1电化学DNA传感器的工作原理

电化学DNA传感器主要由表面固定了ssD-NA(单链DNA)[4]探针的电极金电极、玻璃电极和碳糊电极等)和检测用的电化学杂交指示剂(即标识物)两部分构成(如图1所示)。为了提高杂交的专一性,ssDN段长度范围一般从十几个碱基到几十个碱基,通常采用人工合成的短链寡聚脱氧核苷酸,其碱基序列与样品中的靶序列互补。在适当的温度、pH和离子强度条件下,固定在电极上的ssDNA与杂交缓冲溶液中的靶基因发生选择性杂交反应。如果样品中含有完全互补的DN段则在电极表面形成dsDNA(双链DNA),从而引起电极上电流值的变化,利用微分脉冲或循环伏安法可检测出dsDNA杂交信号。电化学杂交指示剂是一类能与ssDNA和dsDNA以不同方式相互作用的电活性化合物,其电活性可使检测时的测量电流增大,提高检测灵敏度,但电化学杂交指示剂的加入使电化学信号的本底加大,使检测的分辨率降低。提高电极上ssDNA探针的灵敏度,一方面与杂交指示剂对dsDNA和ssDNA的选择性结合能力的差异有关,另一方面与电极表面特异性吸附有关[5]。目前选用的嵌合剂均为单嵌合剂,可以考虑选用双嵌合剂和三嵌合剂。利用其“分子剪刀”的功能,改善其灵敏度和选择性。选用磷酸缓冲底液进行检测,可避免对指示剂的非特性吸附[6]。在基因检测方面采用计时电势信号转换模式(PSA)检测,比伏安法灵敏度高,并能获得有效的背景补偿,可在5~20min短时间内检测纳克(ng)的目标DNA序列[7]。采用光刻沉积技术制备的金膜作为传感电极[8],与巯基修饰的寡核苷酸探针自组装成的电化学核酸传感器,浓度检测线性范围为1.5~50nmol/L。以肽核酸[9](PNA)代替ssDNA作为探针分子修饰到电极表面,电极表面上的PNA仍能保持其在溶液中专一和有效的杂交特性,PNA识别层使传感器具有更高的灵敏度和专一性,杂交速度快,并且不受离子强度的影响。

2电化学DNA传感器的分类

DNA修饰电极是电化学DNA传感器的重要部分,该类传感器也多以此进行分类。ssDNA修饰(或固定)到电极上的方法,现有的文献报道主要集中在自组装膜法、吸附结合法、表面富集法、共价键结合法、化学免疫法、组合法、生物素-亲和素反应法和LB膜法等。本文主要叙述以下几种:

2.1吸附结合法

该方法是将碳糊电极放到含DNA探针分子的乙酸缓冲溶液中在一定电位下活化电极,然后在控制电位下吸附富集探针分子,最后用磷酸缓冲溶液淋洗后便可使用。其特点是简单、灵活,但稳定性不够。Pang[3,10]等研究证明,ssDNA在汞电极上的吸附性质为化学吸附,生成吸附化学键,质子化的ssDNA分子通过嘌呤和嘧啶碱基上芳香杂环的π键键合而吸附到汞电极上。Hashimoto[11,12]等采用吸附法在平面热解石墨电极上固定了DN段。他们[12]还通过化学吸附在金电极表面修饰了20mer的DNA探针,该探针与v-myc基因部分互补。Wang等[13]利用电化学富集方法将DNA修饰到碳糊电极(CPE)上,制成DNA探针修饰电极。

2.2自组装膜法

即基于分子的自组作用,在固体表面自然形成高度有序的单分子层膜的方法。在DNA技术中,一般是利用带巯基(—SH)的化合物在金电极表面上可以形成自组装单分子膜的特性来固定核酸。其特点是表面结构高度有序,稳定性好,有利于杂交;但对巯基化合物修饰的DNA的纯度要求较高,分离提纯操作较烦琐。白燕[14]等人利用自组装单分子膜技术,考察了ssDNA/Au电极、dsDNA/Au电极的指示剂氧化峰电流。研究表明,ssDNA/Au电极、dsDNA/Au电极的指示剂氧化峰电流响应值之差与互补DNA浓度在一定范围内呈线性关系,据此可以识别特定序列的DNA,并对其进行定量。陆琪[15]等人采用先进行—SH化合物自组装,得到自组装单分子层,再在其上共价键合或吸附固定DNA的方法,制备DNA修饰电极,克服了由于—SH修饰的DNA难以合成,并且需要分离提纯,操作繁琐的缺点。Xu[16]等先将4_巯基丁基膦酸(MBPA)在纯乙醇中固定到硅晶片的金膜上,然后再与Al3+反应,形成一层包含Al3+的膜,再通过Al3+与DNA之间的静电作用将ssDNA固定到电极上。

