单细胞动物的特征
单细胞动物的特征范文第1篇
尽管青蛙和蝴蝶具有令人惊讶的不同生命历程，但它们仅是一种形态的变化，始终都是动物体，必须从所在环境中获取食物。然而中缢虫蜓则存在着较大的差异，这种最新发现的单细胞生物兼具动物和植物的特征。
植物生命特征
中缢虫蜓是一种纤毛虫，身体上覆盖着数以百计微小“毛发（纤毛）”的单细胞动物，它是丹麦哥本哈根大学奥贾温德-莫斯特鲁普（Ojvind Moestrup）在尼瓦湾发现的，据悉，他带领的研究小组还在芬兰海域和美国罗德岛也发现中缢虫蜓样本。
纤毛虫使用它们像毛发一样的纤毛在水中快速地游动，多数通过吞食其他有机物而获得食物，而不是通过自身合成营养物质，这完全属于动物的特征。
一些中缢虫物种则完全不同，它们吞下其他微生物，通常是叫做隐滴虫藻类，两者形成一种互利关系：隐滴虫藻通过光合作用产生糖类，而中缢虫则保护并携带着它们。
像中缢虫的混合体微生物同时兼具动物和植物的特征，它们经常吞下红藻，并经常出现于赤潮出现的藻类繁殖海域。莫斯特鲁普说：“这些混合体微生物对于生物分类工作制造了麻烦，植物和动物种类之间的划分则遭到完全破坏，许多微生物曾经可能是动物或者是植物，抑或在两者之间转换。”目前，最新发现的中缢虫蜓存在另一种变换方式，它是在纯动物体和混合体之间变换。
红色和绿色
中缢虫蜓是一种海藻细胞生物，接近于中缢虫，但它并不是永久保持一种生物形态，即不是像饥饿动物那样立即消化食物，而是将猎食到的细胞生物保持数周，才进行享用。在这段时间里它们通过光合作用产生糖，中缢虫蜓还依据是否栖息于红藻、绿藻或者两者都存在的环境下而改变身体色彩。
莫斯特鲁普说：“它是完全与众不同的一种生物！”其他中缢虫物种不是捕获海藻细胞，就是将它们立即消化。
这种与其他细胞结合在一起的能力叫做“胞内共生（endosymbiosis）”，是生命进化历程中的一个最重要的突破性发展，大约20亿年前，单细胞吞下细菌，并用它作为一种能量来源。随着生物进化，后代的单细胞最终奴役细菌使其成为驱动包括人类在内所有复杂细胞的线粒体。如果没有胞内共生，它们将不会形成任何多细胞生命体。
单细胞动物的特征范文第2篇
论文摘要: 细胞凋亡又叫细胞程序性死亡，是植物正常发育中必不可少的一部分，目前已成为植物细胞生物学研究的一个热点。本文对植物凋亡的一般特征、植物营养和生殖生长中的细胞凋亡以及植物-病原物互作中的细胞凋亡进行了综合评述，并对植物细胞凋亡研究的现实意义进行了探讨。
细胞凋亡是多细胞生物体在生理或病理条件下部分细胞所采取的一种由内在基因编程调节，通过主动的生化过程而自杀死亡的方式[1 ]。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以常常又称为细胞编程性死亡。细胞凋亡的现象最早是Kree在1965年观察到的，经过进一步深入研究之后，他于1972年将其重新命名为细胞凋亡。之后近20年，细胞凋亡的研究主要集中在动物，人们越来越认识到细胞调亡在动物生长发育中、尤其在维持动物体内细胞和组织平衡、特化、形态建成和防病、抗病过程中的重要作用。同动物一样，在植物生长发育中也存在着细胞凋亡现象。但由于植物生长发育和细胞结构的特殊性，有关植物细胞凋亡的研究起步较晚。近年来，随着植物细胞凋亡的研究进展，人们逐渐认识到细胞凋亡是高等植物生长发育的必要组成部分，同时也是植物体度过不良环境的重要手段。目前，植物细胞凋亡的研究已成为近年来植物细胞生物学的新兴研究领域和热点之一。本文就植物细胞凋亡的一般特征、检测方法、在植物中的存在及意义作一综合阐述。
1 植物细胞凋亡的一般特征
经历细胞凋亡过程的细胞呈现一些典型的形态学变化，光学显微镜或电子显微镜观察可见:细胞体积缩小，染色质凝集、断裂、趋边化，细胞器解体、消失，细胞膜发泡形成凋亡小体(其中包含有凝集的细胞核断片和细胞器) [3.4]。随着研究的深入，分子生物学证据也逐步被阐明:细胞染色质DNA 在核小体连接部位断裂，其片段大小为200bp的倍数，经琼脂糖凝胶电泳可见到特征性的DNA 梯度(DNA ladder) ，此特征还可以通过超速离心、末端标记电泳以及原位缺口翻译技术等进行定性、定量测定。细胞形态学和分子生物学的变化是细胞凋亡的重要诊断依据。
2 细胞凋亡的检测方法
2. 1 细胞形态学观察法
苏木素- 伊红(HE) 染色法: 石蜡切片的HE 染色是组织形态学检测的常规方法， 光学显微镜下细胞核呈蓝黑色， 胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布， 表现在核染色质致密浓缩， 核碎裂等。
(1)电子显微镜。电镜观察，凋亡细胞染色质固缩，常聚集于核膜上呈境界分明的块状或新月形小体， 初期细胞可见完整的细胞器， 细胞膜完整， 凋亡小体形成。目前一致认为， 电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞凋亡的最可靠依据。
(2) 荧光显微镜。对体外培养的活细胞经荧光色素处理， 可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有吖啶橙、Hoech st 33258或Hoech st 33342、碘化丙啶(P I)、溴乙锭(EB)。前两种可分别进入活细胞和死细胞， 而后两种荧光素仅能进入死细胞。不同的荧光素使核着染不同颜色的荧光， 正常细胞呈均匀荧光染色， 而凋亡细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。
