血管内皮屏障功能的调节机制相当复杂。α-凝血酶等炎症性介质引起内皮通透性增高的机制可能是通过G蛋白激活磷脂酶，介导三磷酸肌醇等第二信使产生，并进一步激活蛋白激酶C和肌球蛋白轻链激酶，最终引起球蛋白轻链磷酸化，从而导致内皮细胞F-肌动蛋白骨架重排，中心张力增加，细胞间裂隙形成，内皮细胞通透性发生改变。

ResearchProgressonRegulationofVascularendothelialBarrierFunction

XIAOZhen-Liang,SUNGeng-Yun(InstituteofRespiratorydiseases,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037)

AbstractTheregulatorymechanismsofvascularendothelialbarrierfunctionarecomplicated.Inflammatorymediators,suchas-α-thrombin,activatephospholipasestomediategenerationofIP3ansothersecondmesssengersthroughreceptor-coupledGprotein.ProteinkinaseCandmyosinlightchainkinasearethenactivated,leadingtophosphorylationofmyosinlightchains,rearrangementofF-actinskeleton,interendothelialcellgapformationandincreasedendothelialpermeability.

KeywordsBarrierfunction;Endothelium;Permeablity;Regulation

血管内皮包括内皮细胞（EC）单层和基膜，是血管腔面的一层半选择性通透屏障。血管内外溶质和液体的交换受体内皮通透性大小控制。通透性是检测内皮屏障功能的客观计量指标。许多炎性、成血栓性（thrombogenic）介质均可损伤内皮屏障功能，导致其通透性增高，血浆蛋白渗出，引起组织、器官水肿和功能障碍。血管内皮屏障功能障碍是炎症的主要特征之一，并参与肿瘤转移、免疫反应及多器官功能障碍的发生。本文就近年来血管内皮障碍功能调节的研究进展，特别是有关的信号转导机制作一简要综述。

一、内皮细胞间连接与内屏障功能

溶质分子跨内皮转运有三条途径[1]，即细胞旁扩散（paracellulardiffustion）、穿细胞通道（transcellularchannel）和胞内小泡介导途径（vesicle-mediatedpathway）。其中细胞旁扩散是主要途径。正常情况下，内皮对溶质分子的通透有选择性；大分子物质如白蛋白仅少量经穿细胞通道和小泡介导途径转运至内皮外。当内皮屏障功能受损时，由于EC间裂隙形成，内皮对溶质分子的选择性丧失，大分子物质主要经细胞旁扩散转运[1，2]。

EC间存在紧密连接、中间连接和缝隙连接[2，3]。缝隙连接主要存在于动脉EC间，静脉EC间也有少量存在，新近发现人脐动、静脉内皮的缝隙连接含有Cx37、Cx40和Cx43三种连接素（connexin）[3]。紧密连接和中间连接则普遍存在于EC间。细胞间接损伤导致EC间裂隙形成和内皮通透性增高，是通透性水肿发生的基础。

（一）紧密连接紧密连接多存在于EC的近腔面。有的环绕整个细胞形成闭锁小带；有的则间断存在，称为闭锁斑。闭锁小带只见于脑血管内皮，其它器官EC间主要是闭锁斑。电镜观察发现，EC间的紧密连接部位存在由双侧胞膜形成的叶片（leaflets）状结构，彼此粘合紧密，对溶质分子的跨内皮转运起限制作用。紧密连接的胞浆面还存在着一种分子量为225kD蛋白质ZO-1[1，2]，与胞内F-肌动蛋白骨架相连。

细胞骨架包括微丝、微管和中间丝。微丝主要由F-肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和α-辅肌动蛋白组成，F-肌动蛋白骨架包括不同的微丝束类型，如应力纤维、细胞周边的致密外周束（denseperipheralband）、中央短纤维等[4，5]。它们之间可以相互转化。位于核周的中央短纤维产生的中心张力（centripetaltesion）是调节内皮通透性的直接动力。中心张力来源于肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化介导的肌动-肌球蛋白间相互作用[3]。它与由EC间连接、EC-基膜间粘附所产生的拴缚力（tetheringforce）是一对作用方向相反的力。前者使EC产生收缩；后者的作用则将EC与EC、EC与基膜拴缚在一起。两者平衡时，EC间隙和骨皮通透性维持正常状态；当内皮受到炎性介质如α-凝血酶等刺激时，F-肌动蛋白骨架发生重排，中心张力增加并通过ZO-1使细胞间连接发生改变，结果细胞收缩变圆，EC间裂隙形成，内皮通透性增高[5，6]。

