【摘要】目的检测新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemicencephalopathy,HIE)患儿红细胞内外钙浓度及红细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性,研究所检测指标与脑损伤程度之间的关系,并探讨出现低钙血症时能否钙剂治疗,从而最大限度地提高HIE的疗效,减少死亡和伤残。方法采用流式细胞仪测定86例不同程度新生儿缺氧缺血性脑病患者红细胞内Ca2+浓度,以I-STAT1-Analyzer测定血浆游离钙,以化学比色法测定红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性;以30例足月新生儿作为对照组,均为羊水吸入和咽下综合征患者。将HIE组中部分患儿再分为补充钙剂组与未补充钙剂组,当补充钙剂疗程结束后再次检测各组相关指标。结果HIE急性期血浆游离钙浓度水平均明显低于对照组,(P<0.05),红细胞内Ca2+浓度水平均明显高于对照组(P<0.05),红细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性明显低于对照组(P<0.05);这些指标的变化与脑损伤的严重程度相关;在补充钙剂后红细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性及红细胞内Ca2+浓度均与未补充钙剂组差异无统计学意义(P>0.05),而血浆游离钙浓度较未补钙组显著升高(P<0.05)。结论HIE时红细胞内钙超载,血浆游离钙降低,且红细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低;补充钙剂后红细胞内游离钙浓度并未明显上升,故而HIE时对有低钙血症临床表现的患儿补充钙剂是可行的,但本研究并未解决补充钙剂后是否会延长细胞内钙超载的持续时间,因此提出以短期应用为妥,一旦临床表现缓解即可停止补充,血浆游离钙仅做为参考。

【关键词】新生儿;缺氧缺血性脑病;红细胞内外钙浓度;红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性

【Abstract】ObjectiveToresearchtherelationshipbetweensomedetectiveindicatorsandtheneonatalhypoxic-ischemicencephalopathy(HIE)braininjury,bydetectingtheCa2+concentrationsinsideandoutsideoferythrocytesaswellasCa2+-Mg2+-ATPaseactivityonerythrocytemembranesinchildrenwithHIE.Meanwhile,todiscusswhetherthecalciumtreatmentcouldbeusedinthesituationofhypocalcemiaforthepurposeofimprovingtheeffectofHIEmaximatilyanddecreasingmortalityanddisability.MethodsTheclinicalof86caseswithHIEneonatuswerestudited.86casesofHIEneonatus,wedetectederythrocyteintracellularCa2+concentrationbyflowcytometry,plasmafreecalciumbyI-STAT1-AnalyzeranderythrocytemembranesCa2+-Mg2+-ATPaseactivitybychemicalassay.Asthecontrolgroup,30casesoffullterminfantsweretakenwhowereallinhaledandingestedamnioticfluid.TheHIEgroupwassubdividedintogroupswithandwithoutcalciumsupplement.Theaboveindicatorsweredetectedagainingroupsattheendofcalciumtreatment.

ResultsInHIEacutephase,plasmafreeCa2+concentrationsweresignificantlylowerthanthecontrolgroup(P<0.05),erythrocyteintracellularfreeCa2+concentrationweresignificantlyhigherthanthecontrolgroup(P<0.05),erythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivitywassignificantlylowerthanthecontrolgroup(P<0.05).Thesechangesarerelevantwiththeseverityofbraininjury.Aftercalciumsupplement,erythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivityanderythrocyteintracellularfreeCa2+concentrationswerenosignificantdifferenceswiththatwithoutaddedcalciumgroup(P>0.05),whiletheplasmaconcentrationoffreecalciumwassignificantlyhigher(P<0.05).

ConclusionErythrocyteintracellularcalciumionisoverloaded,plasmafreeCa2+concentrationanderythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivityaredecreasedinHIE.Aftercalciumsupplement,erythrocyteintracellularfreeCa2+concentrationdidnotsignificantlyincrease.calciumsupplementisfeasibleinHIEchildrenwithhypocalcemia.Butthisstudydidnotaddresswhethertheadditionalcalciumwouldextendintracellularcalciumoverloadduration.Therefore,short-termapplicationshouldbeusedaslongastheremissionofclinicalmanifestations.Andplasmafreecalciumisareferenceonly.

