骨髓纤维化范文第1篇

【关键词】强的松；干扰素；原发性骨髓纤维化原发性骨髓纤维化(PMF)是由于造血干细胞的克隆性紊乱导致骨髓基质反应性增生而损伤骨髓造血功能, 以骨髓纤维化、髓外化生为特点的疾病［1］。目前, 原发性骨髓纤维化尚无可靠有效的治愈方法, 其预后差异较大, 中位生存期(MS)2~10年［2］。常用的治疗方法有沙利度胺、糖皮质激素、干扰素、雄激素、羟基脲及造血干细胞移植等。作者选用沙利度胺联合强的松及沙利度胺联合干扰素治疗该病, 观察其疗效。

1资料与方法

1. 1一般资料选取2010年1月~2013年11月本院门诊和住院患者共58例(男22例, 女36例), 中位年龄61岁, 诊断依据张之南主编《血液病诊断及疗效标准》, 经外周血象及细胞形态分析、骨髓细胞学形态、骨髓活检病理、JAK-2基因、BCR/ABL基因排查、染色体检查确诊, 未经治疗病例。

1. 2治疗分组依据血象特点分组, 把白细胞或血小板计数高于正常范围者分入干扰素组, 把白细胞和血小板计数低于正常范围者分入强的松组。干扰素组共37例, 应用干扰素α-2b(300万单位, 皮下注射, 3次/周), 沙利度胺(100~200 mg/d, 睡前口服)。强的松组共21例, 强的松0.5 mg/(kg・d), 沙利度胺(100~200 mg/d, 睡前口服)。两组治疗时间为1个月。

1. 3疗效评价治疗1个月时依据血象评价疗效, 符合以下两种及以上情况认为有效：①白细胞数恢复正常。②血红蛋白≥80 g/L。③血小板高者降至正常范围, 血小板低者不依赖血小板输注。

2结果

2. 1干扰素组37例患者中有8例患者3项指标均达标, 15例患者2项达标(60 g/L≤血红蛋白

2. 2强的松组21例患者中有5例患者3项均达标, 3例患者血红蛋白未达标, 1例患者白细胞计数未达标, 总有效率43%。JAK-2突变基因阳性者有3例, 均治疗有效。

3讨论

原发性骨髓纤维化是BCR/ABL融合基因阴性的骨髓增殖性疾病中发病率低但预后差的类型, 发生率约0.5/10万, 中位生存时间较短［3］。主要治疗方案有造血干细胞移植、雄激素、糖皮质激素、促红细胞生成素、沙利度胺、干扰素、羟基脲及试验性药物等。但由于原发性骨髓纤维化主要发生在老年人群, 中位诊断年龄为65岁［4］, 因此可供选择的治疗方法有限。

沙利度胺是一种血管抑制剂, 通过抑制血管内皮细胞生长和碱性纤维母细胞生长因子的活性抑制血管新生［5］。Mesa等［6］研究显示沙利度胺联合糖皮质激素治疗PMF, 总有效率为62%。干扰素α可抑制纤维形成生长因子如PDGF和TGF-β的产生和释放, 对PMF治疗有效。Silver等［7］研究317例低中危的PMF患者, 给予干扰素α-2b治疗, 总反应率达80%。作者将初诊的PMF患者依据外周血白细胞、血小板计数高低分为两组, 计数高者应用干扰素α-2b联合沙利度胺治疗, 计数低者应用强的松联合沙利度胺治疗, 获得了相对理想的数据, 观察到了可喜的治疗反应。

Mesa等［6］和Weinkove等［8］应用沙利度胺(50 mg/d)联合强的松治疗均取得了良好的治疗效果。作者的研究显示应用沙利度胺(100~200 mg/d)联合强的松治疗, 有效率为43%, 略低于国外研究结果, 考虑作者选择入组的病例多为中、高危患者, 治疗效果相应下降；其次, 若将雄激素或EPO加入该治疗方案, 可能使贫血的改善率提高, 从而提高该方案的总体疗效。从作者所在地区的患者发病年龄、经济承受能力及治疗顺应性出发, 该治疗方案仍可作为PMF的一线治疗方案, 尤其是针对诊断时已有两系或三系血细胞减少的患者, 同时可选择加用雄激素或EPO治疗, 可能使更多患者受益。

List等［9］用干扰素α-2b治疗PMF患者, 结果显示：患者血中原始细胞减少, 骨髓检查纤维化消退, 网硬蛋白减少。刘利等［10］应用沙利度胺联合干扰素α-2b治疗PMF9例患者, 获得较好的近期疗效。作者的研究显示在37例应用沙利度胺和干扰素α-2b患者中, 其总有效率达62%, 因此认为沙利度胺和干扰素α-2b联合治疗PMF有效。但Stein等［11］认为干扰素α对高增殖的PMF是一个有效的药物, 但对严重贫血或血小板减少患者疗效有限。在作者的研究中, 沙利度胺联合干扰素α-2b治疗主要用于白细胞和血小板升高的患者, 这与上述研究也是一致的, 且该类患者以中低危为主, 故治疗效果要高于强的松组。因此不能认为哪一种治疗方案更好, 应根据不同的病情特点选用相应的治疗方案。

在作者的研究中发现, JAK-2突变基因阳性在干扰素组发生率为62%, 在强的松组发生率为14%, 治疗总体有效率为69%。这些数据显示JAK-2突变基因在处于增值阶段的PMF中较为常见, 且两种治疗方案的有效率均较高, 考虑位于该阶段患者多为低、中危患者, 治疗效果较好, 这为作者评价治疗效果提供了依据。

