本文作者：朱珊珊、喻晓蔚、徐岩单位：江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

作为真核表达系统,巴斯德毕赤酵母表达系统正以其独特的优势和潜力得到广泛使用[1]。本实验室在前期研究中,从一株酿造浓香型大曲酒酒曲中筛选获得的华根霉中克隆得到其脂肪酶基因proRCL(GenBank登录号No.EF405962),并在毕赤酵母中实现了克隆与高效表达[2]。研究所用的表达载体pPIC9K含有一个来自于乙醇氧化酶Ⅰ(AOX1)基因的严格甲醇诱导型的强启动子pAOX1,但甲醇易燃,在工业放大过程中存在安全隐患。pGAP是一种糖酵解中的关键酶——三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAP)的启动子,在葡萄糖、甘油等基本碳源的存在条件下,能高效地组成型表达外源基因,在培养过程中不需更换碳源,简化了操作步骤,也更适合工业上的应用,因此我们考虑利用GAP启动子来构建组成型表达proRCL的载体。外源基因整合入毕赤酵母,根据线性化位点位置的不同,将会导致两种整合入基因组事件——单插入与双交换的发生,产生两种不同的表型,即Mut+和MutS。单插入事件通常会导致插入不同拷贝数的基因组,而双交换一般是将单拷贝外源基因整合入基因组。多拷贝外源基因的整合可以提高外源蛋白的表达量,但是利用毕赤酵母表达系统进行定向进化的过程中,多拷贝的发生会干扰重组子的筛选,例如筛选酶活提高突变株时,拷贝数的增加也会导致酶活增高,从而干扰了酶活提高突变酶的筛选。而利用商业化的pGAPZαA表达质粒无法产生双交换事件,为了同时利用启动子pGAP进行组成型表达筛选,以及将外源基因双交换整合入基因组产生单拷贝重组子,本文在保留了诱导型表达载体pPIC9K上的5′AOX1的基础上,将PCR得到的pGAP基因片段插入到5′AOX1序列之后,华根霉脂肪酶基因proRCL之前,通过载体与基因组之间的5′AOX1及3′AOX1区发生的双交换事件,将构建的组成型表达载体整合到酵母基因组中,产生MutS表型的菌株。双交换的发生导致基因组中AOX1编码区完全被取代,5′AOX1不能发挥启动子的作用,只作为双交换整合的必需元件。从而导致紧随其后的GAP启动子能够顺利的发挥组成型表达华根霉脂肪酶的作用。该表达体系显著减少毕赤酵母基因多拷贝的产生概率,并能够组成型表达外源基因。以华根霉脂肪酶为研究载体,利用该表达体系组成型表达华根霉脂肪酶,结合橄榄油-罗丹明B平板显色法,建立了定向进化突变文库的高通量筛选方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1工具酶和试剂:限制性内切酶、CIAP碱性磷酸酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、PCR试剂、pMD19-Tsimple载体,TaKaRa宝生物公司;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;DL2000DNALadderMarker、DL5000DNALadderMarker、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、PlasmidMiniKitI,OMEGABIO-TEK;其余试剂均为国产或进口分析纯。1.1.2菌株和质粒:E.coliDH5α由本实验室保存。重组质粒pPIC9K-proRCL和重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-proRCLMutS由本实验室构建,巴斯德毕赤酵母P.pastorisGS115、载体pPIC9K、pGAPZαA购自Invitrogen公司。

1.1.3培养基:大肠杆菌培养基LB及LLB,酵母培养基YPD、MD、MM和YPD-G418按“Invitrogen公司操作手册”方法配制。橄榄油-罗丹明B培养基按照1.34%YNB、4×105%生物素、1%橄榄油、2%琼脂的比例配置后,1×105Pa灭菌30min,灭菌后冷却至60°C,加入1×103%过滤灭菌的罗丹明B,制成平板[3]。