2. 2 反映凋亡细胞膜改变的方法：染料排斥法。
除了电镜能反映细胞膜完整性外， 还可用染料排斥法， 如台盼蓝、P I 等。坏死细胞膜破损， 被染料着染。而凋亡细胞细胞膜完整， 不被着染。但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死。因此， 此法不能单独用来判断凋亡细胞。另一种方法是判断胞质膜的不对称性。在正常细胞膜上， 磷脂酰丝氨酸基团(PS) 位于胞内侧， 而在细胞凋亡早期膜上此基团则转向胞外侧， 以利于被吞噬。因此， 磷脂酰丝氨酸基团位置的改变， 可作为凋亡细胞的一个标志。
2. 3 反映脱氧核糖核酸有规律断裂的方法
细胞凋亡过程中，DNA有规律地断裂可以通过下述几种方法检测出来。
(1) 琼脂糖凝胶电泳法。细胞悬液经裂解消化按常规法提取DNA后， 于含EB 的琼脂糖凝胶中进行电泳，正常细胞DNA呈单一条带。细胞凋亡时呈典型的梯状条带，系180～ 200 bp 左右的及多聚核小体的梯状DNA条带。坏死时则呈现模糊的弥散状条带。DNA电泳法是判断细胞凋亡的经典方法. PEG6000 诱导的小麦叶片[7] 、羟自由基诱导的烟草细胞[8] 、细胞色素c诱导的胡萝卜和烟草原生质体[9] 和乙烯诱导的胡萝卜原生质体[10]发生PCD 时均检测到DNA 梯状条带。
(2) 流式细胞仪检测法。细胞发生凋亡时， 其细胞膜的通透性增加， 但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间， 利用这一特点， 被检测细胞悬液用萤光素染色利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞萤光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
( 3 ) 原位末端标记法( In Situ End2L abeling，ISEL )。通过DNA 多聚酶I 把已标记的核苷酸结合到DNA 的单链断裂处， 以寻找有无Ap 发生。标记的方法有同位素标记、荧光素标记、地高辛或生物素标记等。
(4) 原位切口平移法( In Situ N ick T ran slat ion， IS2N T )。利用DNA 多聚酶将核苷酸整合到Ap 细胞内断裂的DNA 3′羟基末端， 同时水解5′末端，以修复DNA。若用已标记的核苷酸， 即可显示出有断裂DNA 的细胞。该法同样也可用于细胞悬液中Ap 的观察。
( 5) 末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT 2m e2diated X2dU TP n ick end labeling， TUN EL )。末端转移酶(TdT ) 介导的X2dU TP 缺口标记法是目标原位检测Ap 最为敏感、快速、特异的方法， 其具有广泛的应用前景。末端转移酶(TdT ) 可催化在DNA 片段的3′羟基末端合成多核苷酸聚合物的反应， 即DNA 片段加尾。利用末端转移酶(TdT ) 将标记的脱氧核苷酸转移到DNA 缺口或3′羟基末端上， 通常所用的核苷酸为dU TP， 标记物为地戈辛、生物素、荧光素等。
(6) EL ISA 法。对Ap 细胞内DNA 片段的检测还可用EL ISA 法。悬浮细胞经裂解， 高速离心去除核的成分后， 取上清加入已包被有抗组蛋白抗体的反应板， 反应后再加酶标抗DNA 抗体， 若上清中含断裂的DNA片段， 则可通过此双抗体夹心法得以检出[11]。
3 植物发育过程中的细胞凋亡
萌发的种子中的糊粉层、维管束的木质部、生殖器官的组织(如花药和子房)及根冠等组织中均有细胞凋亡的发生[12]。虽然在细胞水平上， 与细胞凋亡相关联的水解酶的激活、一些蛋白的失活以及核DNA的断裂都可以经常观察到， 但是这些现象的发生机制到近来才有所了解。
3.1 导管的形成
导管是由排列有序的死亡的导管分子(tracheary elements， TEs)构成。王雅清和崔克明[ 13 ]对杜仲木质部导管分化的研究证明，其分化过程也发生了细胞凋亡。所有这些研究都表明木质部导管分化与细胞凋亡有密切关系。玉米生长过程中在一定条件下根部皮层细胞崩溃死亡形成通气组织， 而通气组织与植物的同化、呼吸、蒸腾作用都有密切关系[14 ].
3.2 单性花的形成
许多单性花植物在花原基分化时存在雌蕊和雄蕊原基细胞，在后期发育的特定阶段雌蕊或雄蕊原基细胞出现细胞凋亡，从而最终形成单性花。
3.3 大、小孢子的形成和发育
大多数种子植物中， 大孢子母细胞减数分裂形成4 个大孢子。仅有1 个能发育成雌配子体， 其余的3个大孢子退化。例如， 蕨类植物大孢子母细胞减数分裂产生4个大孢子， 这4个大孢子通常呈线型或T型排列， 仅有1个能继续发育成雌配子体， 其余3个都死亡。对其超微结构的研究表明，其退化解体过程也符合细胞凋亡的基本特征[15] 。
3．3 雌雄配子体的发育
植物中雌雄配子体的发育有细胞凋亡参与其中。裸子植物雄配子体发育过程中， 原叶细胞的退化和雌配子中颈细胞、腹沟细胞的消失及珠心细胞的衰退也是细胞凋亡的结果。在被子植物雌配子体(胚囊)发育过程中，珠心组织被作为营养物质吸收而退化的过程是细胞凋亡[16].
