细菌、古菌16SrRNA克隆文库的构建和分析

经观察，样品水中微生物细胞含量为1×103～1×104个/mL，估算实验需要800～1000mL地层水。用滤膜过滤地层水，收集菌体，提取总DNA。根据提取的DNA核酸浓度（6～11ng/μL）计算PCR扩增的模板体积。样品扩增结果显示，扩增产物均为单一条带（见图2），这表明PCR反应无明显非特异性扩增现象出现。然后切胶回收目的条带，根据回收16SrRNA浓度（大于20ng/μL）准确计算目的基因体积。克隆完成后通过蓝白斑筛选获得阳性克隆。依据阳性克隆测序结果，同源性大于97%的16SrRNA序列归于一个OTU。其中，杜6-3井样品98个细菌克隆划分为9个OTU，古菌129个克隆划分为10个OTU。敖-7井样品105个细菌克隆划分为12个OTU，古菌104个克隆划分为10个OTU。本文获得的41个OTU序列的GenBank的登陆号为：JQ812008-JQ812048。利用软件构建细菌、古菌发育树，算法采用Neighbouring-Joining方法。构建细菌和古菌克隆文库，分析地层水微生物群落结构和产甲烷菌的构成。杜6-3井样品地层水中的细菌隶属于假单胞菌属（Pseudomonas）、嗜酸菌属（Acidovorax）、动性杆菌属（Planomicrobium）、节杆菌属（Arthrobacter）、白色杆菌属（Leucobacter）。其中假单胞菌属微生物占74.49%，节杆菌属微生物占16.32%，嗜酸菌属和白色杆菌属微生物所占比例均在4%左右（见表2）。因此，假单胞菌属微生物为杜6-3井地层水中绝对优势微生物。张雪梅等[24]和吴亚曼等[25]在大庆油田地层水中、袁三青等[26]在胜利油田油井采出液中也都发现，假单胞菌属微生物为优势菌属微生物。杜6-3井样品地层水中的古菌隶属于甲烷杆菌属（Methanobacterium）和甲烷鬃菌属（Methanosaeta）。其中，甲烷杆菌属微生物为杜6-3井古菌中的绝对优势微生物，所占比例高达93.02%。因此，认为杜6-3井地层水中起主要作用的微生物是假单胞菌属微生物和甲烷杆菌属微生物。敖-7井样品地层水中的微生物种类也较少（见表3），水中的细菌隶属于假单胞菌属（Pseudomonas）、嗜氨基杆菌属（Aminobacter）、甲基营养变形杆菌属（Methylotrophicproteobacterium）、δ-变形杆菌属（Deltaproteobacteria）、拟杆菌属（Bacteroides）、节杆菌属（Archrobacter）、海杆菌属（Marinobacter）、嗜氢菌属（Hydrogenophaga）以及古菌（Archaeon）。其中，假单胞菌属微生物占44.76%，一种不可培养细菌占18.10%，嗜氢菌属微生物占3.81%。敖-7井地层水样品中的古菌属于甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷食甲基菌属（Methanomethylovorans）和甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）。其中，甲烷杆菌属微生物占95.18%，为绝对优势古菌；甲烷食甲基菌属微生物和甲烷八叠球菌属微生物所占比例分别为1.92%和2.88%。

