的基底细胞、散在的FB样细胞和血管周围纺锤形细胞强烈表达Bcl-2，而c-jun和c-fos mRNA及其蛋白分子，则主要分布于真皮FB样细胞和血管周围细胞，

正常皮肤未见上述异常表现，推测活跃的KFB增殖与Bcl-2蛋白和c-jun、c-fos转录和翻译水平增加有关。1999年有研究发现，K组织中有64种凋亡诱导相关基因表达下降。K基因表达的重新编程或真皮模式的病态分化，可能涉及K的发病机制，可作为K的病理诊断标志和治疗策略。KFB凋亡普遍依赖caspase-9的活性作用。KFB凋亡相关基因表达的失衡，表面为转化生长因子(Vansforming growth factor TGF)β1活化以及p53、fas及caspase-3、caspase-8、caspase-9表达缺失，表明KFB凋亡抗性基因位点位于caspases上游。

在K形成的过程中，局部生长因子非主要因素，起关键作用的是KFB对生长因子的敏感性，即通过上调KFB胞膜上生长因子受体的数量，提高外源性刺激信号的转导能力和效率，是其细胞增殖和凋亡抑制的主要原因之一。IGF和TGF-β1，通过促纤维化效应和丝裂原效应，刺激FB增殖和瘢痕形成，是与KFB凋亡抗性关系密切的细胞生长因子。此外，肿瘤坏死因子-α在上调KFB抗凋亡能力中也发挥重要作用。

2．2　角质形成细胞的异常作用：表皮-真皮相互作用是近年来创伤修复研究的热点。表皮角质形成细胞通过自分泌、旁分泌和内分泌作用，调节组织内环境稳定和细胞增殖、分化和凋亡。在增生期K和HS表皮-真皮交界区域Bcl-2阳性，FB增多，提示表皮-真皮之间的相互作用，参与了病理性瘢痕的形成。KFB凋亡障碍可能与K低氧环境有关，即K微血管闭塞和缺血缺氧环境能诱导KFB和血管内皮细胞等表达Tβ1和缺氧诱导因子-1。后者可诱导抗凋亡蛋白Bcl-2表达，并可经P13-激酶通路激活抗凋亡激酶(Akt／PKB)，以维持细胞的功能和低氧适应性。

2．3　瘢痕疙瘩与langerhans细胞：K及HS组织中S-100蛋白及Cala免疫反应阳性的Langerhans细胞明显增多。Langerhans细胞与K形成关系密切。瘢痕过度增生的原因之一可能是由于病变部位Langerhans细胞增多，造成成纤维细胞过度合成胶原和细胞外基质，最终结果造成了胶原的过量沉积。HS临床表现类似于K，两者表皮组织中的Langerhans细胞均明显多于正常皮肤，且无明显差异，说明两者在形成机制方面存在某些相同处。

2．4　瘢痕疙瘩与染色体2q23、7P11及易感基因：最近，Mameros等通过瘢痕日本家系和非洲裔美国人家系进行遗传学研究后发现，日本家系与染色体2q23连锁，非洲裔美国人家系与染色体7p11连锁，他们还报道了一个有10人发病的非洲裔美国人中等大小的瘢痕疙瘩家系进行同样的研究，却未发现与2q23和7p11存在连锁关系，说明瘢痕疙瘩易感基因位点存在异质性。虽然单个基因的突变可以导致对瘢痕疙瘩产生特异的易感性，但是不同人群瘢痕疙瘩的发病率不同，而且发病年龄、临床表型和对人不同治疗的反应，也存在差异，说明不仅是一对基因参与瘢痕疙瘩的发病。其发病机制可能是由于若干对微效基因(minor gene)。最近，张刚等采用比较基因组杂交方法检测了6例瘢痕疙瘩患者的染色体后发现染色体1q、16q、20q和22q存在部分缺失，推测这种缺失导致抑制性基因的丢失，造成瘢痕疙瘩的发生和发展，从而认为瘢痕疙瘩的发病可能与染色体的结构畸变有关。

3　增生性瘢痕形成机制的研究

3．1　TGF-β3对增生性瘢痕形成的生物学作用：增生性瘢痕是现代外科治疗难点，转化生长因子β(TGF-β)在组织纤维化中具有重要作用，TGF-β是明显的促瘢痕形成因子，而TGF-β3可减少TGF-β1、TGF-β2的产生，从而减少细胞外基质(ECM)合成，因此，TGF-β3，有可能是人体内在的抗瘢痕形成因子。TGF-β家族是细胞生长、分化、ECM合成与代谢的多功能调节因子。哺乳类动物TGF-β是三种异构体，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，而这三种异构体在体内分别具有不同的功能以维持平衡，这种平衡被打破将会导致组织器官纤维化。TGF-β1是具特征性的促纤维化形成因子，通过自分泌和旁分泌机理，刺激成纤维细胞产生胶原及其基质成分并沉积。Shah等对成纤维细胞体外培养研究发现，TGF-β1和TGF-β2中和抗体有明显抑制成纤维细胞增殖，减少胶原蛋白等ECM合成，而无型别特异性的TGF-β多克隆抗体却无此作用。因此认为纤维化疾病可能是TGF-β异构体表达失衡所致。