3．4 胚的发育
在胚性细胞分化和发育过程中，存在着细胞凋亡[17]。植物的胚由受精卵发育而成， 在胚的形成过程中，助细胞、反足细胞和胚柄细胞都因发生细胞凋亡而消失。胚柄由受精卵第一次分裂形成，当胚发育到一定阶段，胚柄发生细胞凋亡， 形态上表现为质壁分离， 原生质体固缩。单子叶植物的种子中， 在胚和胚乳之间有一层或几层排列整齐的糊粉层细胞， 含大量糊粉粒。胚胎发育早期由胚柄提供营养形成种子， 后期则通过糊粉层细胞形成分泌组织， 分泌水解酶， 水解胚乳成分， 种子萌发后， 糊粉层功能完成， 便开始凋亡，是典型的细胞凋亡。在种子萌发过程中，其他胚乳和无胚乳种子子叶中一些贮藏细胞也会发生类似的细胞凋亡， 没有这些细胞凋亡，幼苗就不能正常生长发育， 会因饥饿而死亡。
3.5 根冠细胞的死亡
根冠位于根尖的顶部，是由许多薄壁细胞组成的冠状结构。在根的发育过程中，根冠细胞不断脱落，并由顶端分生组织不断产生新的细胞，从内侧补充使根冠细胞得以保持定数。对根冠细胞脱落的研究证明，其脱落过程是典型的细胞凋亡。正是这些细胞的主动死亡，才保证了根顶端分生组织在生长过程中避免与土壤磨擦而受伤，进而保证了根的正常发育。对玉米根尖进行低温胁迫或用细胞毒素类药物如放线菌D、秋水仙碱处理后，这些根尖分生组织细胞同样具有DNA ladder、染色质和细胞核浓缩等特征，说明环境因子和药物也可诱导根尖细胞发生凋亡[19.20] 。
3. 6 叶发育过程中的细胞凋亡
在叶子的发育过程中，叶缘的各种裂、齿和叶片中的空洞(如龟背竹叶片) 的形成等都是由于相关部位细胞的凋亡所造成的。此外，对叶片衰老过程的研究发现，衰老起始时，叶绿体首先被自体吞噬，此后水解酶、RNA 酶等活性上升，而且以液泡内半胱氨酸蛋白酶活性最为显著[21 ] ，这些都是细胞凋亡的特征。因此，叶子脱落前叶片的衰老过程也是PCD。
4 环境胁迫诱导的植物PCD
4. 1 植物超敏反应中的PCD
超敏反应(hypersensitive response HR) 是植物被病原物侵染后所引起的适应性反应，其中的细胞死亡被证明是细胞凋亡。在植物超敏反应中，DNA 片段化，特征性切割核小体的核酸酶被激活等生理生化特征和凋亡小体等形态特征都被证实。 转贴于
4. 2 盐胁迫诱导的PCD
无机盐KCN、NaCl 、CaCl2 和一些重金属离子等在一定条件下均可诱导植物细胞出现与动物细胞凋亡类似的特征。宁顺斌[22]等人的实验证明烟草、玉米的根尖在高盐(NaCl 500mmol/ L)处理后，出现明显的DNA 梯状电泳图谱。林久生和王根轩[23]用20%PEG溶液(-0.63 MPa)对小麦根系进行渗透胁迫，在小麦叶片DNA琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到明显的梯状DNA 条带，表明PEG处理诱发了DNA核小体间的断裂，末端脱氧核糖核酸转移酶介导的3’OH末端标记法(TUNEL)检测出现阳性结果。
4. 3 活性氧与植物细胞凋亡
活性氧是一类具有强氧化能力的物质，主要包括超氧化物、过氧化氢、羟自由基等，各种逆境条件，包括冷害、渗透胁迫、低氧、臭氧、紫外线等导致的植物细胞凋亡最终都与活性氧的产生有关。当细胞外一些信息如辐射、高温等通过细胞活性氧传入细胞引起其脂质过氧化或与细胞凋亡有关基因的表达时，细胞也会凋亡[24]。陈明等[25]研究发现以一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)处理小麦可以明显提高ROS 清除酶，如过氧化物酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶等活性，从而清除因盐胁迫产生的氧自由基或活性氧ROS，或直接清除ROS来保持细胞处于还原状态。
5 研究植物细胞凋亡的意义及展望
导管细胞的退化死亡、筛管细胞原生质的自溶，形成了植物体的输导组织;这些细胞死亡之前，细胞内物质可被其他细胞回收利用，这是植物能够独立营养的一个特性，叶片衰老死亡即是适应营养重新分配的结果，但这个过程却影响了农产品的产量。因此，要搞清植物细胞凋亡的发生程序，对粮食生产及作物储藏技术改良都具有重要的现实意义。在超敏反应中，被病原体感染的宿主细胞采取主动死亡的方式，从而限制感染部位病原菌的生长，阻止病原菌的传播，以达到防病抗病的目的。这种植物自身的主动抗病反应，若在植物抗病育种中加以应用，使植物能够自动、有效地抵抗病原物的侵染，就可以减少农药的使用，避免环境污染，从而提高人类生活质量。
由于植物细胞凋亡的同步性很低、凋亡时间很短，同时由于细胞内各种因子相互作用，调控机制及其复杂，使分子生物学技术应用于细胞水平的研究存在很大困难。近年来，利用非细胞体系来研究细胞凋亡的模式的建立和应用弥补了上述不足。有研究表明[26]，利用非细胞体系研究细胞内复杂的生化活动具有独特的优越性，在细胞周期调控、DNA 复制、核小体与染色质构建等研究中发挥了重要作用。非细胞凋亡体系的建立与利用，在很大程度上促进了人们对植物细胞凋亡生化和分子机制的研究，为植物细胞凋亡研究开辟了新途径。
随着植物细胞凋亡的研究的逐步深入，发现植物细胞凋亡需要研究的方面还很多。植物体发生细胞凋亡的机理还不清楚，植物细胞中与细胞凋亡有关的基因研究还远没有动物深入。尽管许多实验表明植物细胞凋亡与动物是相似的，但分子水平共同特征少，目前仅发现少数几个基因参与植物细胞凋亡的过程[27] 。研究过程中常局限于某一特定现象，很少有将这些现象和植物发育的具体过程联系起来，加上植物生长周期较长，给研究带来一定困难。植物细胞凋亡的研究如果能与植物的经济利用联系起来，将具有重要实践价值。如能发现诱导果实发育中细胞凋亡发生的因子，通过人为调控，改变生长发育期，提高果品产量和品质，则将会极大地推动果树现代化生产的发展。
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单细胞动物的特征范文第3篇
关键词：白细胞分类计数；临床意义
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）06-0116-01
白细胞分类计数是把血液制成薄血涂片，按照形态特征分类计数白细胞，得出相对比值（百分率），以观察数量、形态和质量的变化，对疾病有辅助诊断意义[1]。
1标本来源
均为我院门诊患者及健康体检者50例，其男27例，女23例，年龄最小4岁，最大63岁。
2 计数方法
2.1手工法白细胞分类计数
2.1.1标本采集 可使用毛细血管采血法所取的样本或静脉血EDTA・K2抗凝样本。
