1DNA在农杆菌中的稳定性

在EHA105和AGL－1中质粒出现了明显的降解。Song等研究发现土豆基因组DNA超过100kb的BIBAC和TAC克隆在农杆菌中不稳定，在同时进行试验的土豆基因组片段中，45kb的片段不会出现丢失的现象，遗传稳定。Shi等检测了玉米中40～160kb的BIBAC克隆，无论在大肠杆菌中还是农杆菌中都稳定的遗传。3．3受体材料的选择处于不同发育状态的受体材料对农杆菌侵染的敏感程度是不同的，但处于细胞分裂s期（DNA合成期）的核基因组DNA正在复制，这对于外源基因的整合十分有利，选择此时期的细胞才具有整合外源基因的能力。细胞具有分裂能力是转化的基本条件，创造出伤口的幼年组织细胞分裂快，处于转化的敏感期，因此农杆菌转化和再生的良好外植体来源是幼胚或经成熟胚诱导产生的胚性愈伤组织，一般幼胚的转化率略高于成熟胚。悬浮细胞系虽能活跃增殖，但其体细胞变异频率大、转化效率低，因而不适用于转化。DNA与基因组的整合DNA作为外来者被整合到受体植物基因组中，出现转基因表达有所下降或者不表达等复杂现象。根据报道，外源基因被整合到受体植物基因组后，将产生以下几种形式，一是外源基因插入到基因组的沉默区域内，导致基因组内沉默不表达的基因被激活而高效表达；二是外源基因随机插入到基因组的阅读框内，使基因组正常核酸序列被破坏不能有效表达；三是外源基因插入到基因组的功能区内，使其起调控的基因不能正常表达。等认为带有的BIBAC克隆能否在转基因植物中整合特别是在远缘物种间的整合还需要深入研究。提高基因表达的策略根据基因表达的机理，可以通过创建高效表达的转化载体来提高基因表达。一是构建理想的人工启动子：构建理想的人工启动子对的转化十分必要，设计了一种简单快捷筛选强启动子的方法，可以快速筛选出恰当长度的启动子，为构建理想的人工启动子提供了保障。二是对具有表达作用的内含子序列进行改造并插入。近年来的研究发现内含子与基因表达有关，将单子叶植物基因的内含子插入启动子和报告基因之间，可显著提高基因在单子叶植物中的表达效率。为了能够提高转基因表达的组织特异性，将拟南芥中H3组蛋白内含子进行改造，进而达到了预期效果。三是根据受体材料的基因组情况对目的基因进行改造。最典型的例子就是对基因的转化，通过将其密码子的第3个碱基进行改造后，使其在植物中的毒蛋白表达量提高0．2％～0．3％。筛选标记基因目前，大多数的筛选标记基因是抗生素和除草剂抗性基因，快速并高效的筛选标记基因是转化的关键。He等通过BIBAC2载体携带2个稳定的植物标记基因潮霉素和新霉素成功转化了水稻。此外，通过报告基因来筛选也比较快捷，但存在的问题是报告基因瞬时表达转入的外源基因，有时并非发生在可再生细胞中，这样则无法建立转化体系。以上几个为主要影响因素，此外还有一些因素也对DNA遗传转化有影响，如农杆菌的生理活性、侵染时的菌液浓度、侵染后的培养时间、温度、pH值等以及表面活性剂的使用情况等。

2结论与探讨

可以将大基因组物种DNA有序的保存起来，通过将单个克隆保存在384板中，不仅减少后续研究中对DNA需求反复提取的繁琐，也使后续试验操作变得简单快捷；对基因组而言，有序文库比无序的片段要方便的多。其次，为基因组功能的研究、基因组测序及单个基因的克隆鉴定提供非常必要的操作平台。DNA遗传转化技术在基因簇转移、多基因、代谢工程、基因图位克隆、数量性状座位等方面有重要意义，是植物遗传转化的发展趋势，也是植物转化的现实要求。但是目前国内的DNA研究起步较晚成果较少，仍存在很多挑战，如许多重要的经济作物、稀有物种对农杆菌介导的遗传转化高度不亲和性；转化后外源基因在植株中能否稳定的表达；如何提高转化效率等，这些都是未来需要探讨和深入研究的问题。相信随着分子生物学的发展，转基因技术日趋成熟，所面临的问题会迎刃而解，DAN的未来会更光明。

作者：杨俊单位：东南职业技术学院