3．2　Smad2、Smad7与增生性瘢痕：Smads蛋白家族是近年来发现的转化生长因子β1，受体下游信号蛋白，也是目前公认的介导TGF-13。胞内反应的主要通路。TGF-β1是与瘢痕形成最密切的细胞因子。Smads是TGF-β1的下游信号蛋白，Smad2和Smad7分别起正性和负性调节作用。已知在增生性瘢痕中TGF-βⅠ、Ⅱ型受体明显增加。因此我们推测，Smad2信号通路在细胞内异常持续地激活和(或)smad7抑制作用逐渐减弱，是增生性瘢痕形成的原因。Smads在细胞核内的正确定位是信号转导的前提。NSF组织有少量磷酸化Smad2表达且位于细胞质中；HSF组磷酸化Smad2表达量增多且位于细胞核中，表明其可持续激活靶基因转录，导致增生性瘢痕的形成。

3．3　增生性瘢痕相关蛋白p311：有学者曾利用基因芯片技术，对烧伤后同体早期HS与正常皮肤组织的差异表达基因进行筛选，找出97条相关基因并逐一分析，结果显示p311(Genebank ID：hsu36189)基因表达差异显著。同时，Pan等也报道了p311基因的编码蛋白p311能够促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，进而可能影响创伤修复甚至纤维化的发生发展过程。p311的编码蛋白由68个氨基酸组成，相对分子质量为8×103。p311在细胞分化过程中可能扮演着转录因子转录活性的角色。目前之所以关注P311，一则是因为p311基因在早期的HS中呈高表达，另则是因为它能够促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。而肌成纤维细胞又是创伤不全愈合过程以及肿瘤间质反应中影响纤维化过程的重要靶细胞。这也暗示P311可能通过肌成纤维细胞影响创伤修复甚至纤维化与HS的发生发展过程。

3．4　组织缺氧与增生性瘢痕的关系：缺氧促使成纤维细胞合成大量的胶原，上调TGF-β的分泌，TGF-β能够进一步促

进胶原的合成，大量胶原纤维的存在势必导致氧弥散功能的下降；在创伤后早期肉芽组织内就有血管闭塞现象，在增生性瘢痕组织内可见大量闭塞、半闭塞性的毛细血管，与血管内壁增多的内皮细胞有关。缺氧导致胶原合成增加和血管闭塞，两者进一步加重缺氧，反复循环，最终导致增生性瘢痕的形成，但持续的缺氧使胶原合成受限使瘢痕转向成熟。用原位杂交技术对增生性瘢痕进行分析：成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ胶原增加，尤其在靠近血管网的部位；TGF-β不但能为成纤维细胞而且能为血管内皮细胞所分泌。说明TGF-β能通过自分泌、旁分泌调节胶原的合成。增生期的增生性瘢痕的氧分压是降低的，随着瘢痕的成熟，组织氧分压才逐渐接近正常组织水平，增生性瘢痕外观颜色鲜红，表现为血液供应丰富，这与组织低氧分压表现并不一致，原因在于过度增生的胶原纤维结节阻碍了瘢痕组织的氧气交换，也可能是瘢痕组织增生活跃氧耗增加，使瘢痕组织貌似血供丰富，其实处在缺氧状态。

3．5　皮肤圆锥体结构损伤和增生性瘢痕：梁智等通过对雌性杜洛克猪(female red duroc pig，FRDP)的皮肤圆锥体结构损伤情况进行观察，发现浅创面组FRDP皮肤圆锥体结构的上半部分受损，但脂肪穹隆以及腺体完好，可见圆点状结构和均匀的出血点，愈合后无瘢痕形成。深创面组皮肤圆锥体结构的上半部分缺失、下半部分受损，伤及脂肪穹隆及腺体，未见圆点状结构和均匀的出血点，愈合后有瘢痕形成。创面愈合及瘢痕形成情况：浅创面组创面在伤后3周内愈合，较为平整，无瘢痕组织形成；深创面组创面愈合时间在伤后4周以上，较厚、无毛发、挛缩、质地坚硬、局部色素变浅或加深。深创面组伤后10、30天皮肤的变化与浅创面组相似，成纤维细胞和炎性细胞主要存在于圆锥体结构周围，脂肪穹隆逐渐变小，并被炎性细胞所填充；伤后150天愈合的创面明显增厚，有明显的瘢痕组织形成。深创面组伤后时间越长，瘢痕越厚；伤后150天瘢痕增生达高峰。圆锥体结构的深层部分受损可导致HS的产生。VVG染色计分显示，不同深度创面在不同时相点形成瘢痕的规律是创面越深，瘢痕越厚。由此说明，皮肤圆锥体结构受损与HS的形成有一定关系。

细胞生物学的研究范文第3篇

【关键词】 细胞生物学 双语讨论课 教学改革

随着生命科学的新知识新进展不断涌现，经典的细胞生物学也逐渐向分子细胞生物学发展，细胞生物学课程教学内容和方法手段也应该不断丰富和调整。学科的不断渗透，知识点的不断前沿化成为了细胞生物学课程教学的新的触点[1]。课堂讲授的形式和内容已远远不够，如何提高学员自主学习能力、及时掌握学科领域最新进展的能力是细胞生物学教学面临的新问题[2]。提高学员专业英语水平，尽早进行专业技能培训是解决上述问题的重要举措之一。为此，我们在医学本科生《细胞生物学》课程的教学中首先开展了双语讨论课，使学员在关注学科前沿的同时，专业英语阅读和交流等方面的能力也得到初步的锻炼，并就教学方法和模式进行了一些有益的尝试。

研究对象与方法

1.研究对象

选取第四军医大学2011年度开设细胞生物学课程的五年制临床医学和口腔医学一年级本科生共493名学员作为研究对象。

2.研究方法

双语讨论课按以下步骤实施。讨论课的形式以小班课进行，每小班分成7组，每组5-6人。由全体教员商讨确定7个讨论主题，分别是：1. 细胞如何死亡——自噬的功与过 (How dose cell die? Merits and demerits of cell autophagy)。2.端粒与肿瘤 (Telomere and cancer)。3. 原核细胞骨架 （Procaryon cytoskeleton）。4. RNA家族的新成员：siRNA. miRNA和piRNA。（The new members of RNA family- siRNA, miRNA and piRNA）