2.1.2试剂 瑞氏染液。
2.1.3操作 将血液滴加在洁净的玻片上，用推片将其推成薄血涂片。自然干燥后用蜡笔在血涂片两头划线以防染液溢出，然后将血涂片平放在染色架上。加瑞氏染液于血涂片上，使之覆盖整个血涂片，固定0.5～1min。滴加等量的缓冲液与染液混匀，染色5～10min。用清水冲去染液，待自然干燥后或用吸水纸吸干即可镜检。
2.1.4参考值 中性粒细胞，杆状核0.01～0.05（1%～5%）分叶核0.50～0.70（50%～70%）。嗜酸性粒细胞0.005～0.05（0.5%～5%）。嗜碱性粒细胞0～0.01（0%～1%）。淋巴细胞0.20～0.40（20%～40%）。单核细胞0.03～0.08（3%～8%）。
2.2血细胞仪三分群法白细胞分类计数
2.2.1标本采集 静脉血EDTA・K2抗凝样本1～2ml。
2.2.2试剂操作 根据仪器不同使用其配套试剂。按仪器操作说明书进行操作。
2.2.3参考值 仪器的报告方式为小细胞、中间细胞及大细胞。小-细胞代表淋巴细胞，中间细胞包括单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胸及在病理情况下出现的原始及幼稚细胞，大细胞代表中性分叶核以及杆状核和晚幼粒细胞[2]。小细胞群（1.0～3.3）×109/L。中间细胞群（0.2～0.，7）×109/L。大细胞群 （1.8～6.4）×109/L。
2.3血细胞仪五分类法白细胞分类计数
2.3.1标本采集 静脉血EDTA・K2抗凝样本1～2ml。
2.3.2试剂方法 根据仪器不同使用其配套试剂。操作按仪器操作说明书进行操作。
2.3.3参考值 五分类法白细胞分类计数的报告方式同手工法，有淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞，故参考范围如手工法白细胞分类。虽然仪器法白细胞五分类采用了多种技术来保证结果的准确性，但由于仪器是依靠细胞的各种物理化学特性来进行细胞分类，与手工方法利用细胞的形态学特征进行分类不同，故在各种病理情况下准确性不如手工方法。手工方法仍然是白细胞分类计数的金标准。
3 白细胞分类计数的意义
3.1中性粒细胞 具有吞噬和激活补体功能，能吞噬细菌和组织细胞碎片，激活的补体成分（C3a、C5a、C567）具有粒细胞趋化作用。
3.1.1增多 ①反应性增多 见于：a.感染，细菌、病毒、真菌、螺旋体、立克次体、寄生虫，特别是化脓性细菌全身性或严重局部感染如败血症、肺炎、脑膜炎、阑尾炎、急性肾盂炎或肾盂肾炎、丹毒、蜂窝组织炎等。b.炎症，化学性如腐蚀性或刺激性化学品损伤、急性胰腺炎、化学性腹膜炎；免疫性如风湿热、类风湿性关节炎、结节性动脉周围炎、脉管炎等。c.急性中毒，化学品或药物中毒，自身代谢性中毒如尿毒症、酮症酸中毒或乳酸性酸中毒。d.急性失血，尤以内脏出血如肝、脾、宫外孕破裂出血；1～2小时开始升高，2～5小时达高峰。e.组织损伤或坏死，如心、肺、肾、脑等脏器梗死，肌肉挫伤、大手术后。f.排异反应。g.恶性肿瘤，尤其合并感染、坏死或骨髓转移时。②肿瘤性增多 见于骨髓增生性疾病如白血病特别是慢性粒细胞白血病、骨髓纤维化、原发性血小板增多症。
3.1.2减少 ①感染 某些病毒或杆菌感染如流感、伤寒、副伤寒、布鲁菌病，机体反应性降低时的严重感染。②造血功能障碍 缺乏造血组织如再生障碍性贫血、缺乏造血原料如巨幼细胞性贫血。③骨髓病 非白血性白血病、恶性组织细胞病、肿瘤骨转移、苯中毒、辐射损伤。④破坏过多 自身抗体如免疫性粒细胞减少症、脾功能亢进症等。⑤药物 多种抗肿瘤药物、氯霉素、头孢菌素、磺胺类、奎诺酮类、万古霉素、磺脲类、氨基比林、非那西汀、保太松、硫氧嘧啶和甲巯咪唑类、氯丙嗪、奎宁等药物使用。⑥特发性粒细胞减少症、Felty综合征。
3.2嗜酸性粒细胞 与过敏反应密切相关，受嗜酸细胞趋化因子调节，吞噬免疫复合物和异体蛋白。
3.2.1增多 ①变态反应性疾病，如支气管哮喘、血管神经性水肿、血清病、荨麻疹、药物过敏反应。②寄生虫病，尤其是肠道外感染如华支睾吸虫、血吸虫、肺吸虫、丝虫、包囊虫病。③某些皮肤病，如湿疹、剥脱性皮炎、天疱疮、银屑病等。④肿瘤性疾病，如肿瘤转移坏死时、肺癌、恶性淋巴瘤、慢性粒细胞白血病、真性红细胞增多症[3]。⑤内分泌疾病，如垂体前叶功能减退症、肾上腺皮质功能减退症。⑥酸细胞浸润性疾病，如嗜酸细胞增多综合征、伴有肺浸润的嗜酸细胞增多症如L0f. fler综合征、嗜酸细胞性肺炎、热带嗜酸细胞增多症以及嗜酸细胞性心内膜炎、嗜酸细胞性肉芽肿等。⑦某些感染性疾病，如猩红热、传染病恢复期。⑧某些结缔组织病，如皮肌炎、结节性动脉周围炎。
3.2.2减少 见于急性严重感染如伤寒、肺炎、败血症，各种急性应激如创伤、大手术后，皮质醇增多症或皮质激素治疗，巨幼细胞性贫血等。
3.3嗜碱性粒细胞 表面有IgE的Fc受体，与IgE结合即被致敏，再受相应抗原攻击时发生颗粒释放反应，颗粒含有组胺、慢反应物、肝素、嗜酸细胞趋化因子、血小板活化因子。
3.3.1增多 见于骨髓增殖性疾病如慢性粒细胞白血病、骨髓纤维化，也见于慢性溶血、脾切除术后、淋巴瘤、骨髓转移癌、铅中毒、过敏反应。
3.3.2减少 未见有临床意义。
3.4淋巴细胞 免疫细胞，合成和释放淋巴因子，参与细胞免疫和体液免疫。
3.4.1增多 ①生理性增多，6岁前儿童期伴随免疫功能成熟过程。②感染，病毒感染如麻疹、风疹、水痘、流行性腮腺炎、传染性单核细胞增多症、传染性淋巴细胞增多症、病毒性肝炎、流行性出血热等；细菌感染如百日咳、结核病、布鲁菌病；螺旋体感染如梅毒。病毒感染可见胞体大、核不规则、胞浆丰富或泡沫样的异型淋巴细胞。异型淋巴细胞增多有时也见于药物过敏、血液透析或体外循环。③急性传染病恢复期。④自身免疫性疾病、器官移植排异反应前。⑤淋巴细胞白血病、淋巴瘤。
3.4.2减少 主要见于皮质醇或烷化剂治疗，辐射损伤、免疫缺陷综合征、先天性免疫球蛋白缺乏症。
3.5单核细胞 吞噬细胞，具有吞噬细菌、清除坏死细胞和异物、向T细胞传递免疫信息功能。
3.5.1增多 ①病毒、立克次体感染，如麻疹、水痘、风疹、传染性单核细胞增多症、病毒性肝炎、斑疹伤寒。②慢性细菌、螺旋体或寄生虫感染，如结核病、麻风病、亚急性细菌性心内膜炎（SBE）、梅毒、疟疾、黑热病等。③急性传染病或急性感染恢复期。④恶性淋巴瘤、恶性组织细胞病、单核细胞白血病。
3.5.2减少 未见有临床意义。
参考文献
[1] 叶应妩，王毓三，申子瑜，主编.全国临床检验操作规程.第3版.武汉：东南大学出版社，2006：132-133，137-138.