【Keywords】

Newborn;Hypoxic-ischemicencephalopathy;Ca2+concentrationinsideandoutsideoferythrocytes;ErythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivity

钙与新生儿缺氧缺血性脑病的关系已得到公认,1977年Nicholson第一次提出钙介导缺氧缺血后神经元死亡的学说[1],1992年Schurr等在体外实验中发现Ca2+超载假说最能说明缺氧缺血性脑损伤后神经元死亡的机制,其后研究已证实缺氧缺血常引起细胞内钙超载,诸多实验都证实在缺氧造成的神经元损伤时,有细胞内的钙异常蓄积,这种变化比神经细胞坏死出现得早,钙浓度增高的程度也与神经细胞坏死的数量成正比[2],细胞内过度升高的钙离子可触发一系列有害的酶反应过程,最终导致不可逆的细胞损害被认为是与其细胞受损的中心环节,是导致细胞凋亡或死亡的“最后共同途径”。但在细胞内钙超载的同时常伴有血浆游离钙的降低,而是否应该予以补充钙剂以及如何补充钙剂一直存在争议,一般认为HIE患儿的总钙并不低而只是钙分布异常,并非真正缺乏,补充钙剂后细胞外液Ca2+增加有可能造成钙再次大量内流进而造成细胞损伤,因而建议使用钙通道阻滞剂协助治疗,但目前还没有证明对HIE安全而有效的钙通道阻滞剂;亦有研究认为出现惊厥、呼吸障碍等低钙血症的症状后如不及时予以缓解会进一步加重脑损伤,故建议补充钙剂。

本文主要研究HIE患儿红细胞内外钙浓度及红细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性及其这些指标与脑损伤的相关性,并且进一步研究补充钙剂后各相关指标变化,从而为HIE出现低钙血症时是否能够补钙以及如何补钙寻找依据,以利于最大限度地提高HIE的疗效,减少死亡和伤残。

1对象和方法

1.1研究对象

1.1.1HIE组根据2004年中华医学会新生儿学组在长沙最新制定的诊断和分度标准进行诊断和分组[2],均为2006年7月以后在山西省儿童医院新生儿科住院的患儿,共82例,其中,男52例,女30例,平均胎龄(39.28±1.54)周,平均年龄(12.67±7.47)h。有感染性疾病、溶血性疾病、先天性疾病的患儿排除在外。

1.1.2对照组选择同期在新生儿科住院的30例足月早期新生儿作为对照组,均为羊水吸入和咽下综合征患者。其中,男18例,女12例,均无围产期窒息史,无感染性疾病、溶血性疾病和先天性疾病,无宫内发育迟缓,其母孕期健康。经统计学分析,该组新生儿在胎龄、日龄、出生体重等组成上与HIE组差异无显著性(P>0.05),见表1。

表1

不同程度HIE组患儿和对照组患儿的一般资料

组别例数年龄(h)胎龄(W)出生体重(kg)

轻度HIE组3011.85±6.6539.05±1.213.63±0.35

中度HIE组3013.19±8.4039.23±1.513.36±0.49

重度HIE组2212.96±8.5839.56±1.063.23±0.65

对照组3015.92±8.6138.30±1.273.39±0.53

F值0.3261.6012.345

P值>0.05>0.05>0.05

1.1.3补钙组和非补钙组

HIE组中30例患儿出现低游离钙血症同时出现相关临床表现(惊厥,呼吸障碍),按照家长意愿补钙者20例,未补钙者10例,分别列入补钙组和非补钙组。

1.2研究方法

1.2.1标本采集86例HIE患儿均于入院当天(生后0~3d、急性期)、30例非HIE组于生后0~3d均用真空管(EDTA抗凝)常规取静脉血2ml,取血待测;均同时采约120μl动脉血测定血浆游离钙,且在HIE补充钙剂组于补充钙剂3d后、HIE非补钙组常规治疗3d后,再次以相同的方法采血,测定各组相关指标。

1.2.2检测方法采用流式细胞术检测红细胞内Ca2+浓度,以I-STAT1-Analyzer测定血浆游离钙浓度,以化学比色法检测红细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性。