作者的研究结果显示, 沙利度胺与强的松联合或者沙利度胺与干扰素联合治疗PMF均为可行有效的治疗方法, 但年轻患者也应根据病情特点选择更为强效甚至是治愈的方法, 且随着科技的发展, 新药的问世, 期待有更多有效的治疗方法进入临床。

参考文献

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骨髓纤维化范文第2篇

【关键词】 电纺纤维;聚己内酯;骨髓基质细胞

0引言

理想的组织工程支架材料要求其不但能够作为种子细胞体内扩增和增殖的支架，而且应当能够成为生长因子、生物活性物质和基因的生物载体，发挥细胞功能调节的作用［1］. 目前已有近百种聚合物成功的通过这一技术获取了超细纤维并被陆续应用于膜技术、增强材料、纺织品、光学传感器、医药释放体系以及组织工程支架材料制备等诸多领域 ［2］. 本研究旨在通过聚己内酯（polycaprolactone, PCL）电纺纤维支架材料对兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）生长、增殖和功能分化作用的研究，初步探讨PCL电纺纤维作为组织工程支架材料的应用前景.

1材料和方法

1．1材料聚己内酯（PCL，美国Sigma公司，Mn=80000）；二甲基甲酰胺（DMF，西安化学试剂公司）；氯仿（西安化学试剂公司）；BGG40/2高压直流电源(北京机电研究所，0?30KV)；JSM?6700F型扫描电镜(日本JEOL公司)；BX60型荧光显微镜(日本 Olympus公司)；酶联免疫检测仪（美国Bio?Tek公司）；1.5 mo龄新西兰幼兔1只，雄性，体质量1.5 kg (第四军医大学实验动物中心)；DMEM培养液（美国Gibco BRL公司）；胎牛血清（浙江金华清湖犊牛利用研究所）；胰蛋白酶（上海浦东生化试剂厂）；MTT（美国Sigma公司）；Pholloidin?FITC（美国Sigma公司）；碱性磷酸酶(alkaline Phosphatase，ALP)检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）.

1.2方法

1.2.1PCL电纺纤维支架的制备以氯仿/DMF（体积比2∶1）的混合溶液为溶剂，配制浓度为80 g/L的PCL电纺丝溶液. 将电纺丝溶液加入一个安装有8号不锈钢注射针头的自制玻璃加样管. 针头即喷丝口与BGG40/2高压直流电源的正极相连，针头下方安装一个接地的铜板，上覆铝箔作为纤维的接收屏与高压直流电源的负极相连. 在外加电压10 kV，接收距离12 cm，电纺丝溶液流量为3 mL/h的条件下进行静电纺丝. 收集接收屏表面获得的纵横交错的无纺纤维毡，置于干燥器中干燥保存.

1.2.2兔BMSCs的原代培养与接种取新西兰幼兔四肢长骨，纵行剖开，DMEM培养液冲洗骨髓腔，静置后取上清进行培养BMSCs. 24 h后换液，去除未贴壁的血细胞. 每3 d换液1次，2.5 g/L胰酶常规消化传代，倒置显微镜下观察. 取第二代生长良好的BMSCs，胰酶消化传代. 实验分组为PCL电纺纤维实验组和细胞培养板对照组两组. 将传代培养的第二代BMSCs以4×104/cm2浓度接种于各组，每孔加入500 μL接种细胞液，置入细胞培养箱4 h，再加入500 μL培养液，50 mL/L CO2, 饱和湿度、37℃继续培养.

1.2.3肌动蛋白actin直接免疫荧光染色培养8 h后取出PCL电纺纤维试件，PBS冲洗3遍. 37 mL/L甲醛的PBS溶液固定5 min, PBS洗涤2遍. 丙酮脱水，1 mL/L TritonX?100渗透5 min. 10 mg/L Pholloidin?FITC 37℃孵育染色40 min，抗荧光淬灭液封片. 于365 nm荧光显微镜下观察记录.

1.2.4扫描电镜观察于培养3 d后取出PCL电纺纤维试件，PBS冲洗3遍，25 mL/L戊二醛固定24 h. 乙腈梯度脱水，10 g/L锇酸处理1 h，临界点干燥，离子溅射仪喷金. 导电胶固定，以冷场发射扫描电子显微镜观察，电子加速率为5 kV.

1.2.5MTT检测于培养1，3，5，7 d后向实验各组分别加入2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，然后加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM终止消化. 500 g离心10 min，每管重新加入DMEM培养液200 μL，接种至96孔培养板. 每组4孔，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h. 在酶联免疫检测仪上测各孔A490 nm值，每组3个试件.

1.2.6ALP活性检测培养的第3，7, 14日后，向实验各组分别加入2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，然后加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM终止消化. 将每个样本的细胞悬液加入离心管，500 g离心10 min. 每管加入200 μL细胞裂解液，充分吹打混合. 转移至96孔培养板，加入0.1 mL/L Triton X?100 50 μL，4℃过夜. 采用ALP检测试剂盒，每孔加入ALP反应底物100 μL，37℃孵育30 min. 0.2 mol/L NaOH 50 μL终止反应，在酶联免疫检测仪上测各孔A410 nm值，每组3个试件.

统计学处理：数据以x±s表示，采用统计学软件SPSS 10.0进行方差分析.

