单细胞生物特点范文第1篇

单克隆抗体是指源自一个B淋巴细胞的克隆所产生的抗体，它只会特异性地作用于一种抗原决定簇。

在弄清什么是单克隆抗体之前，我们先让学生回顾一下抗体的基础知识，接着了解以下两个问题：传统的抗体生产方法及缺陷是什么？抗体是从何来的？

1.获得抗体的传统方法及缺点。

传统的抗体产生的方法是向动物体内反复注射某种抗原，通过反复感染动物，使动物产生抗体。然后从动物血清中分离所需抗体。如此得来的抗体产量少，纯度低，且制备的抗体特异性差，难免含有所需抗体以外的多种其他抗体。

2.抗体是从何来的。

对于一种免疫刺激而言，由于抗原本身是一种复杂的大分子物质，在其表面通常具有多种抗原决定簇（抗原物质上被特异性识别的一些化学基因）。而不同的抗原决定簇的激发的免疫反应强度也有所不同，并且一个B淋巴细胞只可能产生一种针对某一种抗原决定簇的抗体。故此连续注射抗原时，一种抗原的多种抗原决定簇就会刺激多个免疫细胞增殖和分化，形成的浆细胞群就会合成并分泌多种抗体。像这样由同一抗原不同抗原决定簇而引发机体产生的不同类型的单一抗体，称为多克隆抗体。

比如某种病毒有三种抗原决定簇，当这种病毒入侵人体后，人的B淋巴细胞就受到病毒的刺激将产生针对此病毒的三种不同标志的特异性抗体，分别由三组人的B细胞产生。 要把抗体应用于人工被动免疫，必须制备针对某一特定抗原决定簇的单一类型抗体分子。

一个B淋巴细胞只可能产生一种针对其中一种抗原决定簇的抗体，基于这个特点，我们要想应用于人工免疫就是要获得大量的单一抗体。怎么解决这个问题呢？理想的设想就是要把发生单个免疫后的B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆化），形成细胞群，再由此细胞群分泌出化学性质单一，特异性强，灵敏度高的单克隆抗体。可是在自然情况下，不论生物体内还是生物体外都不可能让B淋巴细胞进行大量增殖，特别是在体外培养条件下会很快死亡。

那么，米尔斯坦和柯勒这两位科学家是如何解决此问题的呢？他们设计了极富有创造性的方案。其中用到了骨髓瘤细胞，骨髓瘤细胞是一种肿瘤细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞（杂交瘤细胞），既能大量增殖又能产生足够数量的特定抗体。

接下来，教师导入重难点的教学过程――单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程是怎样的呢？大致分为五个步骤：

（1）B淋巴细胞及骨髓瘤细胞的获得。

给小鼠注射特定的抗原。通过对小白鼠进行初次免疫，第二次免疫，加强免疫三个阶段，使小鼠产生免疫反应。从产生免疫反应小鼠的脾脏细胞中得到相应的抗体。说明在小鼠的脾脏细胞中形成了相应的B淋巴细胞，然后从免疫小鼠的脾脏中分离出B淋巴细胞（B），注意B淋巴细胞是一个系列（B1、B2、B3・・・・・・Bn）。

同时现行实验室所用的瘤细胞均是从Balb/c小白鼠品系诱导而来的次黄嘌呤―鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型，提取并培养小鼠的骨髓瘤细胞获得大量的骨髓瘤细胞（G）。

（2）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合。

将含有B淋巴细胞的细胞悬浮液，与制备好的同系骨髓瘤细胞按一定浓度混合，加入促融剂聚乙二醇（PEG）或灭火的仙台病毒诱导融合，各种淋巴细胞将与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。

细胞间的融合是一个随机的生理过程，成功率较低且随机性大。细胞融合物中将以多种形成出现：有骨髓瘤―骨髓瘤融合细胞（GG），B淋巴―B淋巴融合细胞（BB），骨髓瘤―B淋巴融合细胞（BG）即杂交瘤细胞，还有未融合的骨髓瘤细胞（G），B淋巴细胞（B），以及细胞多聚体（容易死亡，无需特别筛选）。因此必经通过筛选分离出既能分泌抗体，又能大量增殖的杂交瘤细胞（B1G，B2G，B3G・・・・・・BnG）

（3）杂交瘤细胞的筛选（第一次筛选）：在“选择培养基”上培养筛选 杂交瘤细胞。

选择性培养的目的就是筛选融合的杂交瘤细胞。一般采用HAT选择培养基，在HAT培养基中未融合的骨髓瘤细胞（G）及融合的骨髓瘤细胞（GG）因缺乏次黄嘌呤―鸟嘌呤磷酸核糖转移酶而不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞（B）及融合的淋巴细胞（BB），虽具有次黄嘌呤―鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，但本身在体外不能长期存活而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从淋巴细胞获得了次黄嘌呤―鸟嘌呤磷酸核糖转移酶并具有骨髓瘤细胞的无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活并增殖。

（4）杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆（第二次筛选）。

在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性抗体的细胞，因此必须进行筛选克隆化。通常采用“有限稀释法”进行杂交瘤细胞克隆化培养，采用灵敏、快速、特异的免疫学方法筛选出能产生单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。