（二）中间连接内皮中间连接发生在相邻细胞的钙粘附素（cadherins）分子之间，由Ca2++介导，以同质粘健（homotypicadhesion）的方式使两侧的钙粘附素分子端-羰连接[2]。同持粘附是指同种分子之间发生的粘附。钙粘附素分子的中一端通过纽带蛋白（vinculin）、α-辅肌动蛋白和catenin与F-肌动蛋白呈链状连接，因此F-肌动蛋白骨架的变化可通过以上链状结构影响中间连接，使EC间裂隙和内皮通透性发生改变。Ca2+通过影响钙粘附素之间及钙粘附素与catenin之间的连接参与内皮屏障功能的调节，起着“钙开关”的作用。胞内Ca2+浓度（[Ca2+]i）升高，内皮屏障功能下降；Ca2+]i下降到原来水平，内皮屏障功能又恢复正常[2]。

总之，细胞旁扩散是溶质跨内皮转运的主要途径；中心张力和拴缚力之间的平衡，直接影响细胞间连接和EC间裂隙形成，是内皮屏障功能的决定因素。

二、基膜对内皮屏障功能的影响

血管内皮屏障包括EC单层和基膜。基膜由胶原蛋白、蛋白多糖、弹性蛋白、糖蛋白和纤维蛋白等生物大分子构成。这些分子相互交联形成复杂的网状结构，是EC的惰性支持物。近年来发现，内皮基膜对溶质和液体的跨内皮转运有重要影响。实验发现，去除基膜后内皮对白蛋白的通透性可增加14倍[7]。

（一）基膜成分与内皮通透性胶原是构成基膜的主要成分之一，对39-110kD的溶质分子有选择通透性；用Ⅰ型胶原覆盖微孔滤膜，可使其对白蛋白的通透性降低30%；在培养液中加入抗坏血酸，可通过刺激胶原合成增加，降低人脐静脉内皮细胞（HUVEC）单层对大分子物质的通透性[8]。Partridge等发现，104U/ml的肿瘤坏死因子α（TNFα）即可诱导牛肺微血管内皮细胞单层通透性增高。其机制是TNFα诱导EC产生了一种96kD的明胶酶，裂解了基质成分如纤维连接蛋白、层粘蛋白、明胶及IV、V型胶原[9]。Partridge还发现，低氧引起内皮通透性增高时，EC间裂隙增宽，肌动蛋白骨架重排，同时纤维连接蛋白、波影蛋白（vitronectin）等基质的含量也下降[10]。有人用透明质酸酶处理内皮基膜以去除透明质酸，结果通透性较对照组增加了6倍[11]。这表明基质成分的改变会影响内皮屏障功能。

（二）EC与基膜粘附EC与基膜经整合素介导，以灶性接触（focalcontact）的方式发生粘附，形成粘附斑（adhesionplaque）。整合素分子由两个非共价键结合的亚单位组成，两条链均为完整的膜蛋白，其分子量分别为120-180kD和90-180kD。整合素以跨膜受体的形式存在，桥接细胞外基质蛋白与细胞骨架蛋白（即肌动蛋白、纽带蛋白和α-辅肌动蛋白）。整合素与配体结合的特点是，一种整合素可与多种配体结合，而同一种配基亦可与多种整合素结合。已知的整合素已超过21种，介导EC与基膜间粘附的主要由β1和β2参与组成的整合素。新近发现，EC与基膜间粘附对纤维内皮屏障完整性具有明显意义。用合成肽Gly-Arg-Ser(GRGDS)阻断整合素的RGD基团与胶原蛋白、纤维连接蛋白、波影蛋白和层粘蛋白结合，结果导致EC收缩变圆，甚至从基膜上脱落，从而引起内皮通透性增高[12]。