2结果

2.1形态学观察接种8 h后BMSCs在PCL电纺纤维材料表面的actin直接免疫荧光染色, BMSCs细胞以梭形和长方形为主，边缘有弧度，胞质丰满、伪足伸展充分. 细胞胞质内含大量束状排列的微丝结构，向两端伸展，排列有序. 核周围染色加深，呈圆形或卵圆形的细胞核(图1). 扫描电镜下示BMSCs伸展更加充分，生长连接成片. BMSCs下可见PCL电纺纤维呈相互交联的多孔网状无纺结构，纤维交错相叠、光滑均一、结构疏松、孔隙结构密集，纤维直径在153～612 nm之间(图2).

2.2MTT检测经方差分析，PCL电纺纤维实验组与对照组的A490 nm值均随共培养时间的增加而增大(表1)，7 d>5 d>3 d>1 d，各检测时间点之间有显著性差异(P<0.05)；而在1，3，5,7 d各检测时间点，两组吸光度之间无显著差异(P>0.05).表1聚己内酯电纺纤维支架对骨髓基质细胞增殖的影响(略)

2.3ALP活性检测经方差分析，PCL电纺纤维实验组与对照组的吸光度A值均随共培养时间的增加而增大(表2)，14 d>7 d>3 d，各检测时间点之间有显著性差异(P<0.05)；而在3，7,14 d各检测时间点,两组吸光度之间无显著差异(P>0.05).表2聚己内酯电纺纤维支架对骨髓基质细胞ALP活性的影响(略)

3讨论

种子细胞与支架材料是组织工程研究的两个核心问题. 骨髓来源的BMSCs具有多向转化的潜能，通过生长因子的诱导，可以分化为成骨细胞，在骨组织的修复、改建以及愈合过程中发挥重要的作用，是目前最为合适的骨组织工程种子细胞［3］. PCL是由ε?己内酯开环聚合所得到的线性脂肪族聚酯，具有良好的热稳定性、生物降解性、力学性能、药物通过性以及生物相容性. 其降解产物对人体无毒，目前也广泛的应用于骨折固定材料、手术缝线、医用敷料、药物控释和组织工程支架材料等领域［4-5］. 利用静电纺丝技术制备组织工程支架材料的优势在于：能够制备出比表面积大、孔径小、孔隙率高、纤维均一性好，直径与细胞外基质内胶原纤维相近的连续超细纤维（50～500 nm），从而最大程度的模仿细胞外基质天然结构；制备方法简单快捷，支架材料可以是单一的聚合物，也可以是多种聚合物的复合体，并可以在支架中引人无机粒子(如羟基磷灰石等)、生长因子甚至活细胞等; 通过选择适当的材料和加工参数，能够调控支架材料的孔隙率、厚度、三维结构、降解率和力学性能；利用同轴电纺技术还能够将生物活性分子加入到聚合物支架中，实现有效释放［5-7］.

实验中所制备的PCL电纺纤维大体外观光滑均一，纤维直径为153～612 nm，为纳米级多孔无纺纤维. 其相互交错的多孔结构与天然细胞外基质的胶原纤维结构近似，有利于细胞的粘附、铺展和增殖. 细胞内肌动蛋白actin 的结构在维持细胞形状及附着方面起着非常重要的作用，actin染色通常用来研究细胞在材料表面的移动、伸展及形态. Actin直接免疫荧光染色结果显示BMSCs能够在PCL电纺纤维表面形成早期附着. 扫描电镜观察进一步表明生长在PCL电纺纤维材料表面的BMSCs不但可以早期贴附与材料表面，并且能够在短时间内形成良好的铺展形态. MTT比色法试验能够检测细胞存活和生长. 我们的结果表明BMSCs能够在PCL电纺纤维表面正常的存活和增殖，并且同对照组一样具有较旺盛的增殖能力，生物相容性良好. ALP是成骨细胞分化和功能成熟的早期标志，在成骨细胞趋向成熟的转化限制点扮演重要角色. 测定成骨细胞内ALP活性的变化可以了解成骨细胞的分化成熟程度以及细胞成骨矿化的能力. 我们的结果表明随着时间的增加PCL电纺纤维表面的BMSCs同对照组一样，持续的保持着成熟分化功能，表达出完善的成骨活性.

【参考文献】

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［5］李冀, 张育敏, 王志强. 骨组织工程支架材料合成技术的进展［J］. 中华创伤骨科杂志,2006,8(8):773-776.

骨髓纤维化范文第3篇

【关键词】 全血细胞减少;骨髓活检塑料包埋技术

全血细胞减少症是临床很多疾病的共有表现，确诊及鉴别诊断主要依据骨髓细胞形态学检查， 但由于多种因素影响， 骨髓细胞形态学有时难以提供令人满意的结果。采用骨髓活检可弥补骨髓涂片检查的不足，也不受骨髓穿刺取材可能稀释及推片技术等因素的影响，能真实地反映骨髓造血组织结构、细胞分布等情况，为疾病的正确诊断提供可靠的依据。本文对20例经骨髓涂片分析确诊有困难的全血细胞减少症患者进行了骨髓活组织病理检查及临床分析，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 20例患者均为我院血液科住院病例，男12 例，女8 例，年龄14～70 岁，中位年龄34 岁。因全血细胞减少随诊(Hb、WBC、PLT 分别< 100g/L、4.0×109/L、80 ×109/L 者视为全血细胞减少[1]) 1～6 个月，所有患者多次骨髓涂片提示骨髓增生活跃、减低或“干抽”，诊断未明，为确定诊断同时做骨髓活检。

1.2 方法 选常规骨髓穿刺部位(髂前上棘或髂后上棘)，用骨髓活检针取骨髓组织长约1cm，Bouin 液固定1h，梯度乙醇脱水，采用HemaPun865塑料包埋，切片3μm 行HGF(苏木素-姬木萨-品红)染色 、5μm 行Gomori 网硬蛋白纤维染色，显微镜下观察[2]。根据活检组织切片中造血组织与脂肪组织面积的大致比例，将骨髓增生程度分为5级，造血细胞占81%～100%为极度活跃，61%～80%为较活跃，41%～60%为增生正常，20%～40%增生较低下，