5. 诱导多能干细胞(iPS)与细胞重编程(Inducing multipotent stem cell and cell re-programming)。6. 线粒体与细胞凋亡 (Mitochondrion and cell apoptosis)。7. 内质网应激与疾病进展 (Endocytoplasmic reticulum stress and disease progress)。

讨论课前一个月将讨论主题公布于全体学员，学员以小组为单位，每个小组确定一个讨论主题，并自行完成小组内部项目分工，包括查阅英文资料、撰写综述报告和制作幻灯，并确定一名主讲学员。每个小组可自行选择采用中文或者英文形式汇报（鼓励英文汇报）。在讨论课前夕，组织所有主讲学员预讲一次，由教员提出修改补充意见。讨论报告会由全体教员和学员参加，分专题进行报告和讨论，每个主讲学员报告完毕，台下学员可以用中英文自由提问，台上学员解答，最后由教员总结。

3.结果分析

（1）教员根据学员在文献综述、幻灯汇报及讨论交流等表现多方面综合评价双语讨论课实施结果。

（2）课后进行问卷调查，教员归纳出学员对相应调查内容的反应，形成结果报告。

结 果

1.双语讨论课实施结果

本次讨论课有493名学员和2011年度全体代课教员参加，每个小班有7名学员上台主讲。报告过程流畅，内容充实，信息量大，重点突出，英文表述清晰，幻灯片制作新颖别致。台下学员在听完汇报后积极发表自己的观点和看法，并向主讲学员提问，对目前一些细胞生物学的热点问题，讨论更是激烈。本次讨论课采用英文讲解和提问的人数统计结果见表1，有81.5% 的主讲学员采用英文形式讲述，有44.9% 的学员采用英文提问。

2.问卷调查结果

在讨论课实施后，我们又针对这次讨论课的改革试验效果进行了一次问卷调查。问卷内容及结果见表2。

本次调查共发放调查问卷493份，其中有效问卷493份。有效率为100%。由表2可知，被调查的学员中，有98.6％的学员认为细胞生物学双语讨论课这种形式很好，有93.1％的学员认为采用双语形式对专业学习是有帮助的。

讨 论

1. 通过双语讨论课，提高学员的自主查阅所需要知识的能力

面对当前知识大爆炸的社会，如何从海量的信息中获得自己所需要的知识，这就需要学员具备快速筛选、去伪存真，获得有用信息的能力， 而我国学生在这方面的能力比较欠缺。通过这次双语讨论课的实施，许多学员第一次尝试使用了维普，Pubmed, Sciencedirect等数据库，并开始尝试在专业的医学或生命科学网站上搜索资料，初步学会了从海量的信息中寻找自己所需要的信息的能力，为他们今后科研及医疗能力的提高打下了基础。

2. 通过双语讨论课，提高学员阅读英文文献和用英文表达交流的能力

通过查阅英文原版文献，学员的英文文献阅读能力大大提高。许多学员表示，通过英文文献的阅读使他们感到阅读英文并不是一件枯燥无味的事情，而是结合在自己感兴趣的知识领域阅读，在掌握知识的同时显著提高了英文阅读能力。通过在课堂上的英文讲解和讨论，使得学员英文发音，口语表达等能力也得到了相应提高。

3. 通过双语讨论课，提高学员对生命科学前沿知识的关注度

通过直接查阅《Cell》、《Nature》及《Science》等这些细胞生物学专业顶级杂志，获得第一手的英文原版信息，使学员们深切体会到，细胞生物学乃至整个生命科学并不是深奥不可理解的，作为大学一年级的新生也可以通过查阅英文文献等方法直接接触科学领域的前沿研究进展，因此更激发了学员的学习热情。通过双语讨论课教学，使学员更加关心科学时事，扩展了知识面，进一步提高了专业修养。学员通过对文献的设计思路、研究手段、取得结果的分析初步了解了研究科学问题的思维脉络，明白应该怎样去发现科学问题，怎样去研究科学问题。通过设立讨论课，学员普遍对细胞生物学这门学科产生了浓厚的学习兴趣，并对自主式学习有了较深入的了解，学员对于英文原版专业书籍、辅导材料、生命科学网络资源、专题讲座等方面的需求明显增加。

4. 几点问题有待进一步完善

讨论课结束后，我们还组织学员对这种教学模式进行了探讨，学员们表示仅仅通过课堂讲解对所学知识印象浅，通过改变灌输式教学法而采用互动教学模式，可以提高自主思考、独立学习的能力，同时加深对重点内容的理解。学员建议可适当增加双语讨论课次数，并希望部分讨论题应由学员自己选题，题目应更贴近学员感兴趣的细胞生物学前沿课题。还有部分学员表示希望教员在课堂讲解时适当加入双语讲解，以便学有余力的学员掌握。

结 语

通过双语讨论课的实施，我们意识到通过不断引导学员采用多种方法去学习专业课，使得学员的思维方式和掌握知识的方法都有了明显的改变，由“死记硬背，被动接受”转变为“活学活用，兴趣浓厚”，这正是学员综合素质提高的具体表现之一。教学过程包括“教”和“学”两个方面，由教员和学员的共同活动所构成。如何处理好教员和学员的关系，如何处理好“教”与“学”的关系，既要调动教员教的主动性与积极性，想方设法改进教学方法，同时又要把最佳学习方法交给学员，充分利用有限的资源，最大限度地调动学员学习的主动性和积极性，这对提高学员自学能力、解决实际问题的能力、增强学员学习兴趣、拓展知识面，培养有国际视野的合格人才具有十分重要的作用。同时，在改进教学方法的过程中我们认识到：作为一名教员，必须注重提高自身素质，不断进行知识结构和教学手段的更新，在力争使学员与教员思维同步的同时努力使教员与本学科的发展同步[3]，在教学的过程中不断总结经验，进一步完善教学手段和教学方式，把细胞生物学的教学水平提高到一个新的层次。

参考文献：

[1]蒋建利，刘宏颀，边惠洁等.细胞生物学讨论课教学改革尝试［J］.西北医学教育，2004,12(1):56-57.