具体做法是将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让细胞增殖，然后检验每个孔上清液中细胞分泌的抗体。其中上清液可与特定抗原结合的培养孔为抗体阳性孔，然后让这个孔的杂交瘤细胞进行克隆增殖并及时进行冻存。

（5）抗体的大量制备。

一般采用动物体内诱生法和动物体外培养法。

体内诱生法，就是将（产生特定抗体的）杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖的1～2周后，用注射器从腹水中抽取大量的单克隆抗体。

体外培养法，将杂交瘤细胞放入培养液中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞增殖并产生单克隆抗体，收集上清液离心去除细胞及其碎片，即可获得需要的单克隆抗体。

近年来各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了单克隆抗体的生产量。

单细胞生物特点范文第2篇

“单克隆抗体的制备”是选修三“动物细胞工程”这一章的重点内容，虽然高考对选修教材要求层次相对较低，但两次筛选过程仍时有考查。课本中对第一次筛选这样叙述：“根据这个设想，他们首先将抗原注射入小鼠体内，然后从小鼠脾脏中获得能产生抗体的B淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒或聚乙二醇的诱导下融合，再在特定的选择性培养基中，筛选出杂交瘤细胞。”学生在预习中多次会问及这是什么样的选择培养基，怎样选择。在诱导剂作用下，培养基中会出现三种细胞，B淋巴细胞与B淋巴细胞融合，骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合，以及B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，未融合的B淋巴细胞、未融合的瘤细胞，以及细胞的多聚体形式等。正常的B淋巴细胞在培养基中存活仅5～7天，不需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去，而未融合瘤细胞则需进行特别的筛选去除。

在普通动物培养基中加入次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺密啶脱氧核苷酸制成HAT培养基，这是根据细胞中的DNA合成途径有两条：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子合成提供原料。此过程中，叶酸作为重要辅酶参与此过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”，氨基蝶呤这种独特的拮抗叶酸作用，也广泛用于医学领域，如治疗一些顽固性疾病、类风湿性关节炎、牛皮癣等，效果显著。DNA的另一条合成途径是应急途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶，催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个融合的效应B细胞融合的“D途径”被氨基蝶呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏体外培养液中增殖的能力，一般10d左右死亡。对于骨髓瘤细胞及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶缺陷型细胞，因此，自身无“S途径”，且“D途径”又被氨基蝶呤阻断，所以HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有瘤细胞与效应B细胞相互融合的细胞，既有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。

课本中对第二次筛选是这样叙述的：“他们培养杂交瘤细胞，从中选出能够产生所需抗体的细胞群，继续培养，以获得足够数量的细胞，在体外条件下，做大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖。”其中“从中选出能够产生所需抗体的细胞群”这句话较为概括，学生会产生疑问：“已经是效应B细胞和瘤细胞的融合体，为什么还要筛选？难道产生的抗体还有区别吗？”

在单克隆抗体制备过程中，由于注射的抗原（病毒、细菌或抗原蛋白）具有多种抗原决定簇，而一种决定簇刺激机体产生一种效应B细胞，进而产生一种针对决定簇的抗体，所以经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞群进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3～4次，直至确保每个孔中增殖的细胞为单细胞。同时，再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养，第二次筛选也是鉴定过程，因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不同的。

二、习题举例

例：人绒毛膜促性腺激素（HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，制备抗HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。下图是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图，请分析回答：

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（1）制备单克隆抗体过程中要用到（动物细胞培养）和（动物细胞融合）技术。

（2）制备单克隆抗体过程中，给小鼠注射的HCG相当于（抗原），使小鼠产生分泌相应（抗体）的淋巴细胞，此过程属于特异性免疫中的（体液）免疫。

（3）在细胞内DNA合成一般有两条途径，主途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基喋呤可以阻断此途径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。

①利用DNA合成途径不同的特点配制的HAT培养基含有多种成分，其中添加的（氨基喋呤）成分具有筛选杂交瘤细胞的作用。

单细胞生物特点范文第3篇

摘要：

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是体内体液免疫的重要组成部分。Ig与免疫球蛋白受体（immunoglobulinreceptor，IgR）结合触发相应的生物学活性。不同的Ig亚型有不同的生物学功能，且IgR可作为炎症免疫相关疾病的治疗靶点，该文综述了IgR功能及在炎症免疫相关疾病治疗与药物研究中的作用。

关键词：

免疫球蛋白；免疫球蛋白受体；功能；炎症；治疗；靶点

免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）是一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。Ig或抗体是体内体液免疫的重要组成部分。Ig是由两条相同的轻链和重链组成的异源性四聚体，根据Ig重链不同将其分为5类：IgG（γ链）、IgE（ε链）、IgA（α链）、IgM（μ链）和IgD（δ链），Ig重链的羧基端形成Fc段。免疫球蛋白受体（immunoglobulinreceptor，IgR），又称为Fc受体（Fcreceptors，FcRs），是一类细胞表面受体，与特定的IgFc段相结合触发细胞活动［1］。作为抗原抗体复合物的受体，IgR在体液免疫中联接先天免疫和获得性免疫。根据Ig的不同，IgR也分为5类，包括FcγR（IgG受体）、FcεR（IgE受体）、FcαR（IgA受体）、FcμR（IgM受体）和FcδR（IgD受体）。新近研究表明，FcαRI可以抑制通过其他受体途径激活的过度免疫反应；FcμR缺陷小鼠体内会产生大量自身抗体；FcμR通路介导关节炎小鼠体内中性粒细胞的募集，提示IgR与多种自身免疫性疾病密切相关。本文拟就IgR分类、功能及作为疾病治疗新靶点的研究进展加以综述。