2 结果

20例患者经骨髓活检塑料包埋切片确诊19例，其中符合骨髓增生异常综合征(MDS)15例，占75 %，慢性再生障碍性贫血、急性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓纤维化各1 例，诊断未明1例。15例MDS 病例的骨髓塑料包埋切片内均有不同程度的组织学异常，骨髓内幼稚细胞增多，3～5个聚集成簇或灶状分布，出现粒细胞前体细胞异常定位(ALIP);可见单圆核或小圆核巨核细胞; Gomori 网状纤维银浸染色均为+～++，诊断MDS伴轻～中度的纤维组织增生。3 例骨髓抽吸困难或干抽的病例骨髓活检结果为:1例骨髓切片浆细胞明显增生伴纤维组织中度增生，造成骨髓涂片取材困难，诊断多发性骨髓瘤并骨髓纤维化;1例骨髓纤维组织中度以上增生，诊断原发性骨髓纤维化;1例外周血WBC 25×109/L，分类可见幼稚细胞，因白血病细胞的塞实造成骨髓抽吸困难，骨髓活检提示前体细胞占据整个骨髓腔伴轻度纤维组织增生，诊断急性粒细胞白血病。另1例慢性再生障碍性贫血因病程长(10年) ，骨髓活检为提示增生减低，粒、红、巨核系三系细胞增生减少，Gomori 网状纤维银浸染色为阴性，仍维持慢性再生障碍性贫血的诊断。1 例诊断不明确的患者多次骨髓涂片提示增生骨髓象，骨髓活检无明显异常发现，此患者还在继续随访中。

3 讨论

全血细胞减少症可由多种疾病引起，临床最常见的疾病为再生障碍性贫血、MDS、急性白血病等。骨髓细胞形态学检查具有细胞形态好、易于各种细胞辨认等特点，是对全血细胞减少病例进行鉴别诊断的主要依据。但少数病例的骨髓由于受血液稀释、细胞密度过大、骨髓基质对细胞的黏附力、推片的力度等方面的影响，以及某些疾病的诊断需要对骨髓的组织结构进行观察时，骨髓涂片则不能真实反映骨髓组织及细胞的情况，需要进一步做骨髓活检。

骨髓活检通过活检针取一小块完整的骨髓组织， 采用Bouin 液固定， 梯度酒精脱水，切片裱片，对骨髓组织脱水、不脱钙，行HGF 染色使切片清晰度高，骨髓细胞皱缩小，变形小，色彩鲜明，便于辨认粒、红、巨核、淋巴、单核各系统细胞及观察骨小梁、小梁间区细胞分布等。

将骨髓涂片和骨髓活检二者密切配合、相互补充，对临床诊断有很大帮助。在未开展骨髓活检检查前，全血细胞减少症病例被诊断为再生障碍性贫血的比例远远高于MDS。有部分慢性再生障碍性贫血也可出现一些病态造血现象：包括有核红细胞巨幼样变、双核红细胞、多嗜性红细胞、点彩红细胞、Howell-J ally 小体等;粒系统核浆发育不平衡;巨核系见单圆核小巨核细胞、多圆核巨核细胞;但未见巨大红细胞、红细胞多极分裂且为奇数核等[2-3]。在临床工作中，对于诊断慢性再生障碍性贫血病程长、治疗效果不理想的患者，在随诊中复查骨髓涂片的同时做骨髓组织活检，能避免涂片中的弊端，反映骨髓组织的结构和细胞分布，具有重要的临床意义。骨髓组织塑料包埋切片技术的开展，将更易对慢性再生障碍性贫血和MDS (尤其低增生MDS)进行鉴别。在MDS 患者的骨髓内均可见不同程度的骨髓正常结构被破坏和细胞的异位：(1) 主要分布于小梁旁区的不同发育阶段的粒系细胞向小梁间中央区移动; (2) 幼红细胞岛和巨核系细胞常由正常的小梁间区和中央区移向小梁旁区或骨小梁表面; (3)在小梁间区和旁区见3～5 个原始和早幼粒细胞常聚集成簇，即称幼稚前体细胞异常定位(abnormal localization of immature Precursors， ALIP)，这是MDS的组织学特征[2-5];(4)间质的改变：约半数患者切片示轻度或中度纤维组织增生，10%～15%合并显著骨髓纤维化。再障骨髓活检无ALIP结构、Gomori染色无网状纤维增多现象[4]。

本组20 例患者经多次骨髓涂片均未明确诊断，经对症治疗效果不佳，是临床的疑难病例，经骨髓组织塑料包埋检查多数患者确定了临床诊断，证实骨髓活检弥补了骨髓涂片的不足，提高了临床诊断的准确性，是正确诊断各种血液系统疾病的一个重要的辅助检查手段。另外，本组患者中符合MDS 病理改变的有15 例，占75 % ，也提示骨髓活检在MDS 和再生障碍性贫血的鉴别诊断上有重要的临床价值。

