凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱范文第1篇
随着经济的不断发展和人民生活水平的不断提高，健康问题已得到社会各界的广泛关注，食品安全问题也提上记事议程，环境的破坏和食品农药残留问题不断涌现，逐渐成为阻碍我国出口贸易发展的屏障。农药是一种农业生产不可或缺的生产资料，在适量的条件下，对生存与农业、林业和畜牧业之间的害虫和细菌有积极的预防作用，也能在一定程度上促进动植物的生长，预防各种虫害，为农业的创收增产和预防传染病方面有不可磨灭的突出作用。在有限的科技手段中，农药仍是预防疾病、增产创收、缓解粮食压力的最快捷、最便利、最廉价、最有效的方法之一。可是，农药也不是面面俱到，农药的使用本身存在着巨大的隐患，由于我国是农业大国，农药的大量长期使用不仅污染土地和大气，还造成生态环境的严重失衡，更严重的是，农药可残留于食物中，使牲畜和人类中毒，产生严重的后果。然而，农药残留的原因复杂繁多：使用了价格低廉，不易分解的农药；使用农药过量；畜牧业药浴；在动物即将宰杀前仍使用农药；饲养牲畜的饲料为受过农药污染的产品等。近日，农药残留分析方法及检测技术得到了突飞猛进的发展，但食品分类复杂以及农药品种的化学性质千差万别，为农药残留分析检测带来了更大的挑战。其中，农药残留分析的样品前处理技术包含先进的固相萃取技术、基质固相分散萃取技术、凝胶渗透色谱技术以及加速溶剂萃取技术等等。这些技术的功能特点不尽相同，有的是专门分析水源和土壤的，有的是分析果蔬的，有的是分析生物样品的，而本文讨论的凝胶渗透色谱技术在大分子样品分离净化脂肪、色素等方面有显著效果。
2 凝胶渗透色谱技术
前处理和测定是农药残留分析处理的主要手段，而分析的关键是样品的前处理问题。凝胶渗透色谱技术大部分使用的是XAD系列的凝胶，其洗脱剂是配比不同的乙酸乙酯和环乙烷，将大小分子不同的多孔凝胶分离，把油脂、叶绿素、聚合物和生物碱等大分子物质首先淋洗处理，分子质小的后淋洗处理。然后将洗脱液收集起来再次进行分析。凝胶渗透色谱分离的关键因素是柱填料，它分为有机凝胶和无机凝胶，这要求其必须具备强韧的机械强度和化学惰性，还要有流动性小，分离广等特点。一般的分离方法有机溶剂消耗量极大，误差也大，从而操作繁琐，而凝胶渗透色谱技术分离样品运用物理方法分离蛋白质脂肪，并且过程简单，误差小。
2.1 凝胶渗透色谱技术的应用原理
检验农药残留的方法颇多，目前主要有两种____生化法和色谱法。生化法操作简单，测速快效率高。色谱法是使用色谱分离技术，选取合适的仪器测定农药残留的方法，也是农药残留检测的常见方法。凝胶渗透色谱技术是根据溶质分子的大小进行分离的技术，它可用于分析化学性质相同但分子体积有差异的同系物质。先用洗脱机把注射进色谱柱中的预处理浓缩样品洗脱分离完成，使样品的形状和分子大小各异，在通过固定凝胶直径使大分子样品首先被洗脱出来，小分子随之被洗脱出来。凝胶渗透色谱是一项十分有发展前景的分子量测量方式的课题，从一开始的生物学向生化、高分子化学、无机化学等广泛扩展领域，可见其应用范围之广泛，渗透领域之普遍，是农药残留分析的关键性的净化方法。
2.2 凝胶渗透色谱技术在农药残留分析中的应用
农药残留分析同时需要灵敏度极高的检测技术和操作精良的方式方法，其难点就是在除掉杂质的时候保持较高的回收率。提取液的选择要根据农药的极性来判断，即极性弱的提取液配备极性小的有机氯农药。，而极性强的农药配备丙酮提取液。对于特殊的复杂基质，如油脂较高的物质常常不能使用较为普遍的液态萃取或者柱层净化萃取法，使用凝胶渗透色谱技术则可以在柱填料和被分离式样无相互作用的情况下按自身大小进行自动分离。值得欣慰的是，此技术完全可以在常温下进行，没有可逆吸附，能使每一个凝胶渗透色谱技术的分离样品完全洗脱。并且凝胶渗透色谱净化法能够排除大分子的干涉，对各种形态大小复杂的基质都适用。