2.3共价键结合法

该法首先对电极进行活化预处理,以引入活性键合基团,然后进行表面的有机合成,通过共价键合反应把探针分子修饰到电极表面。如在氧化的玻碳电极表面,以一种水溶液的乙基_(3_二甲基丙基)碳二亚胺盐酸和N_羟基磺基琥珀酰亚胺作为偶联活化剂,小牛胸腺DNA和多聚脱氧鸟苷酸、多聚脱氧胞苷酸片段通过与活化的电极表面(O_酰基异脲)形成磷酰胺键共价结合到电极表面。其特点是修饰层稳定,易进行分子杂交,但由于电极表面活性位点有限,表面合成又是异相反应,因而固定的DNA量有限,响应信号小。S.Lin[17~19]采用共价键法,成功地在石墨电极上固定了DNA探针。赵元弟等[20]采用巯基化合物自组装/共价键合反应的逐层固定方法,将双链DNA固定到金电极表面,得到DNA修饰电极,并对该电极表面进行了电化学和X射线光电子能谱表征,研究了电极表面固定化小牛胸腺DNA和一种具有10碱基长度的寡聚核苷酸探针分别与溶液中DNA的表面分子杂交情况。

2.4化学免疫法

在免疫传感器的研究及应用方面,本课题组研究了多种Nafion膜修饰微铂电极对溶液中NO的电化学行为进行了研究[21~24],并用自行设计合成的大环镍制成了Nafion膜修饰电极,实现了对多巴胺和肾上腺素这两种哺乳动物的重要神经递质的同时测定[25];用PVC膜修饰的免疫电极采用流动注射分析了乙肝抗原[26];通过戊二醛偶联乙肝表面抗体(抗-HBs),用自组装的硫脲单分子层金免疫电极,检测了乙肝表面抗原[27]。采用了溶胶-凝胶(sol-gel)技术,成功将乙肝表面抗体(HBsAb)包埋于sol-gel中,此方法可用于检测乙肝表面抗原HBsAg[28]。同时结合溶胶-凝胶(sol-gel)和交联技术,将乳腺癌抗体固定在铂盘电极表面的氨基化sol-gel功能膜上,用于检测乳腺癌抗原(CA15-3)的免疫传感器[29]等。利用化学免疫法固定DNA首先在电极表面键合抗生蛋白(avidin),然后利用抗生蛋白与生物素之间的亲和作用,使其与5′端标记有生物素(biotin)的DNA结合,因而将DNA固定于电极表面。Yoshio[30]利用avidin与biotin的基本反应通过多层分子组装将dsDN段固定化,用以测定相对分子质量小的有机物质和氯代联苯、氯代酚、双酚A、溴化乙啶等。

2.5组合法

该法是将化学修饰剂与电极材料混合以制备组合修饰电极。Millan[31]将18_烷基胺或18_烷基酸混入碳糊中,得到修饰的碳糊电极。在DEC存在下,18_烷基胺的氨基与ssDNA5′末端的磷酸基形成磷酰氨键,并将其固定在电极上。

3电化学DNA传感器中的标示物

DNA传感器对目标基因的选择性识别是靠核酸的杂交来完成的。为了检测所发生的杂交信息,必须采用一种电活性物质来指示,即电化学DNA传感器的标示物。本文主要介绍以下3种标示物。