单细胞动物的特征范文第4篇
【摘要】 目的：探讨成人外周血来源的内皮祖细胞（epc）与成熟血管内皮细胞在抗原表达、细胞形态、增殖潜能和体内外血管生成方面的异同点. 方法 ：密度梯度离心法获得单个核细胞，用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中. 细胞在接种后每2 h去除1次未黏附细胞共2次，然后隔日换液1次，直到晚期克隆出现. 同期培养人脐静脉内皮细胞（huvec）进行比较. 流式细胞技术检测细胞表面抗原表达，直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化低密度脂蛋白. 体外培养细胞的群体倍增次数确定细胞增殖潜能，胶原凝胶细胞体外种植及裸鼠体内移植实验分别测定体外及体内血管生成功能. 结果： epc在培养21~28 d出现，表现出典型的内皮细胞“铺路石”外貌. 与huvec相比，epc表达高水平的cd36和kdr（epc vs huvec, p<0.01），但表达cd146，结合植物凝集素和摄取乙酰化低密度脂蛋白在两种细胞间未存在统计学差异. 体外培养100 d，epc和huvec分别传代46次和25次，只有epc能在体外和裸鼠体内胶原凝胶中形成管腔样结构. 结论：人外周血来源的epc虽然具备成熟内皮细胞的表型和形态特点，但仍保留干/祖细胞的完整生物学特征.
【关键词】 血管生成；内皮细胞；祖细胞；生物学性状
0引言
内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, epcs）原始储存部位在骨髓，受缺血信号刺激后向外周血释放，募集到缺血部位参与血管新生. 但另有 研究 却发现， epcs在肿瘤血管新生、受损血管内皮修复、或成年动物体内血管再生方面，所起作用很小或几乎不起作用［1-3］. 我们研究首先确认外周血循环中是否存在有真正的epcs，然后将其与成熟内皮细胞进行完整生物学性状对比 分析 .
1材料和方法
1.1材料histopaque，1.077,fitc标记的植物凝集素（ulex europaeus agglutinin1, uea1）、纤连蛋白（fibronectin）、fitc标记的抗vegf2受体（kdr）、i型胶原均为sigma公司产品；添加各种生长因子和胎牛血清的内皮细胞完全培养基（egm2 mv single quots）和i型胶原酶为becton dickinson公司产品；dii标记的乙酰化低密度脂蛋白（diiacldl）购自abd serotec公司；vwf一抗和fitc标记二抗均购自dako公司；pecd34， fitccd14，fitccd146，均为bd公司产品. 健康志愿者11（男9，女2）例，年龄46.5±13.1岁，肘静脉取血每例50 ml，肝素（20 ku/l）抗凝. hanks 1∶1稀释血液，加入histopaque经密度梯度离心法获得单个核细胞（mononuclear cells, mnc）. 用hanks洗涤mncs 3次，重悬于egm2，调整细胞计数2×109/l，接种于100 mg/l纤连蛋白包被的24孔培养板中. 另在无菌条件下取正常剖腹产健康新生儿脐带20~30 cm，pbs冲洗脐静脉腔， i型胶原酶灌注，37℃水浴消化15min. 收集消化液、离心、洗涤，egm2调整细胞计数2×109/l，接种于纤连蛋白包被的培养瓶中，取2~3代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, huvec）用于实验.
1.2方法根据单核细胞在体外培养时具有短期松散附壁的特点， 应用 序列黏附法去除淋巴细胞的混杂. 每例血样在分离出mnc并接种后每隔2 h去除1次未黏附细胞，共2次，然后加入egm2静止培养，4 d后换液. 此后隔天换液1次，直至典型的内皮细胞克隆出现，然后消化传代，取2~3代细胞进行实验.
1.2.1表面抗原表达的测定贴壁细胞用pbs洗涤2次，2.5 g/l胰酶/edta消化后制成细胞悬液，密度为1×109/l. 每份细胞悬液取150 μl×2分装2个试管，分别加入fiticd14，fitccd146，fitckdr，pecd34及同型对照mab各20 μl，避光反应30 min，pbs洗涤2次测定，每例均以流式细胞术复测3次. 上机后收集20 000个细胞，荧光强度以对数放大，结果以各种抗原表达阳性百分率表示.
1.2.2内皮细胞vwf的表达贴壁细胞生长至80%汇合时用1∶1甲醇/丙酮固定，vwf一抗及fitc标记的二抗均作1∶50稀释，严格按说明步骤进行.
1.2.3细胞增殖潜能的测定epc及原代huvec生长至亚汇合状态时分别消化，制成稀释的细胞悬液，密度均为2×107/l，传代接种于25 ml培养瓶中. 然后按此方法对这两种细胞分别持续传代，直至细胞衰老. 每传代细胞1次，记数为1次群体倍增. 以培养时间为横坐标，群体倍增次数为纵坐标，绘制细胞群体倍增曲线图.
1.2.4体外血管形成实验用冷藏的egm2配置浓度为2 g/l的i型胶原溶液，100 g/l碳酸氢钠滴定溶液ph值7.4~7.6，加入96孔板中每孔100 μl，37℃放置30 min使其成胶. 分别将2~3代贴壁的epc和huvec制成细胞悬液，加入凝胶之上每孔5×104个细胞，置培养箱内孵育，不同时间点倒置显微镜下观察血管生成情况.