随着科技的进步，农药品种不断增多，溶剂体系也不断加强完善，Bio-Beads SX-3作为凝胶渗透体系的柱填材料也有迅猛发展。我们对凝胶渗透色谱技术在粮食中的应用为例做简要的分析。粮食中包含脂肪，蛋白质，淀粉等多种材料，这位提取农药残留时排除干扰物进入溶剂增加了困难，因此必须用合适的净化手段对基质的干扰进行解除。将研究人员分为ABCD四个小组，A组用凝胶渗透色谱技术对糙米进行净化，对糙米中的有机氯农药和多氯联苯农药进行分析时采用气相色谱技术，测出的平均回收率约为80%-92%。B组还引用了新的气质联用技术，分析检验了玉米中的三唑醇和三唑酮，结果为农药回收率大约为96%-115%。而C组使用凝胶渗透色谱技术净化糙米，对其中可能存在的60多种有机磷农药进行残留分析，其中35种农药回收率在65%-110%之间。D组用词技术净化和气相色谱技术建立大豆中8种二硝基苯胺类除草剂的残留分析方法，去除量很高。又如，运用凝胶渗透色谱技术同样能对水果蔬菜的农药残留净化起到积极作用。实验表明，运用凝胶渗透色谱技术对果蔬进行抽样净化，其中有机磷农药进行分析的结果为回收率67%～105%。
2.3 凝胶渗透色谱技术的缺陷
运用凝胶渗透色谱技术净化的方法是利用分离大分子干扰杂质，最终可将农药从基质中脱离出来，其最终效果的如何与分子大小、形状和阻碍情况有关。但其中也包含一些不可避免的问题。首先，分子分离可能不彻底，这是由于小分子可以被洗脱到农药里，可大分子极可能跟随油脂先流出去，这时便需要使用柱色谱来净化。其次，GPC所耗费的溶剂量很大，这样当柱色谱内直径比较大时，处理较多样品时速度就会减慢，消耗的能量也多。为了避免这一弊端，科学家研制出了自动化的凝胶渗透色谱净化仪，让净化柱更加趋向柱内直径小，载荷量大和体积小的进样发展，使其分离度得到改善，应用范围得以拓宽。第三，其限制的条件较多。基质的选择和情况对化合物的准确定性和定量有较强的影响力，当从事食品样品的残留分析时，必须考虑多种因素才能得到精确的结果，这要求我们既要对基质反复评估又要通过有效途径进行消除和补偿。
凝胶渗透色谱范文第2篇
目前中药多糖药理作用研究比较活跃，而其分子量和分子量分布及化学结构确定成为进一步深入研究多糖特异性和构效关系以及药效机理的基础。该文归纳总结了多糖分子量和分子量分布及化学结构研究的方法。
【关键词】 中药多糖; 分子量; 分子量分布; 化学结构; 生物活性
Abstract:The study on pharmacological action of polysaccharide of traditional Chinese drug is more active at present， but the definition of molecular weight and molecular weight distribution and chemical constitution has become the foundation of better study on specificity and structure-function relationship and drug action mechanism of polysaccharide. The methods of study on molecular weight and molecular weight distribution and chemical constitutuion of polysaccharide were reviewed in this paper.
