本文作者：苏岚1，曾令兵1,2周勇2张辉2高正勇2张金凤2作者单位：1华中农业大学水产学院2中国水产科学研究院长江水产研究所

材料与方法

1实验材料与试剂

草鱼呼肠孤病毒GCRV-104株，由本实验室分离鉴定和保存;草鱼肾脏组织细胞系，由本实验室建立与保藏［12］;大肠杆菌菌株DH5α、克隆载体pCR1、酵母表达载体pPICZB、毕赤酵母KM71菌株均购于Invitrogen公司。各种限制性内切酶和DNA连接酶购自Promega公司;TaqDNA聚合酶、10×PCRBuffer、dNTPs、DNAmarker为TaKaRa公司产品;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒及酵母DNA提取试剂盒为OMEGABio-Tek公司产品;逆转录试剂盒和ZeocinTM购自Invitrogen公司;蛋白质相对分子质量标准购自Fermentas公司;一抗:鼠抗草鱼呼肠孤病毒104株VP6蛋白多抗由本实验室制备;二抗:羊抗鼠IgG-HRP为ABCLONAL公司产品。

2VP6基因的PCR引物设计及扩增

根据GeneBank公布的GCRV-104株VP6基因编码序列(HM234682)和酵母表达载体pPICZB所含的酶切位点，应用软件Premier5设计一对特异扩增引物:P1:5''''-CggAATTCATggCACgTgTggTT-TAT-3'''';P2:5''''-TCCCCgCgggTgTggTTACgCgggTCAg-3''''，分别引入EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点。CIK细胞培养和GCRV增殖按参考文献进行［13］。按TrizolReagent说明书提取病毒总RNA，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增VP6基因。PCR反应条件如下:95℃预变性5min;94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，30个循环;最后72℃延伸10min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，克隆到pCR1载体，经酶切、PCR和测序鉴定的重组质粒命名为pCR1-VP6，经转化大肠杆菌DH5α筛选鉴定后，含阳性重组质粒的大肠杆菌命名为pCR1-VP6/DH5α。

3酵母表达载体的构建

用质粒DNA小量提取试剂盒从大肠杆菌pCR1-VP6/DH5α中提取质粒，重组质粒和酵母表达载体pPICZB分别用EcoRⅠ和SacⅡ双酶切，回收的VP6基因片段与载体片段在T4DNA连接酶的作用下过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，在25μg/mLZeocin的抗性平板上筛选阳性克隆。提取质粒，以酵母特异AOXⅠ引物:FP:5''''-GACTG-GTTCCAATTGACAAGC-3'''';RP:5''''-GCAAATGGC-ATTCTGACATCC-3''''，进行PCR鉴定，同时进行酶切鉴定和测序分析。经鉴定的重组质粒命名为pPICZB-VP6，含阳性重组质粒的大肠杆菌命名为pPICZB-VP6/DH5α。

4电转酵母菌及转化子的筛选

重组质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化，同时酶切空载体pPICZB做对照，异丙醇沉淀回收。酵母感受态细胞的制备和电击转化法参考EasySelectPichiaexpressionkitusermanual，Invitrogen。经电击转化入酵母KM71，电击后的菌液涂布在Zeocin浓度分别为0.5、1.0、0、3.0、4.0、5.0mg/mL的YPDS平板上，30℃培养2～4d。挑取在高浓度Zeocin平板上生长良好的转化子采用PCR方法筛选阳性转化子，反应条件同1.2，扩增结束后进行1.0%的琼脂糖电泳分析。

5重组酵母菌的诱导表达及产物鉴定

挑取阳性转化子接种到25mLBMGY培养基中，30℃、250r/min培养至OD600值至6左右，离心收菌，重悬于5mLBMMY培养基，封瓶膜封口。30℃、250r/min的条件下诱导培养，每24h补加100%的甲醇至终浓度0.5%(V/V)，设置电转空载体的pPICZB/KM71菌株作为对照。诱导72h后，取菌液1mL，离心收集菌体用灭菌双蒸水洗涤2次，加入蜗牛酶等渗溶液100μL(48mg蜗牛酶溶解于100μL5.48%的山梨醇溶液)，同时加入10μLβ巯基乙醇，37℃孵育1h，使酵母细胞壁破裂。离心后取裂解液上清、沉淀悬浮液(50μLPBS悬浮)以及对照裂解液进行SDS-PAGE电泳检测。同时以常规方法进行Western-blotting反应［14］，一抗浓度为1∶2000，辣根过氧化物酶标记的二抗浓度为1∶20000，化学发光底物显色。

结果与分析

1VP6基因的PCR扩增结果

以提取的GCRV104病毒总RNA为模板，用合成的特异扩增引物P1、P2进行RT-PCR扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见一条大小约1300bp的特异性条带，与预期大小(VP61319bp)一致，如图1。对pCR1-VP6重组质粒进行PCR、酶切，并送测序，测序结果与GeneBank(HM234682)上的参考序列一致，表明成功克隆了GCRVVP6编码基因。