[2]张思河，陈志南，邢金良，蒋建利.医学本科生细胞生物学双语教学调查评价［J］.西北医学教育，2005,13(1):59-62.

细胞生物学的研究范文第4篇

【摘要】 为了了解冻存复苏过程对骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cell，MSC) 生物学特性和支持造血能力的影响，采用常规方法分离培养骨髓MSC，将传代后的细胞用含10％二甲亚砜、40％胎牛血清的IMDM细胞冻存液保存在-196℃液氮中，观察短期（4周）和中期（9-15月）复苏后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力，并同冻存前的MSC进行比较。 结果表明：中短期冻存后的MSC的细胞活性分别为(90士3.75)％和(93士2.51)％；冻存后细胞的增殖能力、免疫表型、体外分化为脂肪和骨细胞的能力、支持集落（CFU-GM，CFU-E，CFU-GEMM）的生长作用和冻存前MSC相似。结论：骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后，细胞活性略有下降，但是并不影响MSC的增殖、分化和支持造血能力。

【关键词】 支持造血

Biological Characteristics and Ability of Supporting Hematopoiesis of Bone Marrow Mesenchymal

Stem Cells Pre-and Post-Cryop-reservation

Abstract This study was aimed to observe the biological characteristics of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cell (MSC) and to examine their abilities to support in vitro hematopoiesis.Bone marrow MSC were cryopreserved in -196℃ liquid nitrogen for 4 weeks (short term) and 9-15 months (medium term) with IMDM containing 10% DMSO，40% fetal calf serum as cryoprotectant.The viability，proliferation，immunophenotype，in vitro differentiation and ability of supporting hematopoiesis of thawed MSC were investigated and compared with these of pre-cryopreserved MSC.The results showed that the cell viability were (93士2.51)％ and (90士3.75)％ for MSC cryopreserved as long as 4 weeks or 9-15 months respectively.However，there were no changes detected，as compared with pre-cryopreserved MSC in immunophenotype，abilities of proliferation and supporting colony forming of CFU-GM，CFU-E and CFU-GEMM.It is concluded that bone marrow-derived MSC can be stored in liquid nitrogen for short-term (4 weeks) or medium-term (9-15 months) without changes of abilities of proliferation，differentiation and hematopoiesis support.

Key words cryopreservation; mesenchymal stem cell； hematopoiesis support

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有多向分化和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果［1-4］。将培养后的MSC冻存，在患者需要MSC治疗时给予输注，具有很好的临床应用前景。但是，冻存是否会影响MSC的生物学特征，我们尚不清楚。因此，本研究将骨髓来源的MSC冻存于-196℃液氮中，观察中期和短期冻存后MSC的增殖、分化和支持造血的能力并同冻存前的MSC进行比较，为进一步在临床中的应用提供详尽的实验依据。

材料和方法

试剂

IMDM、DMEM、DF12、MCDB培养液、胎牛血清、马血清和甲基纤维素均为Gibco公司产品。鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR抗体购自PharMingen公司; rh-SCF、 GM-CSF、 EPO、 IL-3购自Peprotech公司;胰酶、EDTA、全反式维甲酸、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤（IBMX）和二甲亚砜（DMSO）购自Sigma公司。

MSC的分离和培养

骨髓来自8例健康志愿者（年龄18-34岁，平均29岁）。髂后上棘抽取骨髓，用淋巴细胞分离液（密度1.077）400×g 离心20分钟，取白环以上细胞部分，计数后接种于含40% MCDB、2% FCS的DF12培养液中，置37℃、5% CO2培养箱中培养，24小时后换液，去除未贴壁细胞。当细胞达到70%融合时，常规消化传代。

MSC的冻存和复苏

将1×106细胞加入含10％ DMSO和40% FCS的IMDM中，总体积1.8 ml。先置于-80℃冰箱中，第二天转入-196℃中冻存。将中期9-15个月（平均13个月）和短期（4周）冻存的MSC置于37℃水浴中快速复温，冻融后加入8 ml IMDM混匀后离心，然后再用IMDM洗涤1次，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养。第2天，更换新鲜培养液。

细胞活性和增殖能力测定

应用台盼蓝拒染回收率（TBR）试验检测复苏细胞的活性，TBR(%)＝冻存后活细胞计数/冻存前活细胞计数×台盼蓝拒染率×100％。将冻存前后的MSC接种在24孔板中（5×103细胞/孔），置37℃、5% CO2培养箱中培养，每隔1天取2孔细胞进行计数，计算均值，绘制生长曲线。

细胞免疫表型分析

用含20 g/L BSA的PBS将胰酶消化后的MSC制成1×106 cells/ml的细胞悬液。每个上机试管中加入500 μl细胞悬液，先加入鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR单克隆抗体，同时设空白对照，于4℃孵育30分钟，PBS洗3遍。再加入FITC标记的羊抗鼠IgG，4℃孵育30分钟，PBS洗4遍，用流式细胞仪检测。使用cellquest软件获取并分析数据。