EC与基膜间粘附影响内皮通透性的机制尚未阐明。Burridge认为，基膜中的胶原、纤维连接蛋白、层粘蛋白和波影蛋白与整合素的细胞外区（N-末端）结合；F-肌动蛋白则通过α-辅肌动蛋白与纽带蛋白相连，纽带蛋白再通过talin与整合素的细胞内区（C-末端）连接。这样，整合素不仅介导了EC与基膜间粘附，还将细胞骨架蛋白与基质蛋白“串连”起来，具有显著的生物力学意义。当内皮受到炎性介质刺激时，EC的F-肌动蛋白骨架发生重排，中心张力的变化即可沿上述结构传至基膜；同样，基膜产生的任何力学变化也可逆向传入细胞内。电镜发现EC中的应力纤维与粘附斑的胞浆区存在清晰的粘附点，为上述假设提供了直接证据。纤维连接蛋白粘附。用纤维连接蛋白处理牛肺动脉内皮，结果抑制了TNFα诱导的通透性增高。另有报道，一种非整合素家族的跨膜蛋白GP116也可介导EC与基膜间粘附，参与内皮屏障功能调节[2]。

三、内皮屏障功能调节的信号转导

任何刺激均需通过相应的信号转导系统，将刺激信号传入EC中，才能对内皮屏障功能产生影响。G蛋白、磷脂酶C（PLC）、蛋白激酶C（PKC）、酪氨酸激酶（TK）及肌球蛋白轻链（MLC）均参与了内皮屏障功能调节的信号转导。

（一）G蛋白G蛋白是一类由Gα、Gβ、Gγ亚基构成的异三聚体蛋白，有Gs、Gi、Gq、G12四类共十几种亚型。G蛋白与膜受体偶联，将刺激信号传至PLC（特别是PLCβ）、磷脂酶A2（PLA2）、腺苷酸环化酶（AC）、磷酸二酯酶和离子通道。G蛋白激活是从受体将信号传入EC，并触发细胞骨架收缩过程中的关键环节之一。配体与特异受体结合，导致不同G蛋白亚型的激活。例如H1组胺受体激活时，胞内三磷酸肌醇（IP3）和Ca2+水平升高，提示该反应可能与Gi或Gq蛋白偶联。而H2组胺受体受到刺激时，AC被活化，cAMP含量增加，表明H2受体与Gs蛋白偶联[1]。G蛋白对刺激信号有放大作用。一个受体可与多个G蛋白偶联，而一个G蛋白可同时激活多条信号通路。百日咳毒素能使某些G蛋白亚型与受体失偶联，阻断信号转导。例如与组胺受体偶联的G蛋白即属百日咳毒素敏感型；而与α凝血酶和缓激肽受体偶联的G蛋白则属百日毒素非敏感型[2]。

（二）PLC信号PLC的主要作用底物是三种磷脂肌醇，即4，5二磷酸磷脂肌醇（PIP2），4-磷酸磷脂肌醇（PIP）和磷酸磷脂肌醇（PI）。PIP2水解产生IP3和二酰基甘油（DAG）。PIP和PI水解只产生DAG，不产生IP3。IP3与内质网上的受体结合使内贮Ca2+释放入胞浆，导致[Ca2+]i升高。实验发现，α-凝血酶刺激培养牛肺动脉内皮细胞（BPAEC）后，10秒内IP3水平明显升高，20秒降至基础水平；Ca2+]i约17秒升至峰值，从基础水平59±8nmol/L升至同定Ca2+释放引起，第二时相则由Ca2+内流引起[13]。磷脂肌醇水解产生的第二信使DAG和IP-3是α-凝血酶诱导上皮通透性增高的关键信号。

