1玻璃化冷冻保存法

生物材料(细胞、组织、器官)脱离供体后实现长时间的保存很难。伴随着低温保存技术的不断发展,学者们发现在深低温环境中的离体生物材料会逐渐减缓其新陈代谢,严重的停止新陈代谢,因此能够使其得以长期保存。玻璃化冷冻保存法自被人发明至今一直都是低温保存领域内的专家所研究的焦点话题。由于科技进步,随着研究技术的不断发展和应用领域的不断扩展,玻璃化保存技术和方法已广泛地用于各种生物材料的低温保存中。玻璃化冷冻保存技术里面所述的“玻璃化”是着眼于物理层面所定义的,即在短时间内降低液体的温度,使其变成玻璃体(非晶体固态)。影响玻璃化保存的主要因素包括冷冻保护剂(cryoprotectiveagents,CPAs)的种类及浓度、降温速率、升温速率和储存温度等。要实现玻璃化的关键是需要极快的降温速率和较高浓度的CPAs。当前一共有50多种冷冻保护剂是运用比较广泛的,一共有3个类别。CPAs的的挑选是非常关键的,运用在玻璃化冷冻保存的CPAs浓度要比另外一些诸如程序性降温的冻存工艺浓度更高。研究得知,CPAs溶液的浓度与在相同时间范围内低温保护剂所渗进软骨内部的剂量呈现正向关联,但CPAs的浓度越高,意味着对软骨会造成越大的损伤,毒性非常大。科学分配CPAs,让它不仅仅发挥其玻璃化与穿透性作用,而且还可以减轻冷冻保护剂对细胞可能造成的伤害。玻璃化冷冻保存技术为组织器官的长期保存提供更为广阔的前景,玻璃化冷存工艺能够使得原本生物细胞活性、完整性得以维持,抗原性得以缩减。如今,美国红十字会已经对CPAs的成分表示了认可,允许运用其来保存人体组织器官,到现在,在人精子、红细胞单核细胞、胰岛等的保存中得以广泛的运用。

2玻璃化冷冻保存法在运动医学骨关节组织保存的应用

2.1关节软骨组织的玻璃化冷冻保存

运动医学领域非常普遍的病变就包括了软骨损伤与缺损,缺损后软骨不具有较好的自身修复与重建能力,假若治疗不及时,会使得软骨出现严重的退变。关节软骨包括了诸多细胞外基质(占据比重为98%~99%)与少部分的软骨细胞,细胞外基质的成分包括水、胶原与蛋白多糖、糖蛋白与一些其他类别的蛋白。关节软骨含有丰富的水分,占据了65%~80%的湿重比。关节软骨不具有神经支配与血液、淋巴供应,相对来说它的细胞密度与活性都非常低,所以软骨一直往往不会导致剧烈的免疫反应。因此,软骨病变最长运用的修复手段就是关节软骨移植。相关研究得知,假若并未对软骨实施低温处理,常温状态下软骨只可以保存2h,软骨在3h之后其排列出现紊乱,形成了非常多的裂隙；鲜活的软骨移植物没有广泛的来源,会出现免疫排斥、移植软骨易被吸收。因此如今很多的专家都将注意力集中在冷冻软骨移植技术,期望妥善处理鲜活异体软骨移植导致的各种问题。相关研究表明：通过玻璃化冷冻保存液对软骨组织实施预处理保存之后,软骨组织活性得以提升,在8周的时间内,其存活率高达74.5%,此外细胞基质成分有着优越的代谢活性,此方法的成效非常理想。相对于缓速梯度降温这一方法,玻璃化法能够将冷冻保存后软骨细胞存活率得以明显增强,软骨基质内蛋白多糖稳定性得以保持,基质受到的损伤降低。通过玻璃化法对关节软骨进行体外冷冻保存能够获得较为理想的效果,但其移植效果还要展开更深入地研究。

2.2肌腱组织的玻璃化保存

肌腱采用玻璃化冷冻保存,其细胞活性得到较好的维持,对于肌腱细胞外基质和胶原结构的损伤非常小,所以在移植处理之后的肌腱细胞有着较好的生物活性,其修复成效和鲜活的自体肌腱无异,但相对于自体组织来说,修复重建所耗费的时间较多。肌腱是一种低免疫的原性组织,肌腱细胞承担其免疫抗原性的表达。Kagabu等在分析研究了卵巢玻璃化保存后,得知组织免疫原性会在此过程中显著下降,可能的原理为：①低温保存对异体抗原呈递细胞产生了抑制。②细胞膜组织主要的相容性抗原会被浓度较高的玻璃化溶液浸透和渗透性脱水所改变,因此供体的免疫原性被缩减。1992年,异体肌腱移植开始在临床运用。相关研究得知,玻璃化保存肌腱能够使得肌腱组织抗原性得以下降,肌腱生物活性得以保存,相对于另外一些处理方法,移植后的痊愈速度更快,获得世界众多专家学者的赞许。

3小结与展望

玻璃化法冷冻保存细胞(精子、卵母细胞等)在临床上已获得普遍的运用,逐渐完善了对皮肤、神经、角膜、心脏瓣膜、血管、肾脏、卵巢等组织的玻璃化法保存技术。同样,玻璃化冷冻法在运动医学软组织移植方面有广阔的应用前景。目前,随着技术的发展,自身组织工程软骨修复技术虽已成功研发,但是临床使用较少,费用也较昂贵,无法得到普及发展。性价比相对较高的异体组织移植技术因此得到不断发展,同种异体软骨、肌腱组织来源相对较广,移植技术已相对成熟,玻璃化保存技术的发展可为其相应的组织库保存提供技术保障,在组织修复中起到重要作用。关节软骨的玻璃化保存方法非常便捷、高效,由于冷冻工艺与冷冻剂获得了进一步发展,有效提升了其冷冻保存效果,发展前景非常广阔。

作者：李昊 亓建洪 单位：泰山医学院运动医学研究所