1Fc受体的种类与功能

1．1免疫球蛋白G受体家族（FcγR）IgG是血清中含量最高的Ig，约占循环Ig的75％以上。IgG与其受体FcγR结合发挥重要作用。编码FcγR的基因位于1号染色体长臂（1q2123），有8个不同的编码FcγR基因。FcγR有3种亚型：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16），每种亚型都有不同的结构和功能特性。FcγRI（CD64）是IgG单体的高亲和力受体，表达在单核细胞、巨噬细胞以及骨髓祖细胞上。3种基因FCGR1A、FCGR1B和FCGR1C编码FcγRI，产物为FCGR1a、FCGR1b和FCGR1c［2］。通常认为，只有FCGR1a能与IgG结合，FCGR1b和FCGR1c是截短的受体或者受体的可溶形式，几乎没有特征性的生物学功能。FcγRI的γ链携带一个活化的信号基序———免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptortyrosinebasedactivationmotif：ITAM），调节FcγRI后的信号转导。FcγRII（CD32）和Fcγ5RIII（CD16），与IgG单体呈低亲和力结合。也可以通过低亲和力、高亲合力相互作用与聚集的IgG结合。IgG结合低亲和力的FcγR触发广泛的效应和免疫调节功能，包括脱颗粒作用、吞噬作用和调节抗体产生［3］。FcγRII（CD32）由3种基因编码：FCGR2A、FCGR2B和FCGR2C。所有FcγRII家族成员都有相同的结构特征———胞质区的功能信号基序，FcγRIIa和FcγRIIc为ITAM，FcγRIIb为免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptortyrosine－basedinhibitionmotif，ITIM）。FcγRIIa表达于骨髓细胞，包括多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板和一些内皮细胞；FcγRIIb表达在B淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞上；FcγRIIc仅表达在NK细胞上［4］。FcγRIII（CD16）由FCGR3A和FCGR3B基因编码。FcγRIIIa是跨膜蛋白与FcR的γ链相关，而FcγRIIIb经翻译后加工的糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚链蛋白，缺乏跨膜区和细胞内的结构域。FcγRIIIa同型在白细胞上广泛表达，包括巨噬细胞、NK细胞、一些T细胞亚群和单核细胞，而FcγRIIIb仅表达在中性粒细胞上［5］。

1．2免疫球蛋白E受体家族（FcεR）正常情况下，IgE在血清中含量非常低，但在一些如遗传性过敏症的个体，IgE的水平会被上调。IgE在针对寄生虫的免疫反应中有保护功能。FcεR的亚型包括高亲和力受体FcεRI和低亲和力受体FcεRII（CD23）。FcεRI为异四聚体结构，包含一个α亚基，一个β亚基和由两个FcRγ亚基组成的同源二聚体，由FCER1A、MS4A2和FCER1G基因各自编码。α亚基介导与IgE结合，FcεRI的β亚基是一个4α螺旋跨膜蛋白，其羧基端胞内区有酪氨酸磷酸化基序。最近研究表明，β亚基有两个剪接变体：β和βT，βT在FcεRIa的细胞靶向中发挥作用［6］。FcεRI在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上呈组成性表达，而单核细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞表达的FcεRI，仅是αγγ的异三聚体形式，没有β亚基［6］。低亲和力受体FcεRII（CD23）的亲和力约为107／M。由B淋巴细胞组成性表达，与FcγRIIb功能有关，调节B细胞上IgE表达。实验证明，IL4可使嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和T淋巴细胞上FcεRII的表达上凋［7］。FcεRII对于A解聚素的蛋白水解分裂和金属蛋白酶（ADAM）脱落酶非常敏感，可溶性的FcεRII有促有丝分裂作用［8］。

1．3免疫球蛋白A和M受体家族（Fcα／μR）多种受体可特异性结合IgA和IgM，包括多聚体的免疫球蛋白受体（polymericimmunoglobulinreceptor，pIgR）和Fcα／μR。这两种受体与IgA和IgM结合的亲和力均为中度。pIgR由PIGR基因编码，Fcα／μR由FCAMR因编码。Fcα／μR表达在成熟B淋巴细胞、巨噬细胞和次级淋巴器官如淋巴结、肠和阑尾上，预测Fcα／μR有很广泛的免疫调节作用［9］。pIgR主要表达在上皮细胞的基底外侧面，调节粘膜IgA和IgM的跨上皮转运［10］。能够特异性结合IgA的包括pIgR、Fcα／μR和其他分子，只有FcαRI（CD89）是唯一与IgA特异性结合的Fc受体［11］。FcαRI的配体结合链（α链）与FcγR和FcεRI结构上有相似。