Key words:Polysaccharide of traditional Chinese drug; Molecular weight; Molecular weight distribution; Chemical constitution; Biological activity
多糖通常是由几百甚至几千个单糖组成的高分子均聚物或共聚物，其能被水解为多个单糖。多糖存在于植物和动物之中，在高等植物和藻类中，它们是细胞壁或细胞内部的组分；在细菌和真菌中，它们可能既是细胞组分，又是新陈代谢的产物。多糖分子量很大，其性质也大大不同于单糖和低聚糖。现代研究发现茯苓、黄芪、猪苓、枸杞、柴胡、人参、香菇、云芝、银耳、灵芝、冬虫夏草等中药其生物活性成分之一是多糖，具有免疫调节、抗辐射、抗凝血、降血糖、降血脂等功效，而它们的生理活性与多糖分子量和分子量分布及化学结构有密切关系。
1 中药多糖分子量和分子量分布研究
中药多糖是生物大分子，属高分子化合物，其分子量的测定方法有绝对法、当量法和相对法。表示其分子量大小的方式有重均分子量（Mw），数均分子量（Mn），粘均分子量（Mη）和Z均分子量（Mz）。多糖大多数情况下Mn＜ Mη＜ Mw＜ Mz 。多糖的分子量分布是指多糖中各种不同的分子量组分在总量中所占的各自的分量，一般用分子量分布指数α表示，即重均分子量与数均分子量的比值（α=Mw / Mn） ，α比值愈大，说明分子量分布愈宽，当α＝1时，是分子量均一体系。对于生物大分子多糖来说，其分子链的长短可以是不同的，在衡量其分子量时，往往是一个平均数。重均分子量是按分子重量统计平均的分子量，测定方法有光散射法、超速离心沉降速度法以及凝胶渗透色谱法等。数均分子量就是依据总体分子的的个数，求出分子量来的，数均分子量测定方法有端基分析法，气相渗透法，沸点升高冰点降低法，膜渗透压法，凝胶渗透色谱法等。中药多糖主要测数均分子量和重均分子量。目前常用体积排阻色谱法（包括凝胶渗透色谱法和高效凝胶渗透色谱法）测定多糖分子量和分子量分布。2005年版《中国药典》Ⅱ部中收载了用高效凝胶渗透色谱法测定多糖分子量及分子量分布方法。
1.1 凝胶渗透色谱法（GPC）
凝胶渗透色谱法它是根据在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定关系的特性，先用各种已知分子量的多糖制成标准曲线，然后由样品的洗脱体积从曲线中求得分子量。用凝胶过滤法测分子量，每次缓冲液及流速均需一致，否则会产生较大的误差，凝胶柱多采用软质凝胶，常用的商品型号为交联葡聚糖sephadex，琼脂糖Sepharose，聚丙烯酰胺BIo-Gel P。A. E. A. Oliveira1等［1］用GPC法测定了刀豆属植物种子外皮多糖的重均分子量（Mw）为8 830。孔庆胜等［2］采用凝胶过滤法测定南瓜多糖分子量，SephadexG-200层析柱，硫酸-苯酚法检测，测得南瓜多糖的平均分子量为16 000。陈洪亮等［3］用葡聚糖凝胶过滤法测定芦荟多糖分子量，所用凝胶为SephadexG-150，硫酸-苯酚法跟踪检测，结果分子量为45 400。盖英萍等［4］将桑叶多糖粗提取物通过SephadexG-200柱层析，检测得到3种多糖组分，后经SephadexG-75柱层析测定3种多糖组分的相对分子量为41 977，21 220，6 697。
1.2 高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）