2pPICZB-VP6重组表达载体的构建与鉴定

将扩增的GCRVVP6编码基因克隆到酵母表达载体，构建了重组酵母表达质粒pPICZB-VP6，经SacⅡ单酶切后得到大小约为4600bp的片段;经EcoRⅠ、SacⅡ双酶切后得到大小分别为1300bp和3300bp的片段，与预期酶解片段大小一致;以酵母AOXⅠ引物进行PCR扩增得到大小约1600bp的片段(pPICZB载体上、下游引物之间序列长度与目的片段长度之和)，如图2。测序结果与GeneBank公布的GCRVVP6基因参考序列一致，说明目的基因已正确克隆到酵母表达载体中。

3转化酵母菌及转化子的鉴定

重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化(图3)后转化到酵母KM71菌株，在Zeocin平板上筛选高拷贝转化子，以酵母AOXⅠ引物进行PCR鉴定，结果显示阳性转化子扩增出一条大小约1.6kb的特异条带，与重组质粒扩增的结果一致，而空质粒只扩增出一条300bp的条带(图3)，表明VP6基因已整合到毕赤酵母基因组中。测序结果如图4，表明重组到酵母基因组的VP6基因序列正确，并且酵母表达载体上的多聚组氨酸(6×His)标签和VP6在一个阅读框内，终止密码子TGA位于His标签后。

4表达产物的SDS-PAGE和Western-Blotting检测

对经甲醇连续诱导72h的酵母培养物经离心和破壁处理，进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示诱导后重组菌株的裂解上清在46000处有一特异蛋白条带，与GCRV天然VP6蛋白的分子量相符(图5A);对照菌株中则无该条带;诱导后重组菌株的沉淀悬浮液显示弱的蛋白条带。Western-Blot检测结果如图5B，重组酵母菌株表达的GCRVVP6蛋白可与鼠抗草鱼呼肠孤病毒VP6的多抗特异性结合，在46000处出现单一杂交条带;而裂解后的细胞沉淀、对照菌株则无杂交条带，确证了表达产物是GCRVVP6蛋白。

讨论

当GCRVVP6蛋白在大肠杆菌系统中高效表达时，通常以不溶的包涵体形式存在，后期的溶解、复性过程耗时费力，且复性率低;而利用杆状病毒、昆虫细胞表达系统表达时操作复杂、表达水平低、产业化生产昂贵。所以本实验研究了VP6蛋白在毕赤酵母系统中的表达情况。另一方面，酵母独特的细胞壁和微体(microbody)结构，可以为在其中表达的外源蛋白提供一种生物微囊，使其免受消化道蛋白酶的降解［15］。本实验的诱导表达条件为30℃、0.5%的甲醇添加量、72h，是根据增强绿色荧光蛋白(EGFP)在毕赤酵母中的表达情况初步确定的。本实验室曾将EGFP基因整合到酵母表达载体pPICZB多克隆位点区的EcoRⅠ和SacⅡ酶切位点间，并成功实现了其在酵母宿主菌KM71中的表达，通过流式细胞仪分析表明在30℃、0.5%甲醇添加量的条件下，诱导24h时重组菌株开始表达，诱导72h时重组酵母的表达量最高，为提高VP6蛋白在毕赤酵母中的表达水平可以进一步对温度、pH、OD值、甲醇添加量等条件进行优化。Batra等［16］成功在酵母胞内载体pPICZA中表达了登革病毒2型包膜蛋白结构域Ⅲ(EDVⅢ)，其蛋白表达量可达到50mg/L，并将此重组酵母添加到饲料中通过口服途径免疫小鼠，结果诱导产生了高效价的中和抗体。Jha等［17］将WSSV的包膜蛋白VP19和VP28在毕赤酵母中表达后以口服的形式免疫小龙虾，免疫组获得了大于60%的免疫保护率。本实验利用基因工程技术，将GCRVVP6抗原蛋白基因整合到高效表达的毕赤酵母中，成功实现了VP6蛋白在酵母菌中的表达，但重组酵母工程菌的表达量及其对鱼体的免疫效果，还有待于下一步的鱼体实验。采用疫苗免疫的方法是预防草鱼出血病最为有效的途径之一［18］。目前用于防治草鱼出血病疫苗多采用浸泡和注射途径给予，不仅操作繁琐，而且引起鱼体应激反应。口服是一种最自然的免疫途径，给药安全、方便，使用不受时间、地点和鱼体大小限制，对水生动物不引起应激反应［19］。近年来，随着对鱼类黏膜免疫系统，尤其是口服免疫应答机理的认识不断增加，为口服疫苗的研制提供了理论基础。开展酵母载体表达草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白技术的研究，可为草鱼出血病口服疫苗的制备提供新的思路。