1．4免疫球蛋白D受体家族（FcδR）1980年，Sjoberg等使用玫瑰花结试验证明正常人外周血淋巴细胞表面存在与IgD包被的乳胶颗粒结合的受体，且能被IgD特异性的阻断，称为IgD受体（FcδR）。T淋巴细胞和非T淋巴细胞表面都存在FcδR，且非T淋巴细胞上的表达是T淋巴细胞的3～10倍［12］。IgD表达在鼠类的CD4＋T细胞及人类CD4＋T和CD8＋T细胞上，在低聚IgD、Ag交联的IgD、IL2、IL4、IFNγ和PHA的作用下其表达可以上调，且与增加Th细胞的活力相关，可以增加T淋巴细胞对抗体反应后的传递辅助能力［12］。当T细胞被诱导表达膜表面FcδR，这个凝集素样的受体能在抗原呈递过程中连接B淋巴细胞膜表面IgD，加强抗原特异的T、B淋巴细胞相互作用［13］。

2靶向FcR在炎症免疫相关疾病治疗中的作用及优势

越来越多的证据表明，FcR在由免疫复合物、特别是自身免疫复合物引起的病理炎症反应中有诱导和维持作用。在正常免疫中，FcR依赖的抗体反应受到激活或抑制功能的FcR调节，在自身免疫病中这一平衡被打破，免疫复合物介导的促炎症细胞失控，导致炎症的发生和组织损伤［14］。与免疫复合物结合之后，FcR诱导强反应激活和调控免疫。可溶性重组人FcR如FcγRII能够阻断实验性局部过敏反应（ARTHUS）［15］，且在转基因鼠炎症模型中也显示治疗作用，提示FcγR在免疫复合物致炎中可作为治疗的靶点［16］。IgR做为治疗靶标有3个特点：第一，在自身免疫或其他抗体依赖的超敏反应中，直接阻断Ig和其受体的相互作用，进而阻断IgR的活化，能够预防炎症。第二，这一强有力的IgR依赖效应系统能够直接阻断促炎症反应、非靶细胞或病原体的反应。第三，活化性或抑制性受体能够相互作用或与相邻的非相关细胞表面分子作用，直接或间接调节细胞反应［1］。

直接阻断IgIgR相互作用在自身免疫炎症反应疾病的治疗中有明显优势。免疫疾病的病理过程中，自身抗体和抗原形成的免疫复合物与IgR结合，活化受体后信号，导致广泛的组织损伤，如类风湿关节炎和系统性红斑狼疮。药物开发策略旨在干预这一过程，包括：研发重组的可溶性受体阻断免疫复合物的形成，阻止复合物与IgR结合；也可直接使用小分子化合物或单克隆抗体直接作用于IgR，阻止Ig与IgR结合。使用单克隆抗体作为治疗手段，IgR的功能状态对于治疗效果非常重要。针对不同疾病单克隆抗体的功能可设计用于选择性固定、逃避、或者活化IgR。如，针对Fc段的单克隆抗体可以选择性结合激活的FcγR，诱导癌症组织破坏。也可以设计结合抑制功能的FcγRIIb单克隆抗体或正常时激活的FcR异常的抑制功能，预防或治疗炎症。使用不同方法调节细胞表面受体，诱导细胞活化。如利用治疗性抗体的抗原结合片段（antigenbindingfragment，Fab）结合特异靶器官细胞的表面分子，同时治疗性抗体的Fc段会结合同一细胞上单个FcR，使靶器官细胞的FcR活化，产生更特异的靶向治疗作用。这一构型是3个分子的复合物，它的活性可通过只调节其中的FcR来实现。因此，随着对激动性或抑制性抗体的选择性、功能或细胞分布等知识的增加，将会有可作为治疗靶点的抗体出现［1］。

3以FcR为治疗靶点的相关研究

3．1以FcαR为治疗靶点的相关研究

3．1．1FcαRI与抗炎治疗有研究利用IgE特异性免疫复合物诱导FcαRI转基因小鼠（单核细胞和巨噬细胞上表达FcαRI）产生支气管高反应性，之后采用抗FcαRIFab抗体对小鼠进行治疗，通过ITAM的作用，可明显减少支气管周围炎性细胞浸润并缓解症状［17］。抗FcαRIFab抗体治疗后，FcαRI转基因小鼠免疫诱导肾小球肾炎和非免疫梗阻性肾病模型中肾脏炎症有所缓解，炎症细胞浸润以及纤维化程度均明显降低。该抗体也能阻断狼疮性肾炎或血管炎患者单核细胞的LPS激活，以及通过来源IgA肾小球肾炎的血清IgA复合物的受体激活作用［18］。上述研究提示，FcαR是极具潜力的抗炎治疗靶点，抗FcαRIFab抗体对预防肾脏炎症疾病进展有重要作用。

3．1．2FcαRI与癌症治疗许多体内实验证实IgA1、IgA2、二聚IgA、嵌合IgA以及抗FcαRI单抗都可得到满意的治疗效果。例如，在抗FcαRI单抗作用下，中性粒细胞可更有效杀伤肿瘤细胞；抗IgA单抗和抗FcαRI单抗可增强抗原依赖性细胞毒作用，并介导中性粒细胞的迁徙［19］。FcαRI靶向的双重特异性抗体主要通过募集多核中性白细胞的ADCC和吞噬作用，使FcαRI表达效应细胞有效地杀伤肿瘤细胞，在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用［20］。