1.2.5体内血管生成实验无胸腺裸鼠22只，7~11 wk，购自郑州大学实验动物中心. 收集epcs和huvecs，制成浓度为2×109/l的细胞悬液. 用1.5 g/l的碳酸氢钠、25 mol/l hepes, 100 ml/l胎牛血清、300 ml/l egm2制备浓度为3 g/l的胶原溶液. 将等量的细胞悬液与胶原溶液混合，每只裸鼠后肢sc细胞胶原溶液1 ml. 将裸鼠置于饲养笼28℃条件下30~60 min，触摸裸鼠移植部位皮丘呈胶冻感为移植成功，然后常规条件饲养. 21~30 d处死裸鼠，取出移植体行病理切片分析.
统计学处理：采用spss 11.0统计软件进行分析. 计量数据以x±s表示，两组均数间的比较采用t检验，以p<0.05为有统计学差异.
2结果
mnc接种后7~11 d可见有簇状聚集的早期克隆出现，中间是圆形细胞，周边有向外爬行生长的梭状或多角形细胞（图1a）. 持续培养至21~28 d可观察到晚期克隆的出现，细胞均呈多角形或纺锤形，紧密贴壁，聚集向外生长（图1b）. 至35~42 d，可见细胞增殖、逐渐汇合成片，呈现内皮细胞典型的“铺路石”外貌（图1c,d）. huvec接种当时为圆形、悬浮，24 h后细胞即伸展、贴壁，呈梭形或多角形（图2a），5~7 d后贴壁细胞基本汇合成单层，外观与epc来源细胞相同（图2b,c）.
2.1epcs与huvecs表型特征对比huvec相比，epc表达高水平的干/祖细胞标记cd34和kdr（p<0.01，图3）. 单核细胞特异抗原cd14在两组细胞表面仅有微量表达，而泛内皮细胞标记cd146在两组细胞均为高表达但无统计学差异. vwf鉴定两组细胞均阳性证实为内皮细胞起源.a：第7日形成早期克隆 ×40；b：第22日形成晚期克隆 ×40；c：第37日晚期克隆增殖汇合；d：晚期克隆再种植形成单层内皮细胞，呈典型铺路石样外观 ×100.
图1epc体外培养细胞形态
a：种植后24 h伸展贴壁 ×40；b：6 d后增殖汇合 ×40；c：第二代huvecs呈铺路石外观 ×100.
图2huvecs体外培养形态特点
2.2epcs及huvecs体外增殖潜能对比epc传代接种后经历1~2 d潜伏适应期，然后增殖旺盛，每3~4 d传代1次. 在100 d时间内，epc传代46次，曲线陡直上升（图4）. 此后传代时间渐延长，曲线由水平转为下降趋势. huvec传代周期为5~7 d，曲线缓慢平坦上升，表明细胞增殖潜能低于epc. 在68 d时间内、同等培养条件下huvec共传代21次，然后曲线迅速下降，提示细胞开始衰老. 在相同的100 d时间内，huvec总计传代25次.
图3epc与huvec表达抗原阳性百分率比较（x±s, n=33, bp<0.01 vs huvec）
图4epc huvecs体外培养群体倍增曲线
2.3胶原凝胶体外血管生成贴壁的epc和huvec分别消化再种植于i型胶原凝胶上，36 h后可见epc伸展呈纺锤状，并相互连接形成管腔样结构（图5a），72 h后可见原管腔增大，管壁可见有细胞向管腔中央呈发芽状生长（图5b）. 持续观察huvec未见形成管腔样结构，至1 wk后仅见细胞呈圆形或多角形融合成片（图5c）.
a：epcs种植36 h形成管腔结构；b：72 h后管腔扩大，并见管壁细胞向腔内呈发芽状生长；c：huvecs种植不能形成管腔结构.
图5胶原凝胶体外血管生成×100
2.4裸鼠体内血管生成裸鼠22只细胞移植均获成功（epc和huvec组各11只），饲养期间未发现裸鼠有异常反应. 移植体病理切片he染色显示，epc组11只裸鼠中有8只在胶原凝胶移植体中观察到了典型的微血管结构，并与小鼠组织构成了人鼠嵌合血管，其间可见小鼠的血细胞流动（图6a）. 而huvec组仅在1只裸鼠的移植体中观察到了类似微血管样结构（图6b），其余10只裸鼠移植体中均显示出不规则的细胞聚集现象，未观察到血管结构（图6c）.
a：epc组细胞移植形成典型血管结构，管腔中可见小鼠血细胞；b：huvec组细胞移植仅1例形成不典型管腔；c：其余huvec组细胞移植均不能形成管腔结构，仅有不规则细胞聚集）.
图6细胞移植裸鼠体内血管生成he ×200
3讨论
本 研究 结果显示，成人外周血循环中的单个核细胞在体外内皮培养条件下，于不同时间段内可形成早期和晚期克隆. yoder等［4］研究表明，这种早期克隆属于单核巨噬细胞系列，再种植不能分化成内皮细胞，因而还不属于真正的epc. 在早期克隆出现后持续培养，直至获得具有内皮细胞形态特征的晚期克隆后，才显现出干/祖细胞和内皮细胞双重生物学特征. 因此，这种晚期克隆及其分化产生的近代细胞，应属于真正的epc. 本研究显示，epc体外再种植培养可呈现典型“铺路石”外观，与huvec形态相同. 两种细胞表达vwf，结合植物凝集素及吞噬乙酰化低密度脂蛋白均为阳性，不表达单核细胞标记cd14而高表达泛内皮细胞标志cd146，提示二者均为内皮细胞来源.与huvec相比，epc表达更高水平的cd34和kdr. 由于cd34是多数干/祖细胞的共有标志，而kdr的高表达预示着细胞对血管内皮生长因子更敏感，增殖力和血管生成能力更强［5］. 由此可见，我们所获得的晚期克隆来源细胞除了具备成熟内皮细胞的全部表型外，还显现出非成熟细胞（即干/祖细胞）的特征.