1.2方法

1.2.1GAP启动子的克隆:根据pGAPZαA上的pGAP的序列,设计一对专一性引物:BF:5′-CGGATCCGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCC-3′(下划线为BamHⅠ酶切位点);ER:5′-GAATTCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAGATACC-3′(下划线为EcoRⅠ酶切位点)。以pGAPZαA载体为模板,PCR扩增GAP启动子序列。PCR扩增条件:94°C3min;94°C30s,62°C30s,72°C50s,共30个循环;72°C10min。PCR产物纯化后与pMD19-Tsimple载体连接,转化至E.coliDH5α感受态细胞,转化子提质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,胶回收后得到pGAP片段。

1.2.2pGAPK-proRCL载体的构建:将重组质粒pPIC9K-proRCL(本实验室构建)经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,将无用的载体小片段替换成pGAP片段。利用T4DNA连接酶连接过夜。但是由于proRCL中也含有EcoRⅠ酶切位点,酶切后得到3个片段,根据3个片段的大小情况具体分析,去除284bp的无用片段,将剩余片段胶回收后按顺序与pGAP片段进行连接。将连接产物转化到DH5α感受态细胞,提质粒,获得组成型表达载体pGAPK-proRCL。同时,将pGAP片段与酶切后的原始载体pPIC9K连接构成pGAPK,作为平板筛选法的对照。上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.3酵母的电转化:将构建的组成型质粒pGAPK-proRCL经限制性内切酶BglⅡ酶切后,胶回收得到大片段线性化质粒,电转化毕赤酵母GS115感受态细胞;取8μL浓度为1g/L的线性化质粒与80μL感受态细胞混合均匀,转至0.2cm冰预冷的电激杯中。冰上放置5min,电压1500V,电容25μF,电阻200,进行电击。立刻加入1mL1mol/L山梨醇复苏,30°C培养1h。将转化液涂布于MD平板上,30°C培养2d[4]。pGAPK的电转化方法同上。为了比较单插入与双交换整合事件对重组子阳性率和拷贝数等因素的影响,我们按上述方法将原始载体pPIC9K-proRCL经SalI线性化后在HIS4位点单插入到酵母基因组中。

1.2.4重组子的筛选:从MD平板上挑选HIS+转化子接种于YPD试管,培养16h,提取酵母基因组,利用pPIC9K序列引物5′AOX1、3′AOX1进行PCR,鉴定阳性转化子。5′AOX1:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′;3′AOX1:5′-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3′。PCR扩增条件:94°C4min;94°C1min,56°C1.5min,72°C2min,共30个循环;72°C10min。

1.2.5脂肪酶酶活的测定:将组成型表达菌GS115/pGAPK-proRCLMutS和诱导型表达菌GSll5/pPIC9K-proRCLMutS均按照invitrogen公司的pGAPZαA操作手册的要求,在100mLYPD培养基中,30°C振荡培养,每隔24h取样测酶活。脂肪酶水解活力的测定方法参见文献[5],酶活的定义为:一定反应条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。

1.2.6产脂肪酶菌株高通量筛选方法的建立:将对照菌GS115/pGAPKMutS与构建的组成型表达菌株GS115/pGAPK-proRCLMutS点种于橄榄油-罗丹明B平板上,30°C培养3d,在紫外光下观察单菌落变色圈情况。

1.2.7单插入和双交换筛选库的构建:利用定向进化技术建立的基因突变文库的质量将对后续的实验结果有重大影响。为考察单插入与双交换这两种不同的整合方式对整个建库的影响,将经SalⅠ酶切的线性化对照质粒pPIC9K-proRCL和经BglⅡ酶切的线性化重组质粒pGAPK-proRCL分别通过单插入和双交换方式整合进毕赤酵母基因组中,同时保证这两种线性化质粒的量基本相同,进行电转化。将获得的诱导型Mut+转化子涂布MD平板,将MD平板上的单菌落用灭菌牙签挑至MM板上,诱导5d后,Fast-blueRR顶层琼脂法染色,2min内能够显出明显棕黑色的菌株为阳性重组菌(脂肪酶可以水解萘酯,水解产物与染料结合显色)[6]。阳性重组率=所有MM板上诱导表达产脂肪酶的单菌落数/MD板上的单菌落数。将获得的组成型MutS转化子涂布橄榄油罗丹明B平板,对平板上的转化子进行计数,根据平板上具有荧光变色圈的单菌落数与所有转化子的数量比得到阳性重组率。阳性重组率=橄榄油罗丹明B平板上具有荧光变色圈的单菌落数/橄榄油罗丹明B平板所有的单菌落数。