体外诱导多向分化检测

成骨诱导 将5×104细胞接种于6孔板中，加入含10-7mol/L地塞米松、10 mol/L β磷酸甘油、0.05 mol/L维生素C和10% FCS的IMDM，3周后应用von Kossa染色检测钙化小结。

脂肪诱导 将5×104细胞接种于6孔板中，加入含10-6 mol/L地塞米松、0.5 mol/L IBMX 、0.1 mol/L维生素C和10% FCS的IMDM，7天后油红O染色检测脂肪滴。

支持造血的能力测定

将冻存前后的骨髓MSC用10.0 Gy 60Co γ线照射，然后更换为长期培养液（含12.5％ FCS、 12.5%马血清、2 mmol/L谷氨酰胺、10-6 mol/L 氢化考的松的IMDM）。获取健康人骨髓单个核细胞，预先培养4小时以去除贴壁细胞，将悬浮细胞按照1×106/ml接种在照射后的MSC中，在37℃、5% CO2条件下培养，每周半量换液。4周后获取全部细胞接种于甲基纤维素体系中测定其集落形成能力。培养体系为: IMDM中含30%马血清、1% BSA，2 mmol/L谷氨酰胺、1×10-4/L β2巯基乙醇、1%甲基纤维素和重组细胞因子。细胞因子包括: rhSCF 50 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，GM-CSF 50 ng/ml 和EPO 4 U/ml。集落形成实验在24孔培养板中进行，于37℃、5% CO2条件下培养14天。每孔接种1×106个细胞。14天后在倒置显微镜下计数集落，50个以上细胞为1个集落。

统计学分析

采用SPSS 11.0软件进行统计分析，实验数据用平均值±标准误表示，组间比较应用方差分析。

结 果

骨髓MSC的形态特征和生长特点

于倒置显微镜下，冻存前骨髓MSC为成纤维样，胞浆丰富，核染色质细，核仁明显，平行排列或旋涡样生长。根据细胞生长曲线，骨髓MSC的倍增时间约为42.03士2.41小时。细胞形态和倍增时间随着细胞传代并不发生改变。

冻存后MSC的活性率和增殖能力

骨髓MSC的活性率（TBR）随着冻存时间的延长略有下降。短期冻存MSC的TBR为93士2.51％；中期冻存MSC的TBR为90士3.75％。二者之间并没有显著性差异。冻存后MSC的增殖能力同冻存前相比较，没有明显差异。依据生长曲线可以得出短期和中期冻存后骨髓MSC的倍增时间分别为39.54士3.53小时和41.64士1.68小时。

冻存前后MSC的免疫表型

通过流式细胞仪检测冻存前后骨髓MSC的免疫表型发现，冻存前后MSC均表达CD29、CD44、CD105，而CD11b、CD31、CD34、CD45和HLA-DR均为阴性(表1)。CD分子的表达量在冻存前后略有不同，但均不存在显著性差异。Table 1.Flow-cytometric phenotype analysis of adult bone marrow derived MSC before and after cryopreservation（略）

多系分化的鉴定

成骨分化 2周后细胞聚集成集落，并有少量钙盐沉积，继续培养1周，细胞呈现多层生长的结节状，并有大量钙盐沉积，而对照组细胞仍为单层生长，无钙盐沉积。von Kossa 染色证实为钙盐沉积(图A)，对照组无上述现象出现。

成脂肪分化 3-5天后发现少量细胞中有小脂肪滴出现，继续诱导，1周后可以看见大部分细胞胞体变大，胞浆出现大量脂肪滴，油红O染色证实为脂肪滴(图B)，而对照组细胞胞浆中无脂肪滴出现，油红O染色为阴性。

冻存后的MSC同样具有成骨和成脂肪分化能力(图C，D)。

支持造血作用

为了评估冻存是否影响MSC支持造血的能力，将骨髓单个核细胞接种于照射过的冻存前和复苏的MSC中，在长期骨髓培养液中培养4周后检测CFU生成情况。如表2所示，冻存前后MSC均具有支持造血作用。CFU-GM，CFU-E和CFU-GEMM的产率在以冻存前、短期冻存和中期冻存后MSC为滋养层的骨髓长期培养体系中并无显著性差异。Table 2.Hematopoiesis supported by MSC in long term bone marrow culture（略）

讨 论

MSC是造血微环境中主要组成部分，通过合成、分泌多种造血因子和黏附分子来调控造血干细胞的增殖、分化和自我更新。既往研究显示，MSC可以合成并分泌多种造血细胞生长因子，具有维持长期培养起始细胞(LTC-IC)的能力，促进造血干细胞的增殖和分化［5］。联合MSC的移植方案还可以促进HSC的植入和移植后的造血恢复［6］。但是，在体外培养扩增中，MSC的增殖能力会逐渐下降并发生分化，支持造血的能力减弱。将扩增后或者增殖旺盛的MSC进行冻存，在需要的时候复苏培养，可以有效地解放上述问题并确保提供足够的MSC应用于临床。

既往的大量研究显示，造血干细胞可以在液氮中长期冻存，复苏后仍然具有良好的造血重建能力。但是，MSC经过低温冻存和复苏，其增殖和分化能力、支持造血功能是否受影响，尚不明确。因此，我们观察了骨髓MSC经过短期（4周）和中期（9-15月）冻存后的生物学特性和支持造血能力。结果显示，经过中期和短期冻存后MSC的形态并未发生改变，仍为梭形，贴附在培养瓶底。冻存后MSC的活性略有下降，但冻存并不影响细胞的增殖能力，冻存前和中期、短期冻存后MSC的倍增时间在40小时左右，经统计学分析不具有显著性差异。通过FACS检测，冻存前后的MSC的免疫表型没有明显改变，表现为CD29、CD44和CD105为阳性，而CD11b、CD34、CD31、CD45、和HLA-DR为阴性。多向分化能力是MSC的主要特征之一，我们将经过中期和短期冻存后MSC诱导向脂肪和骨分化，结果显示冻存后MSC仍然具有向脂肪和骨分化的能力，而且这种分化能力，并不随着复苏后细胞的传代而发生变化。由此可见，中期和短期冻存并不影响MSC的生物学特性。