骨髓纤维化是骨髓涂片不能解决的问题，需要靠骨髓组织活检技术来完成。通过骨髓组织切片的Gomori 网状纤维银浸染色能显示骨髓内网状纤维的增生情况。正常骨髓活组织切片内可见少量纤细的网状纤维，是构成造血诱导微环境的主要成份之一。文献报道[2]50%以上的MDS 患者骨髓切片内伴轻至中度纤维组织增生，11 %～15 %伴显著纤维化，MDS 的纤维组织增生可能与病态巨核细胞生成以及血小板衍生性细胞因子有关。本组15 例MDS 患者均有骨髓轻至中度的纤维组织增生，较文献比例高，可能与病例数较少有关，但也能说明骨髓纤维组织增生在MDS 是较为常见的。2例骨髓纤维组织中度以上增生的患者，最后分别确诊为原发性骨髓纤维化和多发性骨髓瘤伴骨髓纤维化。少数急性白血病患者因白血病细胞的紧密塞实和伴骨髓纤维化，导致骨髓不易抽吸，靠骨髓涂片明确诊断是困难的。本组1 例患者出现类似表现，经骨髓活检确诊为急性白血病伴骨髓纤维化。

多发性骨髓瘤患者的骨髓基质细胞产生的大量黏附分子，增强了恶性浆细胞间的相互粘连，造成部分病例的骨髓不易吸出，骨髓涂片不能明确诊断，在这部分病例骨髓活检具有重要意义，同时对有无骨髓纤维组织增生也能明确[2]。

参考文献

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骨髓纤维化范文第4篇

[摘要]目的:电镜下观察面中份缝牵引成骨术不同时期狗眶下神经组织学结构的改变,探讨面中份缝牵引成骨术对眶下神经的影响。方法:选12周杂种犬13只为实验对象,实验组12只,随机分入牵引5、10、15天,固定15、30天与恢复期6组,每组各2只,用特制牵引器进行前牵引;对照组1只,未配戴牵引器。取各实验组和对照组双侧眶下神经,制成透射电镜切片,电镜下观察不同时期的神经组织形态。结果:随着牵引的进行,面中份骨明显前移,眶下神经出现明显病理变化,牵引结束时神经损伤最严重;固定期神经出现修复性变化,去除牵引架2月后神经组织结构基本恢复正常。结论:面中份缝牵引成骨术在使面中份骨明显前移的同时,对眶下神经可产生一定的损伤,但这种损伤是暂时的、可逆的,通过神经自身的适应、修复和再生,随着时间的延长,神经的形态结构可恢复正常。

[关键词]电镜;缝牵引成骨术;眶下神经;组织学结构

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)01-0056-03

Influence of midface suture distraction osteogenesison dog infraorbital nerve observed under electronic microscope

JIN Zeng-qiang1,DONG Zhong-sheng2,MA Xiao1,LIU Chun-ming3

(1.Department of Stomatology,the 307th Hospital of PLA,Beijing 100853,China;2.Zhengzhou Railway Occupational and Technological Institute,Zhengzhou 450052,Henan,China; 3.Department of Stomatology,The General Hospital of PLA,Beijing 100100,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the histological structure changes of the dogs infraorbital nervesunder electronic microscope at different time after midface suture distraction, and to investigate the influence of suture distraction on infraorbital nerve.MethodsThe animal model was established with thirteen 12-week mongrel dogs, which were randomly divided into the experimental group and the control. Rigid external distractor was used in experimental dogs for midfacial skeleton protraction. Distraction protocol included 15 days distraction and 20 days consolidation. The force used for midfacial protraction was 800 gram. The experimental animals were sacrificed at different time points postoperatively. Bilateral infraorbital nerves were obtained from the experimental and the control dogs, made thin section, and observed under electronic microscope.ResultsThe midfacial skeleton moved forward obviously in experimental dogs. Pathological changes were observed in the infraorbital nerves in experimental dogs. At the end of distraction, the changes of the infraorbital nerves became more obvious. During the period of consolidation, the infraorbital nerves began to recover. Two months after the removel of the rigid external distractor, the nerves were observed as normal.ConclusionAlong with the midficial skeleton advancement by sutural distraction, deleterious changes appeared in the infraorbital nerves, but it is temporary and reversible.

Key words:electronic microscope;suture distraction osteogenesis; infraorbital nerve; histological structure

面中份发育不全是颅颌面外科常见的发育畸形,常常会给患者带来一系列的生理与心理问题,降低他们的生活质量。目前,传统面中份发育不全的治疗方法主要为患者成年后采用正颌手术或者切骨牵引两大类。这两种方法都属于大型、复杂和高难度的手术,对患者创伤很大。国内学者柳春明在国际上首次提出缝牵引成骨的概念[1],报道了经缝牵引早期治疗面中部发育不全的临床经验[2]。近年来,对经缝牵引前移上颌的研究正在增多[3-4]。以往的研究多集中于骨骼组织结构方面,而对面中份骨骼连带的周围组织研究较少。眶下神经由上颌神经发出,在骨性眶下裂中穿行;它在面中份骨前牵引的同时是否会受到牵拉,是否会影响它们的形态结构,影响程度多大,能否恢复,本实验组的前期实验已经在光镜下观察了该神经的大体病理变化[5],但尚未观察该神经超微结构的变化。故本实验仍以犬为实验动物,观察上颌前牵引不同时期狗眶下神经超微结构的改变,探讨其对眶下神经影响。

1材料和方法

1.1 牵引器的设计、制作与牵引方法、手术方法见前期实验[5]。

1.2动物的选择、分组:选12周龄健康雌性反牙合京叭犬18只为研究对象(由解放军总医院动物实验室提供),牙列整齐无缺牙,体重2.5～2.7kg。实验组12只,随机分入牵引5、10、15天,固定10、20天与去固定2月6组,每组各2只,用外牵引装置进行前牵引,后3组均牵引满15天。对照组6只,未配戴牵引器。