1.2.8重组子拷贝数的定量:每个文库随机挑选10株阳性转化子,提取基因组,利用荧光定量PCR技术进行基因拷贝数的定量[7]。

2结果与分析

2.1表达载体pGAPK-proRCL的构建以pGAPZαA质粒为模板,利用BF和ER引物PCR获得GAP启动子,同时在pGAP中引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。PCR产物条带约750bp(图1)。连接pMD19-Tsimple载体,测序,确认pGAP被完整的克隆,再经双酶切获得pGAP片段。由于pPIC9K载体和proRCL基因中同时都含有EcoRⅠ酶切位点,因此在双酶切质粒pPIC9K-proRCL时,大部分的proRCL基因也被切除,因此需要将3个片段连接起来。如图2A所示,双酶切质粒pPIC9K-proRCL后将长片段与pGAP连接,构建pGAPK质粒。再用EcoRⅠ酶切线性化pGAPK质粒,将proRCL片段补回表达质粒中。由于线性化的pGAPK质粒过长,酶切位点容易自连,需要先进行去磷酸化处理,再连接proRCL基因,最终得到含pGAP的组成型表达载体pGAPK-proRCL。

2.2组成型表达毕赤酵母的获得和鉴定本实验选择pGAPK-proRCL载体中BglⅡ酶切位点进行线性化,双交换整合到毕赤酵母基因组中。双交换会造成AOX1编码区被取代,形成MutS表型的突变株,见图2B。提取重组酵母基因组,利用pPIC9K序列引物5′AOX1、3′AOX1鉴定阳性转化子[8]。阴性对照GSll5/pPIC9K-proRCLMutS的基因组PCR结果如图3所示,产物条带大小为1580bp。而插入了GAP启动子的酵母重组子GSll5/pGAPK-proRCLMutS的基因组在此基础上将载体上一段284bp的无用序列替换成750bp的pGAP序列,PCR扩增结果为2046bp,图4的PCR验证结果与预想的一致,证明组成型表达毕赤酵母GSll5/pGAPK-proRCLMutS构建成功,pGAP和proRCL基因已整合到基因组中。

2.3组成型表达华根霉脂肪酶的分泌表达图5是组成型表达毕赤酵母的生长曲线,GSll5/pGAPK-proRCLMutS在100mLYPD摇瓶中培养144h后达到最大酶活,为130U/mL。而出发菌株GSll5/pPIC9K-proRCLMutS在相同条件下培养了8d,由于缺乏甲醇的诱导,几乎没有表达脂肪酶。结果证明GAP启动子在毕赤酵母中发挥了组成型表达脂肪酶的作用。组成型表达毕赤酵母GSll5/pGAPK-proRCLMutS在012h处于迟滞期,细胞生长缓慢;1248h进入对数生长期,细胞成指数生长;48120h处于稳定期,细胞浓度基本不变;120h以后细胞处于衰亡期,菌体逐步自溶,释放胞内蛋白酶使外源蛋白降解,酶活迅速降低。

2.4组成型表达脂肪酶的毕赤酵母高通量筛选方法橄榄油-罗丹明B平板变色圈法指利用橄榄油作为底物,用RhodamineB作为指示剂,通过脂肪酸与RhodamineB结合在紫外光下进行观察,平板上产生荧光变色圈来判断脂肪酶活力。如图6所示,GS115/pGAPKMutS菌株未插入脂肪酶基因而生长缓慢,不产生荧光变色圈,只有GS115/pGAPK-proRCLMutS菌株才能在平板上正常生长,它能直接以橄榄油作为碳源表达脂肪酶,因此菌落较大且紫外条件下荧光变色圈大而明显。该结果为进一步利用该筛选系统进行定向进化奠定了基础。