高效凝胶渗透色谱法它是根据在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱保留时间(tR)成一定关系的特性，先用各种已知分子量的多糖制成标准曲线，然后由样品的保留时间(tR)从曲线中求得分子量。高效凝胶渗透色谱法测定多糖分子量多采用示差折光检测器，示差折光检测器是一种通用型检测器，在液相色谱检测中多应用于对紫外-可见光没有吸收的化合物分析，只要被检测的化合物的折光指数与液相溶剂体系有差别即可被检测。高效凝胶渗透色谱中主要使用的是刚性凝胶柱，包括高交联度(＞40％)苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球，常用的商品型号为TSK-Gel、Progel-TSKH-Type柱等；多孔球形硅胶，常用的商品型号为T5K- SW柱等；羟基化聚醚多孔微球，常用的商品型号为TSK -PW等。戴敬［5］采用色谱柱为TSK-G4000PWXL(7.8 mm×30.0 cm)，示差折光检测器，分析测定了13 批样品，得到四维灵芝液中多糖组分高效凝胶色谱图谱、多糖组分平均分子量。郭辉［6］采用色谱OHPakSB-805HQ(8 mm×300 mm)，示差折光器检测器，测得红毛五加多糖各组分的重均分子量。姜素琴［7］采用色谱柱为TSK-GELG3000PWxl，测定云芝多糖的重均分子量、数均分子量及分子量分布指数。韩凤兰［8］应用SUGAR KS-804色谱柱，示差折光器检测器，测定宁夏黄芪多糖重均分子量、数均分子量及分子量分布指数。张红旭［9］用凝胶色谱分析柱为Ohpak SB-805HQC(300 mm×8 mm)， 示差折光器检测器，测定了香菇多糖的平均分子量。2 中药多糖的化学结构研究
多糖与蛋白质等生物大分子一样也有明确的三维空间结构，可以用一、二、三、四级结构来描述，其中二、三、四级结构属高级结构，多糖的一级结构是指多糖的单糖残基的组成、排列顺序、相邻单糖残基的连接方式、异头物的构型及糖链有无分支、分支的位置和长短等。多糖的二、三、四级结构是指多糖分子中主链的构象，侧链的空间排布，单糖残基空间相对定位等。由于单糖的种类比构成蛋白质的氨基酸种类多，连接的位点也多，故具有多分支结构的杂多糖结构的确定比蛋白质困难得多。多糖与蛋白质一样，其活性不但与立体结构有关，也存在活性中心，而且还与它所结合的蛋白质、色素、金属离子等有关。目前中药多糖化学结构测定方法很多，主要有酸完全水解、部分水解法，碱降解法、高碘酸氧化和Smith降解法、甲基化反应、酶降解、薄层色谱、高效液相色谱、红外光谱、核磁共振光谱、质谱、气质联用、X-射线衍射等。
2. 多糖一级结构测定常用光谱方法
2.1.1 红外光谱法（IR）和紫外光谱法（UV）
红外光谱在多糖结构分析上主要是识别糖的各种官能团并确定多糖中各种单糖的糖苷键及糖构型，以及不同糖的鉴别。刘宗林［10］经红外光谱分析推断西洋参的多糖是含有葡萄糖、半乳搪、木糖和阿拉伯糖的杂多糖。胡闻莉等［11］用红外光谱分析生脉散多糖纯品，结果表明其结构中存在α型糖苷键(即α-端基差向异构体)。紫外光谱在多糖结构分析上没有多大用处，但可利用在260，280 nm处有无吸收来判断多糖中是否有蛋白质，多肽及核酸，此外还可测定多糖的含量及糖醛酸含量。杨世平等［12］用紫外光谱法说明红枣多糖中蛋白质含量。
2.1.2 核磁共振光谱法（NMR）
核磁共振光谱主要解决多糖结构中糖苷键的构型和重复结构中单糖的数目。1H核磁共振波谱主要解决多糖结构中糖苷键的构型，13CNMR化学位移范围宽广，信号清晰，在多糖结构分析中可确认各种碳核以及分辨分子的构型和构象。13CNMR可用来确定多糖残基中取代位置和分枝点［13］，而2D NMR对于多糖13CNMR谱全归属起着至关重要的作用［14］。白日霞等［15］利用C13核磁共振手段表征了mg级小皮伞多糖结构。李熙灿等［16］应用1H-NMR，13CNMR对黑海参中的多糖成分进行了结构鉴定。核磁共振技术对多糖结构的测定非常重要，如果再与糖组分分析［17］等技术相结合，将更有助于多糖结构的确定。
2.1.3 质谱和气-质联
用质谱在多糖的结构研究中是一种重要的手段，包括电子轰击质谱、化学电离质谱、快原子轰击质谱、电喷雾质谱、串联质谱等［18］。其中化学电离质谱（CI）能提供可靠的分子量，糖碎片的性质，还原糖和非还原端糖的情况等，气-质联用可大大简化糖的结构分析工作。白日霞［19］应用气相色谱-质谱法对甲基化多糖的测定方法及通过质谱解析对多糖的一级结构的推测原理进行了研究。张宏等［20］经气质联机(GC一MS)分析，初步确定了淫羊藿多糖结构糖苷的键型，并推测出其可能的结构。Ulrike经气质联机(GC一MS)分析snow mold蘑菇多糖，确定其为β-(14)糖苷键葡聚糖［21］。