本研究显示，在同等培养条件下，晚期克隆来源的epc增殖速度快、传代周期短，在100 d时间内传代近50次而无明显衰老征象. 相反，huvec虽然在6代以内的生长方式和细胞形态接近epc，但传代周期进行性延长，在2 mo的时间内只能传代21次即迅速衰老，说明自我复制能力低下，也符合一般成熟细胞的特点. 本研究显示，将晚期克隆来源细胞种植于胶原凝胶中，可生成典型的管腔样结构，而huvec种植后只出现细胞聚集，无典型管腔形成，说明前者具备干/祖细胞和内皮细胞的双重特征. 晚期克隆细胞能够在动物体内增殖并形成血管，因而具有epc完整的生物学特征. 鉴于冠心病患者外周血循环中出现的内皮细胞是自血管壁脱落的衰老细胞，与huvecs相比在体外更不易存活和增殖［6］. 因此有理由相信，我们所获得的晚期克隆细胞属于纯化的epcs，未被成熟血管内皮细胞混杂.
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单细胞动物的特征范文第5篇
【关键词】 永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体
Establishment and biological characterization of an immortalized human fetal hepatocyte line
【Abstract】 AIM: To establish an immortalized human fetal hepatocyte line and to study its biological characteristics and functions. METHODS: Human fetal hepatocytes were transfected with pcDNA3.1 recombined vector containing the Simian Virus 40 large T antigen. Characteristics of the immortalized fetal hepatocyte line were evaluated by morphologic and functional detection. RESULTS: One of the hepatocyte clones displaying highly differentiated in liver function and immortalized characteristics had been screened after 40 day selection of 700-300 mg/L G418. The immortalized hepatocyte line maintained the most morphologic characteristics of primary hepatocyte. The cell cloneforming rat was 31.2%. The immortalized human fetal hepatocytes had a normal karyotype and were not able to grow in soft agar culture. It had the ability of composing albumin and the immunohistochemical test showed that the SV40T gene had been integrated into the transformed cell genome. CONCLUSION: The immortalized human fetal hepatocyte line has the similar most morphologic characteristics and biological function to primary hepatocytes， and it would become ideal cell material on the study of bioartificial liver and hepatocyte transplantation.
【Keywords】 immortalized; hepatocytes; cell line; characterization; SV40; liposomes
【摘要】 目的: 构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究. 方法： 利用SV40T基因和真核表达载体pcDNA3.1经脂质体转染至体外分离培养的人胚胎肝细胞，使其永生化，进一步鉴定其形态学特征和生物学功能. 结果： 经G418 700～300 mg/L筛选，40 d后获得一株阳性克隆. 形态学观察发现，该细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征. 永生化胚胎肝细胞克隆形成率为31.2%，染色体核型分析表明细胞核型无明显异常，软琼脂集落形成试验表明细胞在软琼脂中不能生长，免疫组化证明SV40T基因已整合入细胞，而且该细胞具有合成白蛋白的功能. 结论： 新建胚胎肝细胞系具有与原代肝细胞类似的形态特征及生物学功能，可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料.
【关键词】 永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体
【中图号】 R512.6
0引言
原位肝移植可以有效治疗各种原因引起的肝功能衰竭，因而成为治疗肝功能衰竭的唯一有效手段. 但由于受到技术复杂、价格昂贵尤其是供肝短缺的困扰，使它的临床应用受到很大限制，难以及时有效地挽救患者的生命. 研究显示生物人工肝及肝细胞移植可以作为一种有效的替代治疗手段，帮助患者渡过危险期等待肝移植甚至直接取得令人满意的疗效，因而为肝衰竭的治疗提供了一种新的选择［1-5］. 而该项技术的应用需要足够数量肝细胞材料，动物肝细胞或者各种肝细胞系由于存在病毒感染及潜在的致瘤危险，无法成为理想的选择. 从理论上讲人源性肝细胞应该是最佳材料，但原代细胞体外培养增殖及传代困难，而且来源同样受到很大限制，为此我们采用脂质体转染的方法，构建了一株永生化胚胎肝细胞系，并对其生物学特性进行研究，希望可以为生物人工肝及肝细胞移植的临床开展提供理想而充足的细胞材料.
1材料和方法
1.1材料含有SV40 Large T抗原片段的质粒pcD2由北京大学人民医院妇科肿瘤中心刘广芝教授惠赠，真核表达质粒pcDNA3.1由本校微生物教研室保存. 14～28 wk水囊引产死胎由本院妇产科提供，DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司；DMSO及秋水仙素为Sigma公司产品；抗SV40T单克隆抗体购自USBio公司；人血白蛋白单克隆抗体购自DAKO公司，质粒提取试剂盒为Promega产品.
1.2方法
1.2.1重组质粒的构建及鉴定提取含SV40LargeT的pcD2质粒，限制性内切酶BamHⅠ单酶切，10 g/L琼脂糖电泳. 回收含目的DNA片段的凝胶，纯化后用T4 DNA连接酶与pcDNA3.1空载体进行连接. 制备感受态细胞并提取重组质粒. 用限制性内切酶BamHⅠ进行酶切，10 g/L琼脂糖电泳鉴定.
1.2.2胚胎肝细胞的分离培养及转染取引产死胎儿置无菌托盘中，常规消毒铺单后打开腹腔，显露游离门静脉后插管，用DHanks液（含0.01 g/L EDTA，37℃，pH 7.4，通以含950 mL/L O2及50 mL/L CO2的混和气体）以20 mL/min的速度灌入，随后于下腔静脉插管放出积血积液，并剪开胸腔，夹闭上腔静脉. 灌注5 min至肝脏变色后改为含0.05 g/L胶原酶的Hanks液（37℃，pH 7.4，通以含950 mL/L O2，50 mL/L CO2的混合气体）持续灌注5 min. 取下肝脏，置于含4℃ Hanks液的平皿中，剪开肝被膜，疏下肝细胞，以单层无菌纱布过滤，制成混合细胞悬液，以100目及200目筛网过滤，500 r/min清洗离心3次，每次2 min，弃上清，以4℃ Hanks液重悬，台盼蓝（Trypan Blue）染色判断细胞活率，肝细胞活率>90％时，计数制成肝细胞悬液，以终浓度1×105/mL接种于培养瓶内，选择低糖DMEM培养基，其中含15 mL/L胎牛血清、10 nmol/L胰岛素，培养48 h后采用脂质体转染法将重组质粒SV40T/pcDNA3.1转染至胎肝细胞. 用含700 mg/L G418的培养液筛选1 wk，将G418浓度改为300 mg/L，至出现阳性克隆，将其转移至新培养瓶进行扩大、传代培养.
1.2.3细胞形态的观察在倒置显微镜下观察新建肝细胞系的形态，并在电子显微镜下观察细胞的超微结构.