1.2.3统计学分析实验数据以均数±标准差(x±s)表示。各组间均数的两两比较用LSD法。各变量间关系作直线相关分析。以P<0.05为差异有显著性。全部资料均采用SPSS12.0版统计软件进行统计学分析。

2结果

2.1红细胞内游离钙浓度(见表2)。

表2

HIE各组与对照组红细胞内游离钙浓度

(相对荧光强度)

组别例数红细胞内游离钙浓度(相对荧光强度)

轻度HIE组30114.98±29.25

中度HIE组30320.86±33.61

重度HIE组22443.13±40.12

对照组30106.39±26.65

注:表示与轻度组比较P<0.05;表示与对照组比较P<0.05

2.2血浆游离钙浓度(见表3)。

表3

HIE各组与对照组血浆游离钙(mmol/L)

组别例数血浆游离钙(mmol/L)

轻度HIE组300.95±0.24

中度HIE组300.76±0.13

重度HIE组220.61±0.11

对照组300.96±0.19

注:表示与轻度组比较P<0.05;表示与对照组比较P<0.05

2.3红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性(见表4)。

表4

HIE各组与对照组红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATP

酶活性(μmolPi/mgprot/hour)

组别例数红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(μmolPi/mgprot/hour)

轻度HIE组300.70±0.11

中度HIE组300.50±0.11

重度HIE组220.40±0.14

对照组300.65±0.10

注:表示与轻度组比较P<0.05;表示与对照组比较P<0.05

2.4相关性研究

2.4.1中度和重度HIE组红细胞内游离钙浓度与红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈负相关,(r=-0.684,r=-0.772,P<0.05)。

2.4.2中度和重度HIE组红细胞内游离钙浓度与血浆游离钙呈负相关,(r=-0.574,r=-0.740,P<0.05)。

2.4.3中度和重度HIE组红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性与血浆游离钙呈正相关(r=0.505,r=0.534,P<0.05)。

2.5补充钙剂前后红细胞内游离Ca2+浓度比较(见表5)。

表5

补充钙剂前后红细胞内游离Ca2+浓度(x±s)

组别例数

荧光强度

补充钙剂前补充钙剂后/常规治疗后

HIE补充钙剂组20366.43±78.36①201.00±60.22②

HIE未补充钙剂组10374.24±86.45③226.42±79.26④

注:②与①比较t=7.4861P<0.05;③与①比较t=0.2488P>0.05;②与④比较t=0.9806P>0.05

2.6补充钙剂前后血浆游离钙(见表6)。

表6

补充钙剂前后血浆游离钙(x±smmol/L)

组别例数

iCa2+(mmol/L)

补充钙剂前补充钙剂后/常规治疗后

HIE补充钙剂组200.62±0.16①0.89±0.12②

HIE未补充钙剂组100.57±0.14③0.75±0.11④

注:②与①比较t=7.3943P<0.05;③与①比较t=0.8391P>0.05;②与④比较t=3.0928P<0.05

2.7补充钙剂前后红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性(见表7)。

表7

补充钙剂前后红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase

活性(x±sμmolPi/mgprot/hour)

组别例数

Ca2+-Mg2+-ATPase

补充钙剂前补充钙剂后/常规治疗后

HIE补充钙剂组200.20±0.04①0.40±0.06②

HIE未补充钙剂组100.18±0.07③0.37±0.05④

注:②与①比较方差不齐采用t′检验P<0.05;③与①比较方差不齐采用t′检验P>0.05;②与④比较方差齐t=1.3595P>0.05

3讨论

自90年代以来,新生儿缺氧缺血性脑病一直是国内新生儿医学界的研究热点,但至今对于重症患儿尚缺乏有效的治疗方法。目前钙与新生儿缺氧缺血性脑病的关系已经得到公认,1977年Nicholson第一次提出钙介导缺氧缺血后神经元死亡的学说,自此关于钙的各方面研究不断有新的突破[3,4]。

在正常情况下,Ca2+作为细胞内信使,几乎参与一切调控细胞功能的信息转导过程,也是参与细胞内代谢活动的重要元素,细胞内Ca2+的稳定的维持对于生命活动是至关重要的,维持细胞内Ca2+的稳定的机制:①细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase的外排作用;②内质网对Ca2+的储存;③线粒体对Ca2+的储存;④胞浆中一些蛋白质与阴离子和Ca2+结合;⑤胞浆膜内侧磷脂极性端也具有和Ca2+结合的能力[5,6]。