支持造血是骨髓MSC的重要功能之一，冻存后MSC支持造血能力是否发生变化将直接影响MSC的临床应用。Majumdar等［7］的研究显示，骨髓MSC可以分泌多种造血生长因子，具有支持造血作用，能促进骨髓来源的CFU-GM，CFU-E，CFU-Meg和CFU-GEMM的增殖。但是冻存后MSC支持造血能力如何变化，既往并无报道。在本实验中，我们通过检测体外长期培养体系中集落形成情况来评估冻存后MSC对造血干细胞的支持作用。骨髓单个核细胞在以冻存前、短期冻存和中期冻存后MSC作为滋养层的骨髓长期培养体系中培养，4周后的骨髓单个核细胞的CFU生成率在各体系之间没有显著性差别。这说明经过中期和短期冻存后MSC仍具有支持造血能力，同冻存前比较，支持造血能力没有明显变化。进一步分析上述不同培养体系中CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的生成情况，结果表明：冻存前后MSC均可以促进CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的增殖，而且MSC促进定向祖细胞的增殖能力在冻存前后没有明显差别。这些结果表明，冻存并不影响MSC促进不同阶段造血祖细胞增殖、分化的能力。

综上所述，本研究通过体外实验初步证实：经过中期和短期低温冻存的骨髓MSC并不改变其固有的生物学特性。虽然冻存可以导致部分细胞损伤，但是并不影响剩余细胞的增殖能力和多向分化能力。此外，冻存后的MSC仍然具有支持造血的功能。但是，冻存后MSC是否在体内仍具有上述生物学性状和支持造血功能，尚需进一步研究证实。

【参考文献】

1Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of me-senchymal stem cell derived from adult marrow.Nature，2002; 418（6893）: 41-49

2Krause DS，Theise ND，Collector MI，et al.Multi-organ，multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell.Cell，2001; 105: 369-377

3Noort WA，Kruisselbrink AB，in’t-Anker PS，et al.Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood-derived CD34 (+) cells in NOD/SCID mice.Exp Hematol，2002; 30: 870-878

4Koc ON，Gerson SL，Cooper BW，et al.Rapid hematopoietic reco-very after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy.J Clin Oncol，2000; 18: 307-316

5Majumdar MK，Thiede MA，Mosca JD，et al.Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells.J Cell Physiol，1998; 176:57-66

细胞生物学的研究范文第5篇

【关键词】 基质细胞衍生因子1;CXC族细胞因子受体4;缺血性心脏病;干细胞治疗;文献综述

基质细胞衍生因子-1(stromal cellderived factor l，SDF1)是由骨髓基质细胞产生的CXC型趋化因子，CXC族细胞因子受体4(CXCR4)是目前所知的SDF1的唯一受体。起初，SDF1/CXCR4的研究主要集中在血液病和艾滋病领域。自从1997年发现了其对骨髓干细胞具有明显的趋化作用后，关于通过干细胞迁移修复受损病灶的报道逐渐增多，如在缺血的脑组织[1]、心肌组织[2]、肢体肌肉组织[3]中，趋化因子SDF1明显升高，促使成体干细胞定向迁移至病灶内，加速受损组织的修复再生。

1 SDF1/CXCR4的结构和生物学功能

1.1 结构

SDF1是1994年Nagasawa等[4]在小鼠骨髓基质细胞系pA6分泌的细胞因子中发现的，因其在前B细胞增生分化中发挥重要作用而被称为前B细胞增长刺激因子。根据其氨基酸序列N端2个半胱氨酸被1个其他氨基酸隔开，将其归为趋化因子CXC亚族，并被命名为CXCL12。人SDF1基因定位于人染色体10q11.1，并在骨髓、大脑、心脏、肾脏、肝脏、胸腺等器官中持续表达。CXCR4为SDF1的特异性受体，其基因编码352个氨基酸，编码基因位于人染色体2q21，是高度保守的具有7个跨膜结构域的G蛋白偶联的受体。CXCR4表达于骨髓、脐血和动员的外周血来源的CD34+细胞表面，还可在多种非造血细胞和器官上表达。

1.2 生物学功能

1.2.1 造血

1.2.1.1 SDF1对造血干/祖细胞增殖和分化的影响 Lataillade等[5]研究发现，SDFl对造血干细胞有刺激其增殖的作用，并且与其他造血细胞生长因子如干细胞因子(SCF)及白介素3(IL3)有协调作用，还能促进更多的CD34+细胞进入细胞周期，使S期和G2期/M期细胞明显多于对照组。