1.3 取材及电镜切片制备

1.3.1 取材:牵引第5、10、15天,固定第10、20天,去除牵引架后2月处死各组实验犬,对照犬最后也处死。用眼科剪去除双侧眼球,仔细分离出眶下裂中的眶下神经,在眶下孔近心端截取约长约2.0cm的神经。由于透射电镜对样品表面的要求非常严格,本实验是观察神经的横切面。所以取材及用生理盐水清洗标本时,注意保护神经观察面不受任何损伤,且保持干净,将神经横断面作为观察面进行标记,防止制作过程中分不清观察面所在的位置。 注意取神经标本时取材动作要快,一般要求在 2～3 min之内将组织浸入固定液内。 取材的器械、固定液要事先放在冰箱内预冷。

1.3.2 前固定:清洗的神经标本在清洗完毕后即刻投入2.5% 戊二醛固定液内进行固定。

1.3.3 漂洗:用0.1M磷酸缓冲液漂洗3次,每次15min。

1.3.4 后固定:1%锇酸固定液室温下固定1h左右。

1.3.5 脱水:利用不同浓度乙醇梯度脱水,由50%、70%、80%、90%、95%各15min,换醋酸异戊酯15min。

1.3.6 干燥:采用冷冻干燥法进行切片干燥。

1.3.7 镀膜:利用真空喷镀仪对神经标本观察表面进行镀膜,用金钯作为镀膜材料。

1.3.8 电镜下观察神经样本。

2结果

2.1大体观察同前期实验[5]。

2.2眶下神经电镜下各期形态结构变化

2.2.1 对照组:可见轴膜光滑、完整,轴浆中含有大量神经微管、微丝,以及少量小泡样结构,轴突内各成分排列有序、均匀。雪旺细胞胞核圆,界限清楚,胞质均匀、淡染,胞浆内可见散在线粒体、高尔基器及核蛋白体。在无髓神经纤维其胞浆直接包绕神经轴突,有髓神经纤维则由其胞质膜层层环绕轴突周围生成髓鞘。髓鞘层板明暗相间,层板间无分离,内层光滑连续,与轴膜以髓鞘内系膜相连,外层以外系膜与Schwann 细胞相连,横断面上呈同心圆环状。神经纤维间可见大量胶原纤维排列整齐,密度均匀,未见成纤维细胞及吞噬细胞(图1)。

2.2.2 牵引第5天:可见部分有髓神经纤维髓鞘板层分离,其间有水肿液和崩解的碎片,部分髓鞘发生折叠起皱,轴索膜与髓鞘板层的最内侧分离,轴索与髓鞘之间出现空间,神经膜细胞部分发生变性,胞质中细胞器增多,其内可见崩解的髓鞘碎片;另外病变髓鞘周围可见吞噬细胞出现。间质中胶原纤维排列较紊乱(图2、3)。

1.2.3 牵引第10天:可见镜下所有有髓神经纤维髓鞘板层分离,轴索膜与髓鞘板层的最内侧分离,神经膜细胞胞质中细胞器增多,其内可见崩解的髓鞘碎片;但无髓神经纤维未见明显改变(图4)。

2.2.4 牵引第15天:可见髓鞘全层松散、破裂,轴索结构模糊,有髓神经纤维呈无均质状。神经膜细胞出现明显凹陷,胞浆内可见大量髓鞘残片及空泡,线粒体、高尔基器及粗面内质网和核蛋白体数量明显增多。细有髓神经纤维和无髓神经纤维病变较轻,粗有髓神经纤维变性明显。间质中可见巨噬细胞,部分区域胶原纤维排列较密集而紊乱(图5)。

2.2.5 固定第10天:可见有髓神经纤维出现明显的修复性变化,脱髓鞘变神经纤维开始重新髓鞘化,髓鞘结构部分恢复,但所有髓鞘板层仍处于松解、破裂状态,髓鞘内可见明显的髓球形成。神经膜细胞增生,巨噬细胞功能活跃,胞质内含吞噬的髓鞘残片及大量溶酶体和细胞器(图6)。

2.2.6 固定第20天:神经纤维变性仍较明显,较固定第10天时有明显减轻,部分有髓神经纤维存在脱髓鞘变,但有小部分神经纤维髓鞘已经有所恢复,神经膜细胞仍处于增生状态,间质中胶原纤维排列仍处于紊乱状态(图7)。

2.2.7去除牵引架2月:有髓神经纤维除少量髓鞘仍可见髓球及髓鞘松散现象外,大部分已经恢复正常,神经束膜细胞形态基本恢复正常,间质中胶原纤维排列无明显紊乱,细有髓神经纤维和无髓神经纤维恢复正常(图8)。

3讨论

面中份缝牵引是矫正颅颌面畸形的一种新技术,它是利用外来的机械牵张力牵拉正处于发育期的上颌复合体的骨缝组织,诱发上颌缝,诸如腭横缝、前颌缝、颧颌缝、颧颞缝、翼上颌缝的扩张分离与新骨的形成,使上颌复合体前移,从而来矫正面中部发育不足[6]。目前,随着这种技术的逐步推广应用,其本身存在的一些问题也开始引起人们的重视,如其是否会对上颌骨周围的组织器官如眶下神经、腭大神经、颞下颌关节、口颌系统的形态和功能产生不良影响,目前尚未有明确和统一的认识。