细菌、古菌系统发育树的构建和分析

1细菌系统发育树的构建和分析

基于16SrRNA基因信息绘制杜6-3井地层水中的细菌进化发育树（见图3）。系统发育树中的微生物群落划分为4个类群，分别是：β-变形杆菌纲（Betaproteobacteria）、γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、放线菌纲（Actinobacteria）。分析系统发育树发现，与Du-6-3_B13同源相似性为99%的微生物属于不可培养嗜酸菌属微生物，其GeneBank的登录号（以下简称登录号）为NR026506；由于地层水的pH值显示地层水中没有积累大量的酸类物质，因此推测微生物代谢过程中可能产生少量的酸类物质，这些酸类物质后来被微生物及时代谢分解。Du-6-3_B13同代谢季碳原子的已知微生物（登录号：AJ012071）同源相似性也达到99%，因此推断地层水中微生物利用烃类物质参与代谢循环。Du-6-3_B11在菌群中占17.35%，与其同源相似性达99%的微生物（登录号：JF727662）具有降解烃的能力，属于变形杆菌纲。与Du-6-3_B12同源相似性达100%的已知菌（登录号：HQ057683）属于放线菌纲，参与碳、硫元素的循环代谢。Du-6-3_B30占菌群的1.02%，与动性杆菌属的已知微生物（登录号：AJ697862）同源相似性达99%。综上所述，地层水中微生物利用烃类物质参与代谢循环，将小分子烃类部分转化为有机酸，但这些酸类物质迅速被嗜酸菌代谢分解，因此推测甲烷形成途径主要为CO2还原途径，为乙酸还原途径的可能性较小。敖-7井地层水的细菌系统发育树（见图4）表明，地层水中的细菌分属于6个类群，即：α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）、β-变形杆菌纲（Betaproteobacteria）、δ-变形杆菌纲（Deltaproteobacteria）、γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）、放线菌纲（Actinobacteria）和古菌（Archaeon）。Ao-7_B2与降解苯的已知微生物Aminobactersp.（登录号：AB691579）同源相似性达100%，Ao-7_B25与利用甲基的已知微生物Methylotrophicproteobacterium（登录号：AF250404）同源相似性为100%，Ao-7_B37与已知铁还原菌（登录号：DQ677004）同源相似性为100%。据此推测，生物气藏内局部存在铁还原反应和利用苯及甲基物质的代谢过程。嗜氢菌的存在表明，菌群协同作用可能会产生H2，H2被嗜氢菌利用进一步参与代谢循环。因此，认为生物气藏中微生物能够利用原油进行新陈代谢，经过诸多中间过程，最终通过CO2还原途径形成甲烷，即甲烷形成途径确定为CO2还原途径。

2古菌系统发育树的构建与分析

杜6-3井样品和敖-7井样品中的古菌均可划分为两大类群（见图5、图6），即甲烷杆菌纲（Methanobacteria）和甲烷微菌纲（Methanomicrobia），甲烷杆菌属古菌为两个样品的绝对优势古菌。杜6-3井样品中的古菌属于甲烷杆菌属（Methanobacteriumsp.）和甲烷鬃菌属（Methanosaeta）。甲烷杆菌属微生物所占比例超过93%。相关研究表明[27]，甲烷杆菌属微生物能够利用CO2和H2为底物生产甲烷，不能利用乙酸进行代谢。甲烷鬃菌属微生物的乙酸为代谢底物生产甲烷。杜6-3和敖-7样品中的甲烷食甲基菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷鬃菌属均属于甲烷微菌纲。甲烷微菌可以利用甲酸盐、酒精或者H2和CO2进行代谢，它的存在说明气藏环境中可能存在H2、CO2和有机酸等可供微生物代谢的电子供体[24]。

气藏中微生物产甲烷途径

杜6-3井和敖-7井地层水中微生物种类少。杜6-3井地层水中微生物包括石油降解微生物、作用于季碳原子的微生物、嗜酸微生物、甲烷杆菌和甲烷鬃菌；推测杜6-3井地层水中微生物菌群协同作用降解原油，形成少量酸类物质，这些酸类物质迅速被嗜酸菌代谢分解，因此甲烷为乙酸还原途径成因的可能性较小。甲烷杆菌和甲烷鬃菌具备利用CO2和H2合成甲烷的潜力，甲烷的合成途径可能是CO2还原途径。敖-7井地层水中微生物包括甲基营养变形菌、嗜氢菌、苯降解微生物、甲烷杆菌、甲烷食甲基菌和甲烷八叠球菌。推测敖-7井样品中的微生物可能具备利用烃类甲基参与新陈代谢的能力。嗜氢菌、甲烷杆菌、食甲基甲烷菌和甲烷八叠球菌等微生物具有代谢CO2和H2合成甲烷的潜力，因此推测敖-7井地层水中微生物菌群能够降解烃类物质，具备利用CO2和H2合成甲烷的潜力，生物甲烷形成途径明确为CO2还原途径。因此，适宜的条件下，杜6-3井和敖-7井中的微生物菌群均具备利用CO2转化为甲烷的潜力。分子生物技术非培养分析方法往往能发现一些新种甚至新属的16SrRNA基因序列。两个样品中的细菌、古菌克隆中同源性低于97%（最低的同源相似性仅为87%）的5条序列，极有可能是未被发现的新菌。这说明气层微生物群落中存在未知的新微生物，这些微生物对甲烷代谢途径的贡献尚不清楚，对这类目前尚未培养的、未知菌的功能特性和生命活动规律的了解还需更加深入的研究。

本文作者：魏小芳1,2秦积舜1,2帅燕华1,2刘可禹1,2,3罗一菁4史彦尧1,2张曙光1,2作者单位：1提高石油采收率国家重点实验室2中国石油勘探开发研究院3澳大利亚联邦科学与工业研究院地球科学与资源工程分部4中国石油大学（北京）重质油国家重点实验室