Ca2+和DAG通过多条效应途径参与内皮屏障功能调节。Ca2+和DNG均可直接激活PKC；[Ca2+]i升高也能激活PLC和PLA2。PLC和LPA2分解膜磷脂产生DAG和花生四烯酸。后两者具有潜在激活PKC的活性，这可能是炎性介质引起内皮通透性增高后纤维较长时间的机制之一。花生四烯酸代谢产生可能也参与了内皮屏障功能的调节。以去二氢愈创木酸抑制花生四烯酸的脂氧化酶代谢途径，结果[Ca2+]i升高的第二时相消失，也抑制α-凝血酶诱导的血管内皮通透性增高。

（三）PKC激活组胺、α-凝血酶等炎性介质可引起内皮屏障功能损害。它们通过与膜上的受体结合，激活偶联G蛋白，进一步激活PLC；氧自由基、血流剪切力损伤内皮屏障则不经受体结合，直接激活PLC。上述两类损伤因素激活PLC的途径虽不同，但最终都激活PKC。

PKC是参与细胞信号转导的一组重要蛋白质。目前在哺乳动物中至少发现10种亚型，均具有不同的底物特异性。根据其对Ca2+、DAG和磷脂酸丝氨酸（PS）三种激活剂的反应分类三类：第一类包括α、β1、βⅡ和γ，均能被三种激动剂激活；第二类包括ε、δ、θ和η，由PS和DAG激活，对Ca2+不敏感；第三类包括ξ和λ，由PS激活，对DAG和Ca2+不敏感。研究发现，α-凝血酶诱导内皮通透性增高时，[Ca2+]i升高，PKC激活；阻断Ca2+内流，则PKC激活和内皮通透性增高受到抑制。参与内皮屏障功能调节的PKC亚型尚不完全清清楚楚，但已知由Ca2+激活的PKC主要是PKC-α和PKC-β。凝血酶和过氧化氢诱导的内皮通透性增高由Ca2+激活的PKC介导；缓激肽诱导的内皮通透性增高则由DAG激活的PKC介导。这表明内皮通透性调节的信号转导随激动剂不同而有差异。EC中PKC激活分为两个时相[14]，第一时相快速、短暂，主要由DAG和Ca2+快速增加引起；第二时相出现较晚，持续时间较长（约1小时），可能仅由DAG引起。介导第二时相的DAG来源于PLC和磷脂酶D（PLD）水解磷脂酰胆碱。

（四）TK激活内皮屏障功能受损的另一条途径由TK介导[13]。TK的主要作用是使细胞骨架蛋白如纽带蛋白、talin、β-catenin磷酸化，从而使细胞之间、细胞与基膜之间的连接发生改变，EC收缩变圆，内皮通透性增高。炎性介质如α-凝血酶诱导的TK激活可能由跨膜G蛋白介导。PKC激活和[Ca2+]i升高也与TK介导的蛋白磷酸化有关[13]。TK参与内皮屏障功能调节的机制尚待进一步研究。

（五）MLC的磷酸化和去磷酸化近年来关于磷酸化和去磷酸化的研究倍受重视，认为磷酸化和去磷酸化是细胞信号转导的公共通路或最后通路。蛋白磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的所有过程。内皮通透性调节即是通过MLC和其它蛋白的磷酸化和去磷酸化实现的。

1.MLC磷酸化：研究体外培养的HUVEC和BPAEC单层发现，肌球蛋白轻链激酶（MLCK）激活时，EC间裂隙形成，胞内ATP、Ca2+、钙调蛋白（CaM）含量及MLC磷酸化水平升高。基础状态下EC内即存在MLC磷酸化，F-肌动蛋白骨架也表现出中心张力。当EC受到凝血酶或组胺刺激时，MLC发生快速单磷酸化和双磷酸化，诱导肌动-肌球蛋白间相互作用，中心张力增高，EC间隙形成，内皮通透性增高[13，15]。凝血酶刺激后15秒即有MLC磷酸化增加，峰值则出现在刺激后1-2分钟，约有60%-80%的MLC发生磷酸化并主要以双磷酸化的形式存在。预先加入MLCK抑制可阻断凝血酶引起的MLC磷酸化和EC单层通透性增高。