3.1具有电化学活性的杂交指示剂作为标示物

许多具有电化学活性的小分子物质能与DNA分子发生可逆性相互作用,其中一些物质能够专一性地嵌入dsDNA分子双螺旋结构的碱基对之间,这一类物质称为杂交指示剂。在杂交过程中杂交指示剂与电极表面的dsDNA形成复合物,根据杂交指示剂与ssDNA和dsDNA结合方式和结合能力的差异,通过测定其氧化还原峰电流和峰电位可以识别和测定DNA分子。能够选择性识别ssDNA和dsDNA而又不与DNA链发生不可逆的共价结合,同时又能给出电流或电势识别信号的杂交指示剂是该类电化学DNA生物传感器的关键。指示剂与DNA的结合方式主要有:(1)与DNA分子的带负电荷的核糖/磷酸骨架之间的静电作用;(2)与DNA沟槽的嵌入作用。杂交指示剂对dsDNA比对ssDNA有更高的特异性结合能力,这样才能指示灵敏。一般地说,dsDNA与指示剂的相互作用为静电作用和内部疏水性作用,而ssDNA主要是静电作用,可以从其电化学峰电位的移动来判断,前者峰电位正移,后者峰电位负移[32]。Wang[33,34]等用肌苷代替DNA探针中的鸟嘌呤来消除探针中鸟嘌呤的氧化峰,然后利用探针和靶序列,对杂交后出现的鸟嘌呤的氧化峰进行检测。Hashimoto[35]等利用多种杂交指示剂进行电化学基因检测,发现电活性小分子道诺霉素(daunomycine)可以通过峰电位的移动,很好地区分dsDNA和ssDNA,并且其电流密度相当高,在10μmol/L的溶液中达到6.5μA/c,可检测到10-8g/mL的靶基因序列。Hoechst33258能专一性地作用于双螺旋DNA的小沟槽的A-T碱基对,可以通过其阳极峰电流的变化来指示。而其它的指示剂,如丫啶黄(acridineorange)、米诺霉素(minocycline)、普匹碘铵(propidiumiodide)等,效果就不如前二者。

3.2寡聚核苷酸上修饰电化学活性的官能团作为标示物[2,3]

合成带有电化学活性基团的寡聚核苷酸与电极表面的靶基因选择性地进行杂交反应,在电极表面形成带有电活性官能团的杂交分子,通过测定其电信号可以识别和测定DNA分子。Takenka等人[2]成功地在寡聚核苷酸的5′端磷酸基上标记具有电化学活性的羧基二茂铁制成二茂铁寡聚核苷酸,合成的二茂铁寡聚核苷酸选择性地与互补单链DNA形成复合物,采用电流检测,检测信号与复合物的量呈线性关系。

3.3利用酶的化学放大功能在DNA分子上标记酶作为标示物[2,3]

当标记了酶的ssDNA与电极表面的互补ssDNA发生杂交反应后,相当于在电极表面修饰了一层酶,酶具有很强的催化功能,通过测定反应生成物的变化量可以间接测定DNA。

4电化学DNA传感器的医学应用

4.1在细茵及病毒感染类疾病诊断

细菌及病毒感染是引起人类疾病的主要原因之一。历史上许多灾难性的瘟疫,如霍乱、天花、麻疹等,都是由相应的病菌或病毒所引起的,因此尽早诊断出病源微生物(细菌或病毒)的感染,是预防这类疾病的关键[1,36]。Wang[37]等人用阳极氧化法,将与结核杆菌(Mycobateriatuberculosis)基因DR区相对应的两个长度分别为27和36碱基的DNA探针,固定在碳糊电极表面,制成电化学DNA传感器。利用计时电位分析法,以Co(Phen)33+作指示剂,进行了DNA传感器用于结核杆菌诊断的最初尝试。武汉病毒研究所用化学免疫法固定乙型肝炎病毒(HBV)的DNA探针,用来与牛肠磷酸酶(CAP)标记的互补探针杂交,利用光动力计测量杂交带入的CAP释放出的光强度,验证了DNA传感器进行HBV诊断的可行性[38]。日本的Hashimoto等人[39]将巯基标记的HBV探针自组装在金和钛电极表面,用电化学方法检测了血清HBVDNA的竞争性PCR扩增产物,结果表明用DNA传感器HBV的临床诊断,不受血清中其它DNA成分的干扰,具有良好的特异性。近来,吴少慧等人[40]通过阳极氧化法,将HBV的DNA探针固定在镀金的石英晶体表面,组装成石英晶体传感器[41~44]。用该石英晶体传感器去检测HBV的DNA时,作为检测对象的DNA会与固定在石英晶体表面的DNA探针杂交,引起石英晶体的质量改变,从而使石英晶体的振荡频率改变,产生检测信号。用该传感器检测了6个HBV血清,证明其稳定性能满足临床HBV的诊断要求。