3．2以FcεR为治疗靶点的相关研究

3．2．1FcεR与过敏性疾病治疗对小鼠注射外源性毒素，如蜂毒、蛇毒等会诱导特异性Th2细胞的分化以及IgE抗体的生成，进而引发IgE介导的Ⅰ、Ⅱ型免疫反应［21］。这种获得性免疫反应又被称作“过敏反应”，在一些临床病例中，被用于保护机体对抗蛇毒等外源性毒素，而FcεRI作为IgE的特异性受体，在这类免疫反应中起到了重要作用。因此有研究者提出，适当上调FcεR功能，可能增强机体对抗外源性毒素的能力［22］。重组可溶性IgE受体atp2，可竞争性地与IgE结合，被动皮肤过敏试验中atp2对风团的大小有明显的抑制作用，但未能彻底抑制风团的形成［23］。

3．2．2FcεR与心血管疾病治疗骨髓源肥大细胞（bonemarrowderivedmastcells，BMMCs）上FcεRI的偶联会诱导肾素的释放，IgE介导的过敏反应也会促进肥大细胞（mastcells，MCs）肾素的释放。由于MCs在体内广泛分布，而多组织、器官内存在血管紧张素肽和血管紧张素转化酶，因此，过敏反应条件下产生的大量肾素会诱导血管紧张素Ⅱ的大量生成，从而介导心血管功能损伤［24］。通过抑制MCs上FcεR的偶联，可能减少肾素的释放，对心血管疾病起到治疗作用。

3．3以FcγR为治疗靶点的相关研究

3．3．1FcγR与自身免疫病治疗FcγR家族在调控促炎症反应以及抗炎反应中都起着重要作用。FcγRIIB几乎参与了上述所有过程，因此FcγRIIB是理想的免疫治疗靶点，恢复自身免疫病患者FcγRIIB功能可能成为增强免疫耐受的途径之一，上述假设已经在一系列动物实验中得到验证［25］，在狼疮易感系小鼠体内部分恢复B淋巴细胞上抑制性受体FcγRIIB的水平可以恢复免疫耐受、预防自身免疫。而阻断抗原与相应FcγR的特异性结合可以抑制慢性炎症性疾病的发展。综上，FcγR是重要的自身免疫病治疗靶点。

3．3．2FcγR与动物模型由于体外实验无法全面阐释IgFc段与FcγR间相互作用的多样性及特异性［26］，近年来，关于FcγR人源化小鼠模型的研究正逐渐成为研究热点，特异性表达人FcγRIA、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA以及FcγRIIIB基因的转基因小鼠都已问世。这些转基因小鼠模型使得在体内评估IgGFc融合蛋白的治疗效果成为可能，是药物临床前实验所不可获缺的实验材料。

3．4以FcμR为治疗靶点的相关研究

3．4．1FcμR与自身免疫病治疗IgM可以通过补体途径和FcμR途径增强体液免疫反应，FcμR途径对稳态下的B淋巴细胞存活影响并不明显，但对于BCR偶联后B细胞的存活、增殖起到明显促进作用。新近研究显示，FcμR在体内免疫耐受的调控中亦起着重要作用，FcμR缺陷小鼠体内会产生大量自身抗体，从而介导自身免疫病的发生［27］。因而，恢复病理状态下FcμR的功能将可能对自身免疫病产生治疗作用。

单细胞生物特点范文第4篇

关键词：毛细管电泳激光诱导荧光 （CELIF）； 量子点； 转铁蛋白； 偶联； 细胞标记

1引言

转铁蛋白（Trf）是脊椎动物体中一种非血红素结合铁的馇虻鞍祝捎胂赴ど系rf受体结合，内吞化形成内吞小体。在特定信号介导下，Trf可以通过释放铁离子，转移出细胞膜外。由于恶性肿瘤细胞过度表达Trf受体，因此，通过标记Trf可进行肿瘤细胞的识别、诊断和治疗研究[1，2]。量子点作为一种新型荧光材料，近年来在生物成像研究中快速发展，特别是在细胞可视化研究方面[3～11]。量子点用于细胞标记一般需将量子点与靶蛋白偶联，再通过靶蛋白结合在细胞膜或进入胞内显示量子点的荧光，由此进行靶蛋白在细胞膜及胞内的定位及成像分析。因此靶蛋白与量子点的偶联体系的构建是量子点生物成像应用的基础。

本研究选取Trf为靶蛋白，通过其与细胞膜上的Trf受体结合，进而转运靶蛋白量子点的偶联物。目前，量子点与蛋白质的偶联多采用生物素亲和素法、共价法及静电吸附法等。蛋白质与量子点偶联时，二者的混合比例决定偶联产物的质量以及生物功能化的效果。在量子点与蛋白质的偶联反应中建立高效、快速、低成本方法进行表征，对于偶联体系的优化，提高偶联效率非常必要。本研究利用毛细管电泳激光诱导荧光法（CELIF）的高效、快速、高灵敏和样品用量少等优势，对Trf与量子点CdTe偶联的方法和条件进行快速优化，并将得到的CdTeTrf偶联物不经分离而直接用于Hela细胞标记。通过激光共聚焦显微镜进行标记效果的成像观察。实验结果表明， CdTeTrf偶联物具有Trf的生物功能，并能特异性识别细胞膜表面的Trf受体，在其介导下可转运到Hela细胞内，分布在胞质中。CELIF法也适用于其它荧光纳米材料的表面功能化效率表征，包括偶联剂种类的选择和反应比例的优化、偶联产物的性质表征等，具有一定的通用性。