有人对MLC磷酸化过程提出如下假设[16]：PLC介导PKC活化和[Ca2+]i升高；再由Ca2+与钙调蛋白结合形成Ca-CaM，激活MLCK；最后由MLCK介导MLC磷酸化，Ca-CaM活化MLCK的过程需要PCK参与。cAMP对内皮通透性增高抑制作用，机制尚不清楚。加入外源性的cAMP可减弱炎性介质诱导的MLC磷酸化，表明cAMP保护内皮屏障功能的机制与MLC磷酸化有关[16]。β2-肾上腺素受体激动剂formoterol和异丙肾上腺素能促进cAMP合成增加，故对内皮屏障功能有一定的保护作用[17]。

2.MLC的磷酸化：EC受到组胺、凝血酶刺激后，MLC磷酸化水平迅速升高，5-30分钟内快速下降。MLC去磷酸化可能是MLCK被激活后又迅速失活，或MLC特异性的磷酸酯酶活性增高，也可能与两者均有关。内皮受凝血酶刺激后5分钟内由基础水平的.64N/cm2增至1.3N/cm2，并持续40分钟以上。可见MLC磷酸化与中心张力变化存在时相上的差异。推测EC收缩存在类似于平滑肌收缩时的“门栓状态”（latchbridge），即中心张力和细胞收缩状态的维持与MIC磷酸化无关。有关EC中MLC特异性磷酸酯酶活性的调节，目前知之不多；有人认为MLC的去磷酸化与L型丝氨酸/苏氨酸磷酸酯酶有关[15]。

四、内皮通透性增高的逆转和“关闭”（turnoff）

多数炎性介质引起的内皮通透性增高是可逆的。Khimenko实验室的工作表明，下列因素可使内皮通透性高发生逆转[18]：⑴β-受体激活；⑵腺苷A2-受体激活；⑶AC激活；⑷加入cAMP类似物；⑸抑制磷酸二酯酶。其机制与EC中cAMP含量增加有关。

内皮通透性增高还可发生自然“关闭”。例如用α-凝血酶连续灌注肺血管，10分钟后毛细血管滤过系数升至峰值；停止灌注后40分钟，滤过系数恢复正常；EC收缩和细胞间隙增宽也在30分钟内恢复正常[19]。内皮通透性增高“关闭”的机制涉及信号转导过程的多个环节：⑴介质受体失敏，α-凝血酶引起凝血酶受体失敏是受体蛋白被水解，使EC膜上的的功能受体数下降所致。Vu等认为，一旦α-凝血酶引起内皮通透性增高，即不能再激发第二次反应。只有当新的受体合成并转移至胞膜表面时，才能对刺激产生新的反应。受体失敏的另一机制受体内化，缓激肽刺激可使其位于EC胞膜上的受体数因内化而下降约70%。β-肾上腺素受体则可因磷酸化而失敏；⑵PKC激活的负反馈通路抑制了与内皮通透性增高有关的信号转导，如PKC可使PLC与G蛋白之间失偶联，从而抑制了内皮通透性的增高；⑶内源性PKC抑制剂使PKC活性受到特异性调节；⑷磷酸二酯酶活化和MLCK失活。前者使磷酸化MLC水解增多，后者使磷酸化MLC形成减少；⑸可能与EC中的前列环素产生增加有关；⑹G蛋白下调，原因尚不清楚。可见内皮通透性“关闭”的机制十分复杂，某些环节有待进一步探讨。

目前对内皮屏障功能调节的机制已有深入的认识，但也存在一些不同的观点。例如多数人认为Ca-CaM激活MLCK是MLC磷酸化和F-肌动蛋白肌架重排发生的机制，PKC的作用是介导Ca-CaM的形成。但有人用药物阻断[Ca2+]i升高和PKC的激活并不能抑制MLC磷酸化和F-肌动蛋白骨架重排，推测有另外的机制参与[6]。甚至有认为，炎性介质引起的内皮通透性增高与F-肌动蛋白骨架重排和EC收缩无关[20]。内皮屏障功能的调节机制亟待进一步研究。

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