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探讨毒杆菌基因的克隆方法

发布时间:2013/11/11 11:22:33   阅读:

1材料与方法

毒杆菌分离菌株FZ2007-1和FZ2007-2、DH5α均为福建省农科院畜牧兽医研究所分离鉴定并保存。工具酶与主要试剂聚合酶、胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司;细菌DNA提取试剂盒、普通肉汤培养基和普通肉汤琼脂培养基均从BDDifco公司购买;脱纤绵羊血购自郑州益康生物工程有限公司。猪丹毒杆菌保护性抗原SpaA基因PCR引物合成参考副猪丹毒杆菌C43065株的SpaA基因序列设计了1对可以扩增SpaA全长基因的特异性引物,上游引物,下游引物S,预期扩增片段为1881bp,引物由TaKaRa公司合成。猪丹毒杆菌DNA的提取复苏甘油冻存的细菌,即用接种针蘸取冻存的细菌,划线接种于含5%脱纤绵羊血的普通肉汤琼脂平板中,37℃倒置培养过夜;挑取单个菌落接种于普通肉汤培养基中,37℃振摇培养过夜;离心沉淀后加入PBS重悬,应用DNA提取试剂盒按照说明书提取细菌DNA,-20℃保存备用。猪丹毒杆菌SpaA基因的PCR扩增、克隆和测序以提取的基因组DNA为模板进行PCR反应。PCR反应条件:95℃预变性5min;94℃变性,72℃延伸1.5min,35个循环;72℃再次延伸10min。电泳后切胶用胶回收试剂盒回收DNA片段并与pMD18-T载体连接,转化DH5α感受态细菌,涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板上,挑取细菌进行扩大培养,提取质粒,通过PCR鉴定,选取阳性质粒送TaKaRa公司测序。猪丹毒杆菌SpaA基因的同源性比对分析应用DNAman生物软件,对所测2株猪丹毒杆菌SpaA基因序列与GenBank中登录的部分猪丹毒杆菌菌株的SpaA基因进行同源性比较,并进行发育进化树分析。猪丹毒杆菌保护性抗原SpaA的理化性质及功能域分析选取1株猪丹毒杆菌分离株为研究对象,应用ExPASy工具对猪丹毒杆菌保护性抗原SpaA的性质进行分析;应用ProtParam分析酶的氨基酸序列组成、相对分子质量、等电点等理化性质;分析酶的功能域进行蛋白信号肽预测。猪丹毒杆菌SpaA基因二级结构预测应用EXPASY服务器上的SOPMA方案分析预测猪丹毒杆菌SpaA蛋白的二级结构。猪丹毒杆菌保护性抗原SpaA蛋白的B细胞表位预测采用Hopp-Woods亲水性参数、Zim-merman极性参数、柔韧性参数、抗原性参数和Emini表面可及性参数分别进行单参数预测。对各个参数的预测结果进行比较,最后进行综合分析以确定猪丹毒杆菌SpaA蛋白的B细胞表位。

2结果

电泳条带经回收、克隆,以克隆后提取的质粒为模板进行PCR阳性鉴定正确。猪丹毒杆菌SpaA基因的发育进化树分析应用DNAman软件对目的条带的测序结果和Gen-Bank中部分猪丹毒杆菌菌株的SpaA基因进行发育进化树分析,结果发现本试验分离的2株猪丹毒杆菌菌株与GenBank中其他菌株在进化树中分布较远,自成一个分支。猪丹毒杆菌SpaA蛋白的理化性质分析选择猪丹毒杆菌FZ2007-1分离株作为代表性毒株进行分析。用E分析猪丹毒杆菌的理化性质,结果显示,该酶有626个氨基酸,其相对分子质量为72190.3,理论等电点(PI)为9.04,为偏碱性蛋白质。猪丹毒杆菌SpaA蛋白的信号肽预测用分析SpaA蛋白的氨基酸序列信号肽的存在位置及序列,结果显示,该酶氨基酸序列上信号肽的剪切位点位于第29~30个氨基酸。猪丹毒杆菌SpaA蛋白的功能域分析将猪丹毒杆菌SpaA蛋白的氨基酸序列提交到ScanPro-site服务器,对SpaA蛋白进行翻译后修饰位点结构分析。结果表明,该蛋白有1个组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶家族元件,1个细胞壁结合重复元件,8个肉豆蔻酰化位点猪丹毒杆菌SpaA蛋白的二级结构通过NPS@服务器上的SOPMA方案预测SpaA蛋白的二级结构成分,结果表明,该蛋白主要由α螺旋和无规则卷曲组成,其中,α螺旋有335个、占53.51%,延伸链有78个、占12.46%,β转角有66个、占10.54%,无规则卷曲有147个、占23.48%。猪丹毒杆菌SpaA蛋白的B细胞表位预测分别对SpaA蛋白的极性、亲水性、柔韧性、抗原性和表面可及性参数进行预测,B细胞抗原表位的数目及抗原表位可能出现的肽段有所不同,但均显示,各种方案所预测的参数值均高于其他区段。因此,以上多个区段形成B细胞表位的可能性最大。

3讨论

结果表明该片段能够防止杆菌对猪的感染。Shimoj等也通过表杆菌SpaA蛋白N端2/3区域,免疫小鼠后,小鼠可产生较强的免疫保护力。对于蛋白的B细胞表位预测,已有多种单参数预测模型和相应的分析软件,但为了克服单参数预测模型的局限性,提高预测的准确性,一般对多种参数的预测结果进行综合考虑,其中比较重要的参数为亲水性参数、极性参数和柔韧性参数。通常蛋白质的二级结构与蛋白质的B细胞表位有较大的关系。猪丹毒是由猪丹毒杆菌引起的一种急性、热性人畜共患传染病,其主要特征表现为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及多发性非化脓性关节炎。该病分布广泛、世界各地均有发生,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。特别是在最近2年,由于“高热病”的暴发,导致猪群免疫力下降,猪丹毒在全国各地均有零星发生的报道,并有小范围流行的可能性[19-20]。近几年来,对猪丹毒杆菌的分子生物学和免疫学进行了一些研究,吾鲁木汗·那孜尔别克等对猪丹毒杆菌SpaA基因的原核表达和重组疫苗的研究结果表明,SpaA蛋白具有良好的免疫保护作用。晏鹏飞等通过研究表明猪丹毒杆菌表面保护性蛋白A起主要保护功能的核心区段为氨基端,且是由抗体介导的免疫保护。Aimad等克隆和表达了编码SpaA蛋白N端的基因片段,通过West-ernblot检测其免疫功能,本试验运用SOPMA方案预测蛋白质的二级结构,结合亲水性方案、极性方案、柔韧性方案、Emini表面可及性方案和Jameson-Wolf抗原性指数方案多种方法综合分析,发现该酶以α螺旋(占53.51%)、无规则卷曲(占23.48%)、延伸链(占12.46%)为主,而β转角只占10.54%;并应用不同的方案预测了B细胞表位的优势区。本研究基于猪丹毒杆菌SpaA蛋白的氨基酸序列,通过对其二级结构、跨膜区、亲水性、表面可及性与抗原性等多种参数进行综合分析,预测了SpaA蛋白可能的B细胞优势表位,为寻找特异性相关表位用于疫苗的设计、诊断试剂研发、免疫机理的探讨等提供了理论依据,同时也为猪丹毒杆菌SpaA蛋白功能研究提供了线索。

作者:林琳江斌吴胜会张世忠单位:福建省农业科学院

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