2.5单插入和双交换对转化效率、拷贝数和筛选时间的影响对比单插入和双交换这两种不同方法,分别构建得到GS115/pPIC9K-proRCLMut+和GS115/pGAPK-proRCLMutS菌株。如表1所示,双交换产生的MutS表型菌株和单插入产生的Mut+表型菌株的转化效率均处于105数量级,因此MutS表型菌株的转化效率较Mut+表型菌株的略低并不影响高通量的筛选。两者的阳性重组率相差不大,均达到90%以上,虽然双交换产生的阳性重组率较单插入略有降低,但鉴于它的高转化效率,双交换对建库效率的影响是极其微弱的。MutS表型能够保证全部菌株的单拷贝概率,而Mut+表型菌株却只有51%的单拷贝菌株的概率。由此得出,双交换整合得到的MutS表型菌株转化效率和阳性重组率满足了后续建库的容量需求,并且能稳定的保证转化子的单拷贝状态,大大削减了多拷贝基因重组子的数量,更有利于我们利用该筛选方法进行单基因突变菌株的筛选。同时组成型表达脂肪酶的毕赤酵母通过利用橄榄油罗丹明B平板进行阳性重组子的筛选,省略了转接培养基、富集培养、诱导和染色的步骤,将原始的培养诱导周期从12d缩短为3d,筛选时间缩短为原来的25%,操作简单快捷,满足了高通量筛选的要求。

3讨论

本实验通过在pPIC9K-proRCL载体的5′AOX1启动子与proRCL目的基因之间插入GAP启动子,双交换整合到毕赤酵母基因组中,使基因组中AOX1编码区完全被取代,阻碍5′AOX1诱导启动子使用,发挥了GAP启动子组成型表达的功能。组成型表达华根霉脂肪酶的毕赤酵母可以不经过甲醇诱导就在橄榄油罗丹明B平板上正常生长,操作简便,排除了甲醇作为碳源时对橄榄油的利用率的干扰。载体双交换整合基因组的方式不仅有利于插入的启动子GAP成功的发挥组成型表达的作用,而且保证了所有重组子均为单拷贝菌株,排除了多拷贝突变基因的干扰,有利于后续的酶活提高菌株的氨基酸结构与功能的分析。橄榄油罗丹明B平板变色圈法利用脂肪酶水解底物橄榄油,产生的自由脂肪酸与罗丹明B结合,紫外线照射下,根据菌落周围产生的橙色荧光圈的大小来判断酶活的高低[910]。早在1986年,GiselaKouker等就利用该平板检测细菌产脂肪酶的活力高低[9]。如今它不仅被普遍用于筛选自然界中产脂肪酶的菌株[11],牛卫宁等还将诱导型表达少根根霉脂肪酶基因的毕赤酵母点种于橄榄油罗丹明B平板,进行诱导筛选[12]。诱导型表达毕赤酵母的平板筛选需要首先涂布含葡萄糖的MD平板进行阳性克隆的筛选和富集,再转移到含有甲醇的MM平板进行诱导培养和筛选。而组成型表达毕赤酵母可直接涂布橄榄油罗丹明B平板,利用只含有YNB的橄榄油罗丹明B平板就能得到阳性克隆,再根据脂肪酸与罗丹明B结合在紫外光下产生的荧光变色圈大小即能筛选到高产脂肪酶的突变株,筛选时间缩短为原来的25%。该筛选方法作为定向进化平板初筛脂肪酶的方法,具有操作简便、直观准确、缩短转化子培养时间等的优点。本研究表明,将双交换构建组成型表达载体和利用橄榄油罗丹明B平板变色圈法相结合的方法,成功实现了在3d时间内高通量的筛选组成型表达脂肪酶的毕赤酵母单拷贝重组子的目的,为后续的定向进化提供了简便高效的筛选方法。