4.2基因诊断

基因遗传病是当前威胁人类健康的天敌,许多基因遗传病至今还没有根治的方法,因此,基因诊断变得越来越重要,尤其对遗传性疾病的产前和病前诊断显得更为重要,而在基因与功能的研究以及其他许多方面,DNA序列分析均是必须完成的关键步骤,利用电化学DNA传感器测定DNA序列效果较好。Millan等[31]在ssDNA修饰了碳糊电极,在较高离子强度下与靶基因快速杂交(<10min),用该传感器测定了18个碱基长度的囊性纤维变性基因ΔF508序列,得到了令人满意的结果。Wang等[7]报道了艾滋病人类免疫缺陷病毒型(HIV-Ⅰ)相关的短DNA序列测定的传感器。他们将21和24个碱基与HIV-IU5LTR序列互补的单链寡核苷酸部分修饰在碳糊电极(CPE)上,以杂交指示剂Co(Phen)33+溶出峰来检测杂交。靶基因片段检出限为4×l0-9mol/L。Wang等[33]提出了以肽核酸(PNA)代替ssDNA作为探针修饰到电极表面,己证明PNA与互补核苷酸有很多的杂交特性,在许多方面显示出优于ssDNA的性能,有望被很好地用于基因诊断。

4.3药物分析

许多药物与核酸之间存在可逆作用,而且核酸是当代新药发展的首选目标。电化学DNA生物传感器除了可用于特定基因的检测外,还可用于一些DNA结合药物的检测以及新型药物分子的设计[32]。Wang等人[45]将修饰dsDNA的碳糊电极插入吩噻类药物的醋酸缓冲溶液中富集,进行计时电位分析。结果发现,在未修饰dsDNA的碳糊电极上,吩噻仅仅产生非常小的阳极峰,而在修饰电极上可以测得nmol/L级吩噻类药物。罗济文等人[46]研究了道诺霉素(DNM)在小牛胸腺DNA修饰石墨粉末微电极上的电化学行为,提出了测定微量DNM的方法,DNM浓度在1.0×10-7~1.0×10-5mol/L之间,其微分脉冲伏安(DPV)峰电流与浓度有良好的线性关系,检出限为5.0×10-8mol/L,并以此为基础提出了一种测定人尿中痕量DNM的方法。该方法简单、快速、灵敏度较高。宋玉民等[47]用电化学方法和荧光方法研究了桑色素(Morin)和抗肿瘤活性较强的桑色素合铜(Ⅱ)、桑色素合锌(Ⅱ)与DNA在生理条件下的相互作用,从分子水平探讨桑色素及其配合物抗癌活性不同的存因以及DNA作用方式之间的联系。Maeda等人[48]研究了抗疟药阿的平在DNA修饰电极上的电化学检测。结果显示,在1×10-7~5×10-7mol/L范围内,阿的平的浓度与指示化合物铁氰化钾的阳极峰电流成正比,当浓度在8×10-7mol/L时达到饱和。同时,用NaCl溶液做对比实验,证实阿的平与DNA分子发生了强烈的特异性相互作用。这为今后研究某些药物与DNA的相互作用机理及建立简便的药物筛选方法作了探索性的工作。

4.4DNA损伤研究

人类基因与其它物种基因的功能均是编码遗传信息从而保护其完整性[49]。DNA修复酶始终监视染色体并修复基因和细胞化学物所致的核苷酸残基的破坏,若没有DNA修复,那么由多种多样的DNA损伤因素所引起的染色体不稳定性将对细胞和生物体产生致命的影响[50~53]。利用电化学DNA传感器对DNA损伤进行测定取得了令人满意的效果。孙星炎等[54]研究了不同致突变因素(紫外光照射、亚硝酸)的作用下,以石墨电极为基底电极,特定碱基序列的DNA在电极表面能否杂交及杂交程度的差异,对DNA突变情况及可能的突变机理进行了探讨。Wang等[55]直接固定dsDNA微型电化学传感器,探讨紫外光辐射引起的DNA中鸟嘌呤氧化峰信号的变化,来检测DNA的损伤。Sue等[56]认为,目前基因检测在疾病诊断方面的原理,一般是用固定的抗原或抗体来探察和它们捆绑在一起的分子聚集时的生物流动性,而电化学DNA生物传感器的微排列,是由数千被合成或被克隆的能在样品中被察觉的连续互补DNA序列组成,临床上通过传感器的检测能够迅速找出哪种组织患病和是否带有耐药因子,为疾病的快速诊断提供了可能。

5展望

电化学DNA传感器具有重要的理论意义和应用价值。它开辟了电化学与分子生物学交叉学科的新领域[57,58,60]。为生命科学的研究提供了一种新技术、新方法。在临床医学和遗传工程等领域的研究具有深远的意义和应用价值。今后电化学DNA传感器的研究工作将会集中在:(1)适于高灵敏度检测的杂交指示剂的筛选研究;(2)电极结构的优化,稳定的自组装单分子层修饰电极在电化学DNA传感器的研究;(3)电化学DNA传感器在疾病基因诊断上的应用;(4)将一些药物作为杂交指示剂,研究其与DNA的相互作用。