1.2.1.2 SDF1介导造血干/祖细胞的动员过程 研究表明，骨髓动员的鼠中骨髓SDF1浓度会下降，直接导致体内丝氨酸蛋白酶的积累，后者直接引起骨髓造血干/祖细胞的动员[6]。

1.2.1.3 对造血干/祖细胞归巢的影响 (1)　SDF1/CXCR4介导造血干/祖细胞的趋化转移效应。来源于骨髓、脐血、动员外周血中的CD34+造血干/祖细胞表面表达SDF1受体CXCR4，而骨髓基质表达的SDF1能特异地对CXCR4产生趋化作用[7]。因此，表达CXCR4的造血干细胞就能够沿着SDF1的浓度梯度迁移实现归巢过程。(2)　 SDF1/CXCR4诱导CD34+细胞穿越内层黏附于骨髓基质的作用。人的骨髓内皮细胞连续表达SDF1，SDFl吸附在内皮细胞表面的蛋白多糖上，结合CD34+细胞表面的CXCR4捕获造血干/祖细胞，在黏附分子参与下，HSC与内皮细胞产生黏附，SDFlα可增强HSC与骨髓基质的黏附作用，这与SDFlα的聚糖和葡萄糖胺聚糖的特性有关。

1.2.2 胚胎发育

敲除小鼠SDF1基因的2个等位基因，小鼠出生后即死亡，有B细胞增殖、骨髓细胞发育、神经系统发育受阻以及室间隔缺损等缺陷，基因敲除CXCR4小鼠与基因敲除SDF1小鼠有几乎相同的表现，说明SDF1、CXCR4在胚胎发育过程中具有非常重要的作用。

1.2.3 免疫与炎症

SDF1是T细胞、前B淋巴细胞、单核细胞和DC细胞的潜在趋化因子，是前B细胞生长刺激因子，也是早期阶段B细胞，T细胞的分化、成熟的生长因子[810]。研究发现，SDF1缺乏鼠的淋巴细胞和骨髓系细胞不能正常发育，由于SDF1和CXCR4对T细胞、单核细胞的迁移及B淋巴细胞生成中的生物学效应，可能在免疫监视过程中也发挥重要生理功能，在炎症反应中，白细胞向炎症部位集中也与此有关。有学者报道，在肿瘤局部分泌的SDF1具有免疫调节作用，能够趋化T细胞、调节CD4+T细胞的抗肿瘤效应[11]。另外，Gomzalo等[12]发现SDF1/CXCR4轴在过敏性呼吸道疾病(ADD)发生中起关键作用。Nanki等[13]利用双室模型研究中发现SDF1是CD4+T细胞活化的共刺激因子，在类风湿性关节炎病变的滑膜中有CD4+T细胞的积聚现象，提示SDF1在免疫及局部炎症过程中是一个重要的调节因子。Clissi等[14]发现SDF1选择性地趋化Thl，对Th2的作用很弱。受SDF1趋化的T细胞内有Rac1 GTP酶激活和肌动蛋白多聚化，说明SDF1参与慢性炎症发生。

1.2.4 肿瘤

很多研究报道指出，CXCR4在肿瘤细胞高度表达，而SDF1在某器官的高浓度表达代表肿瘤细胞首先转移的目的地，实验证明CXCR4的抗体有效地阻断了肿瘤细胞向肺部转移的过程，可见SDF1/CXCR4在肿瘤细胞扩散转移中起到重要作用。

CXCR4是肿瘤细胞上很常见的趋化因子受体，同时是其他癌症治疗中的调节因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)能诱导CXCR4大量表达，因此VEGF抗体能通过抑制CXCR4表达达到控制肿瘤细胞转移的作用。

1.2.5 艾滋病

Mirshahi等[15]研究认为，HIV1感染首先以CCR5为辅助受体感染单核细胞，此期患者多无明显临床症状，之后感染CD4+T淋巴细胞，表现出获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，CXCR4为HIV1感染CD4+T淋巴细胞的辅助受体，在HIV1感染CD4+T淋巴细胞过程中发挥重要作用。SDF1可通过与HIV1的gpl20竞争结合CXCR4和下调CD4+T淋巴细胞表达CXCR4发挥抗HIV1感染作用，尤其是对于有症状的HIV1感染患者。

2 SDF1/CXCR4在缺血性心脏病的干细胞治疗方面的研究进展

2.1 缺血性心脏病干细胞治疗的现状

应用干细胞治疗缺血性心脏病的研究都基于这一假设：干细胞可以分化成包括心肌细胞和血管内皮细胞在内的各种类型的细胞，而患病心脏内新生的心肌细胞和血管能够有效地逆转心力衰竭[16]。众多实验验证了干细胞在缺血性心脏病治疗中的作用。有研究人员[17]将表达绿色荧光蛋白(EGFP)的小鼠骨髓造血干细胞注射到野生型急性心肌梗死小鼠心脏缺血区的周围，1～2周后，缺血区出现了大约68%的表达心肌细胞特异性标记物的细胞，同时心脏超声和血流动力学指标显示左室功能得到显著改善。内皮前体细胞和间充质干细胞也能够定向迁移到心肌梗死区，转化为心肌细胞，参与新生血管的形成，改善左室功能，减少心肌细胞死亡的数目和心肌梗死的范围[1820]。然而，干细胞发挥改善心功能的作用，首先要有足够的存活细胞。Toma等[19]发现，99%的植入细胞进入了外周血或者发生了凋亡。另外有报道称，经冠状动脉移植骨髓单个核干细胞(BMNSCs)后只有1%～2%的细胞滞留于目标心肌[21]。这些证据表明单纯干细胞移植效率不高。

2.2 SDF1/CXCR4轴在心脏损伤修复中的作用

为提高干细胞移植效率，人们的目光转移到在干细胞的动员、归巢和分化过程中发挥重要作用的细胞因子上。其中，SDF1与其特异性受体CXCR4相互作用，参与到干细胞动员、归巢、黏附、存活增殖的各个步骤，在心脏的细胞治疗中有着巨大的应用潜能。2.2.1 SDF1/CXCR4轴与干细胞/前体细胞的定向迁移