3结果与讨论

采用CELIF进行偶联条件优化可得到偶联产物的定性与定量信息，如荷电性质、荷质比、荧光强度、稳定性等，有助于最佳条件的判断和选择。

3.1偶联剂活化后量子点的表征

因所用量子点是以巯基乙酸为稳定剂在水相中合成而得，故量子点表面包覆着一层羧基，而量子点与Trf的偶联则通过量子点表面的羧基与蛋白质表面的氨基间的酰胺反应完成。NHS和EDC为常用的亚胺偶联剂，实验中对比了以NHS及NHS和EDC混合偶联剂（EDCNHS）活化的量子点性能（图1）。

由图1a可见，以单一偶联剂NHS活化的量子点其荧光强度高且峰形尖锐，说明单一偶联剂NHS活化的量子点粒径均一，有利于减少量子点表面缺陷，增强量子点荧光效率。当使用混合偶联剂活化时，量子点的峰形较宽，峰强度较低（图1b），说明混合偶联剂可能导致量子点的稳定性降低，量子点间产生一定程度的团聚。导致其峰高降低，峰展宽。对比图1a和图1b可见，单一偶联剂NHS活化后量子点性能好于混合偶联剂EDCNHS活化的量子点。因此后续实验均采用NHS偶联剂对量子点进行活化[12，14]。

3.2量子点偶联Trf的条件优化

NHS的存在使Trf可有效的偶联于CdTe表面，形成类似核壳结构的CdTeTrf偶联产物。由图2A第一个电泳图可见，产物峰（3.3 min）相对于活化后的CdTe（图1a， 6.3 min）迁移时间缩短，即量子点偶联蛋白后迁移加快，说明Trf确实已偶联于CdTe表面，且偶联产物表面电荷性质以及整体的荷质比更接近于蛋白质的迁移时间（约3.0 min）。因此说明不同Trf浓度下形成的偶联产物均以CdTe为核，以Trf为壳，呈现为核壳复合物。

随偶联蛋白Trf浓度的增加，偶联产物的荧光强度变化如图2B。当Trf的浓度低于31.2 olL时，随Trf的浓度增加，偶联产物荧光强度明显增强。说明包覆于表面的Trf对CdTe表面的晶格缺陷有所改善。Trf的包覆量越多，CdTe表面越完善，荧光强度越高。但当Trf浓度高于31.2 olL，荧光强度转而开始下降。说明偶联反应在31.2 olL时已达饱和，CdTe表面完全被Trf包覆，而溶液中过量的游离Trf不仅对功能化的量子点有一定的荧光猝灭作用，而且在后续偶联体系标记细胞时，游离的Trf将与偶联产物CdTeTrf一起竞争细胞上的Trf受体靶标，严重干扰CdTeTrf对细胞表面Trf受体的标记。因此，采用CELIF法对量子点偶联条件进行优化，简单快速，可明确判断蛋白质是否偶联于量子点表面，更有利于严格控制Trf与CdTe的反应比例，提高偶联效率和细胞标记效果，后续标记时不需要对偶联体系的产物进行分离纯化。由于Trf浓度增高，会使溶液粘度增加，导致电泳峰展宽，因此采用峰面积考察荧光强度变化。

由图5A可见，当Trf 浓度较低时，偶联产物CdTeTrf对细胞的标记效率低。这是由于低浓度时，偶联所得的量子点自身荧光强度较弱（图2A，低浓度），标记效果欠佳。此外，因量子点表面的Trf较少，与Hela细胞上Trf受体的结合效率较低，导致标记不完全。但当Trf浓度过量时，CdTeTrf量子点标记的效果也较差（图5C），这主要是由于偶联体系中存在的过量Trf会与CdTeTrf表面的Trf共同竞争结合Hela细胞中的Trf受体，此时游离的Trf较CdTeTrf粒径小、位阻小、运动速度快，相比CdTeTrf更易与Trf受体结合，占据了Hela细胞的结合位点，对CdTeTrf与受点的结合不利。对比这两种情况，最优条件下制得的CdTeTrf荧光强度高，且体系中不含游离的Trf，不会与细胞表面受体竞争，标记效果最佳（图5B）。

单细胞生物特点范文第5篇

[关键词] 涎腺导管癌； 巨细胞瘤； 病理学； 免疫组织化学； 组织起源

[中图分类号] R 739.87 [文献标志码] B [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.024

以巨细胞瘤（giant cell tumor，GCT）为主要特征的原发性涎腺导管癌（salivary duct carcinoma，SDC）是极为罕见的相对新认识的尚未完全定义组织发生学的一种肿瘤。GCT通常与另一个唾液腺原发肿瘤（如SDC、癌肉瘤等）存在关联。无痛的、不断进展的肿块是最常见的症状。本文报道1例发生于腮腺的伴有GCT的SDC，并结合文献，探讨该肿瘤的临床特点、病理学改变及组织学起源等。