本实验首先在以往研究[3-4]的基础上,对其原用的牵引犬面中份骨的牵引装置进行了改进:外牵引装置材料由锻造铁丝改为铝合金,牵引钩改为牵引杆,把经鼻腭孔牵引改为克氏针穿颊牵引。这样,无论是牵引装置的稳固性,还是牵引方向的可控性,都较先前有了很大提高。然后通过动态观察牵引期3个时间段、固定期2个时间段以及去固定2月后眶下神经在电镜下形态结构的变化,了解面中份缝牵引成骨对眶下神经的影响。

目前许多研究表明,机械牵拉力对神经会造成明显损伤,神经对损伤的敏感性与其解剖位置及其对牵拉的耐受力,与牵引距离、牵引速度有密切关系。Ross[7]认为神经纤维纵向呈“波浪状”排列, 这赋予神经一定的延长潜力,但是这种潜力是有一定限度的,超过这个限度, 就会造成神经纤维的损伤。Lee 等[8]和Strong 等[9]的动物实验显示,四肢骨牵引过程中神经受牵拉可导致髓磷脂分解形成小病灶及异常髓鞘再生。Polo 等[10]发现,腓骨牵引成骨早期可对周围神经功能产生影响,腓神经几乎全部被破坏,推测是由直接机械张力引起,但后期均有良好恢复。Li等[11]认为, 在一定范围内, 增加牵引速度可以更强地刺激骨膜成骨,但过快的牵引速度,例如2.0mm/天,会对下牙槽神经造成严重的损伤。蒋朝华等[12]研究较大速率牵引羊下颌骨观察对下牙槽神经的影响发现,按1.5mm/天,3次/天进行牵引,只是在牵引完成初期下牙槽神经出现广泛的Waller变性, 后期无神经纤维化改变,其认为下牙槽神经退行性变是可逆的。李刚等[13]对兔下颌骨以1.5mm/天和1.0mm/天变速牵引15mm 后, 发现下牙槽神经受到明显的影响,到15周时,下牙槽神经的功能有恢复的趋势。

眶下神经是三叉神经的上颌神经的分支,属于感觉神经,其位于骨性眶下裂内,在眶下裂内发出上牙槽前、中神经,出眶下孔发出面支分布于眶下区皮肤。在实验中我们发现:随着上颌复合体前移,在整个牵引期内,眶下神经的形态结构出现渐进性的损伤性变化:光镜下观察神经的纵切面可见神经纤维曲度逐渐消失、断裂、崩解,髓鞘肿胀、模糊不清,轴突连续性发生中断,雪旺细胞增殖、发生空泡变[5];本实验电镜下观察神经的横断面则可见粗的有髓神经纤维出现髓鞘板层由分离到最后的崩解,轴索的结构逐渐消失,雪旺细胞的增生及其内容物的增多,神经间质中出现巨噬细胞及胶原纤维排列紊乱等现象,但细的有髓神经及无髓神经纤维病变轻微。推测其原因可能是快速的机械性牵张力导致眶下神经在单位时间内承受较大的纵向张应力,而且随着神经干的快速延伸,神经束横断面积急剧减少,束间横向压力升高,结果导致神经束内血管闭塞,血液循环障碍而发生沃勒变性;另一方面可能是由于面中份骨牵引延长过程中产生的持续牵引力的速度超过了神经自身的生长速度,使其组织结构产生了一定的损伤性变化。当牵引完成进入固定期后,我们发现,随着固定时间的延长以及去除牵引装置后,神经损伤和变性反应逐渐减轻:光镜下可见神经纤维逐渐恢复其曲度,排列也较为有序,其间的黏液减少,髓鞘肿胀逐渐减轻,空泡变性的雪旺细胞较少[5];电镜下可见随着时间的推移,由于神经组织自身的修复性、适应性变化,牵引力造成的神经损伤和变性反应逐渐减轻,到固定期,神经纤维基本恢复正常排列,纤维间粘液变减少,轴突大部分恢复连续性,髓鞘肿胀减轻,脱髓鞘变神经纤维开始重新髓鞘化,空泡变性的雪旺细胞明显减少[5];电镜下可见有髓神经纤维重新髓鞘化,神经束膜细胞、吞噬细胞大量增生,受损的神经纤维出现了明显的再生,间质中胶原纤维紊乱减轻。这说明适当的牵引力、牵引速度、牵引距离(800g前牵引力牵引犬面中份骨15天,牵引速度平均0.97～0.98mm/天),不会对眶下神经造成不可逆的损伤。去除牵引架2月后神经纤维基本恢复正常。

以上实验结果表明:在合适的牵引力、速度、牵引距离下,上颌骨前牵引造成的眶下、腭大神经损伤是暂时的、可逆的。通过神经自身的修复、适应、再生,受损的神经在牵引固定后2个月左右其组织形态基本可恢复正常。因此我们认为面中份缝牵引成骨术是安全可靠的,不会对神经造成永久性的损伤。

[参考文献]

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[2]柳春明,黄旭明,侯敏,等.经缝牵引成骨早期矫正儿童面中份发育不全[J].中华整形外科杂志,2005,21(2):90-93.

[3]侯敏,柳春明,梁立民,等.中位牵引前移面中份骨骼的实验研究[J ].中华整形外科杂志,2003,13(4):305-309.

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[7]Ross MH.Perineurium:evidence of contractile elements[J].Science,1969,165:604.

[8]Lee DY,Han TR,Choi IH,et al1Changes in somatosensory evoked potentials in limb lengthening1An experimental study on rabbits tibiae1[J].Clin Orthop,1992,285:273-279.

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[12]蒋朝华,李圣利,唐友盛. 较大速率牵引成骨术对山羊下牙槽神经的影响[J].组织工程与重建外科杂志,2007,2(1):36-39.