干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。目前研究最多的是成体干细胞，它来源于成体组织，移植后不产生排斥反应，来源也不受伦理学要求的限制。干细胞/前体细胞的动员和归巢是一个复杂的过程，SDF1/CXCR4轴在这个过程中发挥着关键作用。首先，干细胞要离开其原器官，如骨髓。降低骨髓内SDF1的浓度[2223]或提高骨髓外SDF1的浓度[24]，所产生的骨髓内、外SDF1浓度梯度都可以促进骨髓造血细胞的动员。随后，进入血液循环的干细胞在化学因子的作用下向靶器官迁移。如上所述，SDF1能够充当干细胞定向迁移的化学引诱物[2526]，同时它也可以增强干细胞的运动能力[27]，这可能与细胞骨架蛋白的重排相关。到达靶器官后，干细胞首先要黏附到血管内皮上。SDF1能够促进细胞黏附到纤维蛋白原、纤维连接蛋白、间质和内皮细胞上[2829]。这种促进作用主要通过激活靶细胞表面的各种黏附分子，如淋巴细胞功能相关抗原1(LFA1)、晚期活化抗原4(VLA4)和晚期活化抗原5(VLA5)等实现的[29]。黏附到血管内皮的干细胞随后要穿过血管壁从而进入靶器官，在SDF1的作用下，干细胞可以分泌更多的基质金属蛋白酶-9(MMP)、一氧化氮和某些促进血管生长的因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)[2931]，这些因子和酶都参与辅助干细胞穿过血管壁的基底膜，到达靶器官。最后，到达靶器官的干细胞需要存活下来，并进行增殖。

2.2.2 SDF1/CXCR4轴与心肌损伤修复

SDF1/CXCR4轴在干细胞的动员和归巢中的关键作用提示，通过调节SDF1/CXCR4轴就可以促进干细胞的动员和组织损伤的再生、修复。随着心脏细胞治疗研究的深入，SDF1/CXCR4轴在组织缺血损伤和心肌损伤修复中的作用也引起了人们的重视。

在大鼠心肌梗死动物模型中，缺血心肌组织的SDF1 mRNA表达水平上调，大约1周时达到高峰，可持续6周[32]。Damas等[33]通过对心脏移植患者切除的慢性心力衰竭的心脏和正常心脏的研究发现，心肌梗死后，心肌梗死区SDF1的表达水平较正常心脏有显著提高[3436]。Ayach等[37]在2005年美国心脏协会年会上公布的研究结果显示：心肌梗死5周后，CXCR4基因敲除的小鼠(CXCR4+/CXCR4)较正常小鼠(CXCR4+/CXCR4+)的左室功能更差;病理学检查显示梗死面积更大，室壁更薄;免疫组化也证实其分裂的内皮细胞数量和血管形成减少。Kucia等[2]发现，在出生后小鼠的骨髓中有一群CXCR4+/Sca1+/lin/CD45-的骨髓单核细胞组分，它们不具有造血功能，而表达心肌细胞的标记物。这些潜在的心脏前体细胞在心肌梗死时进入外周血液，并以SDF1/CXCR4依赖的方式到达心脏。而静脉给予骨髓来源的细胞48h后，心肌梗死区较正常心脏骨髓来源细胞的募集多80.5%;而使用SDF1抑制剂AMD3100后，其募集减少64.2%。同样，增加SDF1的表达水平使心肌梗死区的募集较对照组增加了1倍[36]。

因此，SDF1/CXCR4轴在组织缺血损伤和心肌再生修复中发挥着重要作用，它参与调节组织缺血损伤后的血管新生和心肌梗死后的干细胞募集。

2.3 SDF1/CXCR4轴在治疗方面尚待解决的问题

虽然SDF1/CXCR4轴在缺血心肌的修复上发挥着重要作用，但是由于其在心脏损伤修复中的确切作用机制不清楚，使得SDF1/CXCR4轴在治疗缺血性心脏病方面存在着急需要解决的问题。首先，一些实验发现，SDF1并不影响CD34+干细胞/前体细胞、成红细胞、成巨核细胞、髓样细胞的存活和增殖[30]。SDF1很可能通过一些间接的途径在这个过程中发挥作用，如促进细胞的黏附，促进其他生长因子的分泌等。其次，有研究显示SDFv1/CXCR4轴所诱导的干细胞/前体细胞趋化到了缺血心肌后并没有转化为心肌细胞，而是与心肌梗死区边缘的正常心肌细胞发生了细胞融合，尽管心室功能得到了改善[3840]。再者，移植入缺血心脏内的干细胞生存能力差，动物模型中移植后24～48h有90%的移植细胞死亡，而移植入人体后成活率少于1%，这大大限制了它们的修复能力。另外，虽然对于急性心肌梗死的患者，干细胞治疗均取得了较好的治疗效果[4144]，但是对于心肌梗死后慢性心衰的患者，其治疗效果参差不齐，研究还表明慢性缺血性心脏病患者骨髓来源细胞对SDF1的迁移应答减弱[45]。

3 总结与展望

随着干细胞领域基础研究的迅速开展，心肌再生不再是激进的想法，各种来源的干细胞已经广泛应用到缺血性心脏病治疗的基础研究和早期临床实验中。而目前已确认的在机体造血、胚胎发育、免疫与炎症、肿瘤、艾滋病等方面起着重要作用的SDF1/CXCR4轴，在干细胞的动员、归巢、黏附、血管穿透和在靶器官内的增殖、存活的整个过程中也发挥着重要作用。初步的研究显示，它也参与调节组织缺血损伤后的血管新生和心肌梗死后的干细胞募集。因此，将SDF1/CXCR4轴与干细胞治疗结合起来，将为缺血性心脏病的细胞治疗提供一个新的途径。

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