1 病例报告

患者男性，68岁，2011年5月以“发现左耳下肿物20多天”入院。大约20多天前，患者突然感觉左耳下不适，自己检查发现局部有一包块。无发热，否认牙痛，无外伤、手术史。专科检查：颜面部基本对称，左侧腮腺下极略膨隆，可扪及腮腺部一肿物，约2.0 cm×2.0 cm大小，肿块表面皮肤颜色正常，质地中等，无压痛，表面无明显分叶状，与周围组织无粘连，活动度良好；无面瘫症状；双侧髁突活动良好，张口度约二指。咬合关系良好，上颌及腭部未见异常，舌运动良好，伸舌居中；口内牙龈和黏膜颜色正常，右腮腺、双颌下腺未扪及异常，导管开口无红肿，分泌液清亮；咽部未见异常；双侧颌下及颈部淋巴结无肿大。

超声检查（图1）：左侧腮腺形态、大小如常，下极可见一个低回声肿块，大小约1.6 cm×1.0 cm，形状呈类圆形，实质回声不均匀，边界不规整，向周边组织呈浸润状，彩色多普勒血流显像（color Dop-pler flow imaging，CDFI）未见明显血流信号。诊断：

左侧腮腺实质性占位，恶性可能。其余影像学资料未见软组织及骨组织占位。

门诊以“左腮腺腺淋巴瘤”收入院。全身麻醉下行“左腮腺切除术”，术中见肿物位于腮腺下部，

结节状，大小1.8 cm×1.5 cm×1.2 cm，无包膜，界尚清，切面淡黄，实性，质中，未见明显出血、坏死（图2）。手术切除面神经总干下方腮腺组织和肿瘤，结扎腮腺残端。切除标本4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，

HE）染色，光镜下观察。免疫组织化学采用EnVision

两步法，所用一抗Pan-CK、HMWCK、CK8/18、CK5/6、CK19、CK7、EMA、AR、Her-2、GCDFP-15、P53、CD68、Vimentin、Lysozyme、PSA、ER、TTF-1、CEA、CDX2均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

术后病理组织观察：在残存、萎缩的涎腺组织中，肿瘤呈现两种不同的组织结构浸润生长，以位于中心的GCT结构为主，约占肿块的80%，表现为成片单核细胞背景中均匀地散见的多核、破骨细胞样巨细胞。巨细胞特征性地有多个位于细胞中央的圆形-卵圆形泡状核（总数2～50个，平均15个），单一小核仁清晰，胞质嗜伊红。单核细胞有类似巨细胞的圆形-卵圆形泡状核，细胞大小相近，胞质弱嗜伊红（图3左）。在肿瘤周边，表现典型SDC的侵袭性、

恶性特征。GCT和SDC之间无界限，可看到移行过渡区（图3右）。无类骨质形成。

免疫组织化学：SDC细胞弥漫而强烈地表达Pan-CK（图4）、HMWCK、CK7、CK5/6、CK8/18、CK19、

EMA、AR、Her-2、GCDFP-15、P53，单核细胞以及破骨样巨细胞均表达CD68（图5）和波形蛋白，部分单核细胞还表达Pan-CK、CK5/6、EMA、P53及局灶表达溶菌酶；破骨样巨细胞不表达上皮标志物及AR、Her-2和GCDFP-15。散在的高度异型的与巨细胞相混合或被其吞噬的单核细胞也表达上皮标志物。所有的PSA、ER、TTF-1、CEA、CDX2均为阴性。

2 讨论

2.1 临床表现和诊断

涎腺原发性GCT是极为罕见的病理类型，组织形态类似骨巨细胞瘤。1984年Eusebi等[1]报道3例腮

腺GCT，其中1例伴腮腺癌在多形性腺瘤癌（carcinoma ex pleomorphic adenoma，CXPA）中。截止目前，仅有17例涎腺GCT的报道。结合本例报道并总结文献，涎腺GCT通常与另一个唾液腺原发肿瘤存在关联，半数病例伴有癌，通常是SDC、CXPA、癌肉瘤等[2-3]。

这些病例中，15例（83%）发生在腮腺，2例（11%）发生在颌下腺，1例（6%）发生在小唾液腺[4]。患者年龄28～92岁（平均61岁），多数为男性（男女比例4∶1）。

无痛的快速进展的肿块是最常见的症状，少数病例也会缓慢生长。切除术后9个月，8例患者没有任何症状，1例颈部淋巴结转移[5]，1例死于癌播散（肺转

移）[6]。一般来说，由于SDC成分，伴有SDC的GCT相对于骨巨细胞瘤更具侵袭性。

切除标本多为涎腺内的结节状肿物，无包膜或菲薄不完整薄膜，界清，切面淡黄或灰白，质中偏软。出血、坏死多见。组织学特征：在残存、萎缩的涎腺组织中似乎有两个毗邻彼此不同的肿瘤浸润生长，两种肿瘤之间可以看到移行过渡区。一个肿瘤表现典型涎腺导管癌的侵袭性、恶性特征；另一个表现为破骨细胞样巨细胞瘤。前者主要位于肿瘤周围，有典型的腺样、筛孔状、“Roman桥”样、粉刺样坏死及实片状特征。间质见纤维化和炎症细胞浸润，可见血管和神经浸润。导管癌细胞由高核浆比的非典型上皮细胞构成，细胞异型性大，泡状核，核仁显著，含丰富粉红色颗粒状细胞质，嗜酸细胞化生常见。后者GCT成分占肿块的60%～80%，表现为成片单核细胞背景中均匀地散见的多核、破骨细胞样巨细胞。巨细胞特征性的有多个位于细胞中央的圆形-卵圆形泡状核，核染色质均匀、细腻，单一小核仁清晰，胞质嗜伊红。单核细胞有类似巨细胞的圆形-卵圆形泡状核，细胞大小相近，胞质弱嗜伊红。在邻近涎腺导管癌的移行过渡区，高度异型的单核和多核瘤细胞与巨细胞瘤相混合，部分细胞甚至被破骨细胞样巨细胞所吞噬。在部分区域，涎腺导管癌和巨细胞瘤由纤维组织分隔，另外的区域可看到似乎已融合，二者间无清晰的边界。间质血管丰富、出血、多灶性坏死。无类骨质形成。免疫组织