[13]李刚,宋晓萌. 变速牵引成骨对兔下牙槽神经的影响[J]. 口腔医学,2005,4,25(2):93-95.

骨髓纤维化范文第5篇

［关键词］ 四肢骨折不愈合；经皮自体骨髓移植；三七土元胶囊；血浆纤维蛋白原；D-二聚体

骨折不愈合是临床上骨科常见的并发症，传统植骨方法疗效肯定，但需要切开手术。我科自2002年6月～2006年6月采用经皮自体骨髓移植加服三七土元胶囊治疗四肢骨折不愈合，观察对患者血浆纤维蛋白原（Fib）及D-二聚体（D-dimer，DD）的影响，并与传统手术治疗进行对比，现总结报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 100例患者均为住院病例，随机分为两组。观察组60例，男37例，女23例，年龄15～78岁，平均41.5岁；病程6～24个月，平均11.5个月。骨折不愈合部位：肱骨14例，腕舟骨17例，股骨10例，胫骨19例。对照组40例，男23例，女17例，年龄16～77岁，平均40.7岁；病程5～24个月，平均11个月。骨折不愈合部位：肱骨9例，腕舟骨11例，股骨7例，胫骨13例。两组间性别、年龄、病程及治疗前病情差异无显著性（P＞0.05）。

1.2 纳入标准 骨折不愈合是指骨折修复的自然过程已完全停止，如不经治疗改变骨折部位的局部条件，则不能形成骨连接。临床表现为患肢持续性疼痛、不稳定、使用无力。检查时肢体有异常活动或假关节。局部可有水肿及压痛。X线片表现为骨端硬化，骨髓腔封闭，有时两骨折端形成杵臼状假关节。有时骨折端萎缩疏松，骨端间隙增大。

1.3 治疗方法

1.3.1 观察组 经皮自体骨髓移植术加服三七土元胶囊治疗：（1）经皮自体骨髓移植术：严格无菌操作，备2枚骨穿针，穿刺部位深者用硬膜外穿刺针，采用局部麻醉。首先在X线电视透视下将1枚骨穿针或硬膜外穿刺针准确穿入骨不连部位，并用针尖轻轻剥离骨不连部位的瘢痕组织，以利于骨髓的均匀渗入，保留该穿刺针。用另一枚骨穿针连接注射器在髂前上棘穿刺，抽取红骨髓，抽取后即刻连接骨不连部位的穿刺针，将骨髓缓慢注入骨不连部位。注射时因阻力较大，需加压注射。一般腕舟骨不连部位注射10 ml，注射1次即可。四肢长骨骨不连每次注射30 ml，骨髓注射后局部稍加压包扎，并选用合适的固定。隔4周注射1次，共治疗3次。（2）口服三七土元胶囊：自制［批准文号：鄂药制字（2001）第GZ08－019号］，每粒含广三七0.3 g，土鳖虫0.2 g。服用方法：术后第2天开始口服，每次5粒，每日3次，连续服3个月后评定疗效。

1.3.2 对照组 传统手术治疗：采用手术切开骨折部位，咬除硬化骨及骨端间软组织造成新的骨断面并打通髓腔，取自体髂骨植入缺损部位，然后分别予以适当的内固定。

2 结果

2.1 检测方法 治疗前及治疗结束后患者均于早晨空腹静息状态下肘静脉采血，血液用枸橼酸钠抗凝，3000 r/min，离心10 min，收集上层血浆，置-20 ℃冰箱保存备检。运用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血浆中D-二聚体含量，采用凝固法测定纤维蛋白原（Fib）含量。以上药盒均购于上海太阳生物技术公司，操作严格按试剂盒说明书进行。结果进行统计学分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验方法。

转贴于

2.2 两组治疗前后Fib、DD含量变化的比较 见表1。表1 两组治疗前后Fib、DD含量变化的比较 （略） 注：与治疗前比较，*P

3 讨论

D-二聚体是交联的纤维蛋白在纤溶酶作用下产生的一种特异性降解产物，其血浆水平增高反映继发性纤溶活性增强，可作为体内高凝状态和纤溶亢进的特异性分子标记物［1］。而纤维蛋白原则是血浆中的蛋白分子，可以吸附在细胞表面，有较强的使邻近细胞间发生并联的作用，纤维蛋白原含量增高则血液处于高凝状态，其含量的增加是血栓形成的关键因素［2］。有研究认为［3］，高纤维蛋白原血症可作为静脉血栓形成的独立危险因素。严重创伤，尤其是多发性长骨骨折后易发生脂肪栓塞综合征［4］。实验研究表明，骨折患者血中纤维蛋白原含量、D-二聚体含量较正常对照组明显增高［5，6］，表明患者在急性期内有明显的纤维蛋白原形成和降解，存在着明显的血栓形成和继发性纤溶活性增高。

实验及临床研究证实，自体骨髓血能促进骨折愈合及骨缺损修复［7，8］。自体骨髓来源丰富，可经皮穿刺移植于骨不连及骨折延迟愈合部位，产生的损伤小，不存在免疫反应的问题，在临床中得到了一定程度的应用。我们采用经皮自体骨髓移植加服三七土元胶囊治疗四肢骨折不愈合，其中三七土元胶囊可加强祛瘀生新，接骨续损。观察结果表明，该方法能使患者Fib、DD含量明显下降，通过改善凝血、纤溶活性而预防血栓的形成，促进骨折愈合。

［参考文献］

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7 梁雨田，张伯勋，卢世璧，等.经皮自体骨髓移植在骨缺损瘢痕组织内成骨作用的实验研究.中华外科杂志，1998，36（2）：74-76.