局部或全部脑缺血后数分钟,神经元细胞内的游离钙[iCa2+]即明显升高,其主要机制为:①通过兴奋性氨基酸受体(excitatoryaminoacidreceptor,EAAR)造成Ca2+内流;②内质网和线粒体储存的Ca2+释放;目前认为N-甲基-D-天门冬氨酸盐受体(N-Methyl-D-asparaticacid,NMDA)的过度激活是缺血后细胞内iCa2+迅速升高的主要因素,而持续iCa2+升高是线粒体Ca2+释放的结果。另外,缺氧使H+含量增多,细胞酸中毒,结合钙成为游离钙也加剧了胞浆内游离钙含量增加。

细胞内游离钙增加通过激活细胞内一系列Ca2+依赖性生物化学过程和导致线粒体渗透性改变及功能障碍而造成细胞损害和死亡,在新生儿HIE的研究中,由于取材的限制而无法直接观察和测定脑细胞中钙的变化。红细胞是血液中含量最多的细胞成分,成熟的红细胞无核,胞浆Ca2+浓度的变化可以较好地反映细胞内外Ca2+转运情况,非常适用于机体细胞内钙稳态变化机制及病理生理的研究。

本研究结果显示中重度HIE组急性期血浆游离钙浓度低于非HIE组;而红细胞内游离钙浓度则高于非HIE组;同时,红细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性明显低于非HIE组,三项指标中重度HIE急性期与非HIE组比较均为P<0.05有统计学意义,且病情越重,变化越大,此与以往的一些研究一致[7],提示血浆游离钙可作为早期判断HIE脑损伤程度的有效指标[8]。

本研究还显示,HIE补充钙剂组在常规治疗的基础上均给予补充钙剂治疗10%葡萄糖酸钙2ml/kg+10%葡萄糖注射液10ml,2次/d,静脉滴注,连续不超过3d,患儿惊厥、呼吸障碍等症状明显缓解或消失,而未补充钙剂组的这些症状仍然存在,再次测定各相关指标,其结果显示补充钙剂组血浆游离钙浓度较补充前明显上升,基本恢复正常;红细胞内游离钙浓度较补充前有所下降,但与未补充钙剂组比较差异无统计学意义;与此同时,红细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性较补充前明显恢复,已基本恢复正常,但与未补充钙剂组比较亦差异无统计学意义。本研究结果提示了补充钙剂后血浆游离钙浓度上升,而细胞内游离钙浓度并未明显上升,说明补充钙剂并未加重细胞内钙超载,这就为临床补充钙剂提出了一定的可行性依据,在临床中HIE常出现低钙血症加重惊厥、呼吸障碍等症状,如不及时予以缓解会进一步加重脑损伤,甚至导致生命危险[9],适当补充钙剂即10%葡萄糖酸钙2ml/kg+10%葡萄糖注射液10ml,2次/d,静脉滴注,连续不超过3d,在临床上是可行的,可有效缓解上述症状,但另一方面,由于本研究观察时间较短,在补充钙剂后是否会延长细胞内钙超载的持续时间仍有待于进一步的研究,有鉴于此,认为临床上只要惊厥、呼吸障碍等症状缓解后即可停止钙剂的补充,血浆游离钙仅做为参考。

总之,HIE时易造成细胞内外电解质的紊乱,尤其钙离子的紊乱不仅常见而且进一步加重抽搐、呼吸障碍等从而加重脑损伤成为导致神经系统后遗症的因素之一,当临床上出现低钙血症时提倡个性化治疗,在常规治疗的基础上根据临床症状的不同而处理对策有所不同,当血浆游离钙明显降低且同时出现惊厥、呼吸障碍、尿潴留等症状时,补充钙剂并非绝不可取,而一旦临床症状缓解即可停用钙剂临床观察,血浆游离钙水平仅作为参考;在HIE的治疗方面钙通道阻滞剂、亚低温等的应用亦有待于进一步的研究与探讨。

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