化学染色：SDC细胞一般强表达上皮标志物（EMA，CK系列）和AR、Her-2、GCDFP-15、P53；单核间

质细胞及破骨样巨细胞表达CD68、波形蛋白、P53、溶菌酶，部分尤其邻近SDC的单核间质细胞还表达Pan-CK、EMA等上皮标志物；破骨样巨细胞不表达GCDFP-15、AR和Her-2。散在的、高度异型的与巨细胞相混合或被其吞噬的单核细胞也表达上皮标志物。所有成分的ER、TTF-1、CEA、CDX2均为阴性，PSA一般为阴性，少数SDC阳性，这有助于排除转移性癌。涎腺GCT中的一些单核细胞对组织细胞和上皮标志物均有反应[1-8]。由于涎腺GCT多伴有各种癌性成分，诊断涎腺GCT时，所有的标本必须仔细检查，多处取材非常必要，并辅以免疫组织化学验查。

2.2 起源

过去一度认为，涎腺原发性GCT与骨巨细胞瘤同源，但最近的一项研究[7]认为，其更像是癌。近来，基于具有和骨巨细胞瘤不同的p53基因位点的杂合性

缺失和微卫星不稳定性，Tse等[7]认为涎腺GCT是与

骨巨细胞瘤无关的肿瘤实体而不是反应性病变。然而，尚不清楚这种肿瘤是否是一个不寻常的化生癌或者起源于间质或干细胞。虽然涎腺原发性GCT与骨巨细胞瘤形态上相似，但还是有一些特征可以使之区别于骨巨细胞瘤和其他骨外的巨细胞瘤。例如，涎腺肿瘤更具生物学侵袭性，多有癌性成分，在近移行过渡区可见散在的、明显的恶性上皮细胞与单核细胞成分混合，外周不见与之相关的反应性骨形成，临床及影像学检查也容易将侵入腮腺的颌骨骨巨细胞瘤排除。一些对涎腺GCT的超微结构的研究也观察到：虽然巨细胞有类似于骨破骨细胞的特征，但单核细胞有很多微绒毛和一些细胞-细胞间接合部；单核细胞细胞质局灶性表达溶菌酶，而骨或癌组织的巨细胞不表达[6]。Nagao等[8]报道1例SDC伴肉瘤样区域及GCT样组织结构，认为涎腺GCT可能是癌肉瘤。原因如下：涎腺GCT共存癌性区域非常多见；涎腺GCT的单核细胞没有明显的恶性特点，但有一定程度的核异型性；如同SDC成分一样，涎腺GCT的单核细胞表达p53，都有肿瘤特征；单核细胞除表达组织细胞外，还表达上皮标志物如Pan-CK和EMA；许多所谓的组织细胞标志物没有特异性，在非组织细胞中也表达。Tse等[7]报道SDC成分和GCT成

分具有类似的基因表型。本文病例也显示了癌和单核细胞的混合和移行过渡，涎腺GCT可能从SDC转分化而来，因此涎腺GCT可能是SDC的肉瘤样变异。

2.3 鉴别诊断

对癌肉瘤或肉瘤化癌来说，上皮和间叶细胞均异型性明显，核分裂像多见，间叶成分多表现为梭形细胞，其组织结构及形态多样，免疫组织化学分别表达上皮及间叶标志物。病史、有无外伤、手术史、无局部炎性肿痛有助于除外涎腺巨细胞肉芽肿及反应性的异物巨细胞，虽然涎腺巨细胞肉芽肿也常与肿瘤相关，但其不表达上皮标志物和p53。本文病例表达p53、Pan-CK、EMA，是肿瘤而不是巨细胞肉芽肿[2]。原发于涎腺软组织的巨细胞瘤极为罕见，通常

不伴有癌性成分（如典型SDC），而且一般不表达上皮标志物（如Pan-CK、EMA等）。涎腺未分化癌巨细胞一般为瘤巨细胞，异型性明显，核仁显著，核分裂像多，可有明显的梭形细胞成分，免疫组织化学上巨细胞和梭形细胞都表达上皮标志物。病史、组织形态及辅助免疫组织化学检查一般可有效鉴别转移性癌。

2.4 治疗和预后

手术切除是涎腺GCT主要的治疗手段，广泛彻底地切除肿瘤是提高生存率的关键，但对放、化疗方案及疗效尚无统一意见。研究[4-5，8]表明：以巨细

胞瘤为特征的涎腺癌仅有13%的病例直接死于肿瘤，死亡原因主要为远处转移。

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