1.2.4细胞生长曲线的测定细胞消化后制成悬液，以103浓度接种于96孔板内，37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养，每天取8孔加入MTT溶液20 μL/孔， 37℃继续孵育4 h，终止培养吸去上清，加入150 μL DMSO，振荡10 min，在酶联免疫检测仪上选择490 nm波长，测定光吸收值取平均值，连续测定12 d. 以时间为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制细胞生长曲线.
1.2.5细胞克隆形成率肝细胞以1个细胞/孔的密度接种于96孔板，连续培养15 d，在倒置显微镜下观察含有50个以上细胞的细胞克隆数，按下列公式计算细胞克隆形成率：克隆形成率（%）＝（克隆数/接种细胞数）×100%.
1.2.6软琼脂试验肝细胞预先制成细胞悬液，在60 mm培养皿中预先铺上含12 g/L琼脂的培养基，将细胞以1×105/皿浓度与37℃预温的含6 g/L琼脂的培养基混匀后，接种于平皿内底层琼脂培养基上，连续培养20 d后观察克隆形成数.
1.2.7染色体检查取对数生长期的肝细胞加入终浓度为0.5 mg/L的秋水仙碱，继续作用4 h，收集分裂中期细胞，离心去上清，加入0.075 mol KCl低渗处理20 min，最后经甲醇冰乙酸固定，制片，Giemsa染色后，在油镜下观察染色体形态.
1.2.8免疫组织化学方法检测整合的SV40T基因及ALB在细胞中的表达新建胎肝细胞系常规爬片，PBS清洗，4℃丙酮固定，30 mL/L H2O2处理，血清封闭，分别滴加人血清白蛋白单克隆抗体及SV40T单克隆抗体，孵育60 min，然后滴加HRP标记的二抗，孵育60 min，苏木精复染. 脱水、透明、封片、镜检.
2结果
2.1重组质粒的鉴定重新构建的质粒SV40T/pcDNA3.1经BamHⅠ单酶切，酶切产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳，获得大小约2600 bp及5600 bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段大小（图1）.
图1重组质粒酶切鉴定（略）
2.2胚胎肝细胞的培养及转染原代胚胎肝细胞经分离纯化，细胞存活率达91%. 体外培养48 h后，可见80%贴壁，经脂质体转染SV40T/pcDNA3.1重组质粒，G418筛选40 d后出现一簇抗G418的阳性克隆. 将其转移至新培养瓶内继续培养.
2.3细胞形态观察胚胎肝细胞在培养瓶中呈单层贴壁生长，细胞呈椭圆形、典型的上皮细胞样特征，传代一次约需5 d时间（图2A）. 透射电镜观察，细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞核仁增大，胞内含丰富的糖原颗粒，细胞极性恢复可见紧密连接和毛细胆管重建（图2B）.
图2胚胎肝细胞形态结构（略）
2.4细胞生长曲线根据MTT数据绘制的生长曲线显示，细胞在培养第4日进入对数生长期，第7日进入平台期，第12日后开始出现凋亡（图3）.
图3胚胎肝细胞生长曲线（略）
2.5细胞克隆形成率及软琼脂集落形成试验细胞连续培养15 d，形成非常明显的克隆，克隆形成率为31.2%. 而在软琼脂培养基内，细胞连续生长20 d，未见有细胞克隆形成，说明该永生化肝细胞不能在软琼脂培养基内生长.
2.6染色体核型分析第16，28，45代肝细胞各计数30个分裂相，均为正常二倍体细胞，染色体为23对，核型结构与正常人肝细胞相同（图4）.
图4染色体核型分析（略）
2.7免疫组织化学检测结果以抗SV40T单克隆抗体作一抗，免疫组化检测可见肝细胞核内的棕色颗粒，证实SV40T基因已整合入胚胎肝细胞（图5A）. 另外该永生化胚胎肝细胞具备合成白蛋白的能力，免疫组化检测可见胞浆内有棕色颗粒着色（图5B）.
图5免疫组织化学染色（略）
3讨论
近年来在重型肝炎的治疗方面已得到共识，即生物人工肝及肝细胞移植可以作为原位肝移植的有效替代治疗手段治疗肝功能衰竭，而且取得了一定的临床治疗效果. 然而由于供肝短缺和原代肝细胞体外培养增殖困难，使得肝细胞材料的相关研究成为关注的热点. 人们曾尝试采用异种肝细胞或各种肝细胞系如C3A，HepG2来解决这一问题［6-9］，常用的猪肝细胞应用最为广泛，效果也可靠，但异种肝细胞可引起强烈的免疫排斥反应，而且由此带来的人畜共患疾病的感染无法避免［10］. 采用C3A， HepG2的生物人工肝在动物实验及部分临床试验中已取得肯定的结果，可是细胞系的来源为肿瘤细胞，研究显示它的细胞色素P450酶活性、氨清除和尿素合成功能均较差，加之用于处于免疫抑制状态的重型肝炎患者，潜在致瘤的风险始终令人担忧［11-12］.
我们利用真核表达载体pcDNA3.1，将猿猴病毒40大T抗原基因通过脂质体转染至体外培养的原代胚胎肝细胞，经G418筛选40 d后获得一阳性细胞克隆. 生长曲线观察结果表明，该细胞具有永生化细胞系典型的“S”特征，细胞生长的每一阶段特征明显. 光学显微镜下观察，细胞呈典型的上皮细胞样贴壁生长，细胞增殖较快；透射电镜观察发现，细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞核仁增大，胞内含丰富的糖原颗粒，细胞极性恢复可见紧密连接和毛细胆管形成. 表明转染肝细胞在形态结构上与原代细胞无明显差异. 此外，我们构建的永生化胚胎肝细胞系的克隆形成能力较强，在软琼脂培养基中不能生长，而且核型组成与正常肝细胞相同，说明该细胞没有发生恶性转化. 经免疫组织化学检测，转染肝细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明SV40T抗原已整合入胚胎肝细胞内，另外人血白蛋白在细胞胞浆中有明确表达，说明该细胞系具备分泌蛋白的能力，具有正常肝细胞的某些功能.
本研究结果表明，利用SV40T抗原，采用脂质体转染方法建立的这株永生化胚胎肝细胞系，具备了原代肝细胞的典型形态特征以及某些生物学功能，为肝细胞体外长期培养以及功能维持提供了可能，应该可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料，从而为生物人工肝及肝细胞移植临床的广泛应用奠定更加坚实的基础.
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