2.2 多糖高级结构测定常用方法
多糖高级结构分析中常应用X射线衍射法(XRD)、毛细管电泳法(CE)、核磁共振法(NMR)，旋光度(ORD)和圆二色谱(CD)、快原子轰击质谱(FAB一MS)、气质联用(GC一MS)、原子力显微镜(AFM)等检测手段。X-射线衍射法主要用来测定多糖的晶体结构，王书军等［22］应用X-射线衍射法测定三种贝母多糖的晶体结构类型为B-型。圆二色谱常用来研究多糖的构型和构象，张丽萍等［23］利用圆二色谱测定了金顶侧耳多糖及其化学修饰产物水溶液的构象。原子力显微镜可以在空气和液体中对多糖分子的单分子和聚集体成像，得到单分子的直径、长度等量化信息和分子聚集体形貌特征［24］。
中药多糖的生物活性不仅与一级结构有关，而且与其高级结构关系密切。杨典洱等［25］研究发现脱乙酰壳多糖抑制真菌生长的能力与其分子量和化学结构紧密相关，脱乙酞壳多糖分子量越小，分子中的自由氨基越多，抑制真菌的活性越大。X-衍射分析表明，具有抗肿瘤活性的香菇多糖呈三股螺旋结构，当其失去三股螺旋构象，改变空间构型，其生物活性也随之消失［26］。研究表明中药多糖分子量、糖单元的组成、糖苷键的类型、主链的构型、支链的空间构型、取代基的种类及数量等与其生物活性密切相关。
伴随着中药现代化进程的加速，国内外关于中药多糖分子量、化学结构和药理作用的研究越来越多，但尚有许多不足之处。目前中药多糖结构研究大多仅限于一级结构，高级结构研究往往欠缺，而多糖的生物活性更多与其高级结构有关；中药多糖药代动力学研究尚处初级阶段，相关研究较少。因此通过多糖一级结构的确立，并结合新的分析方法和计算机辅助药物设计推断多糖的高级结构，可为中药多糖药代动力学研究打下坚实基础。随着现代分析技术手段不断引入，一定会提高中药多糖药物研究整体水平。
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凝胶渗透色谱范文第3篇
[关键词] 温经止痛凝胶膏剂；体外释放度；透皮特性；藁本内酯
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）01（c）-0035-05
Study on release and permeation behavior of Wenjingzhitong Gel Paste in vitro
ZHANG Jinbing1 LI Zhou2 ZHANG Yan2 WANG Lisheng2
1.Department of Pharmacy， Shaoguan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Province， Shaoguan 512026， China； 2.School of Chinese Materia Medica， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Guangzhou 510006， China
[Abstract] Objective To study the release and permeation behavior of Wenjingzhitong Gel Paste in vitro to be used in the treatment of dysmenorrehea prevention and care and to study the influence of inclusion technique to the permeation behavior of essential oil. Methods Dialysis membrane and rat skin were used as the barriers respectively. The release and permeation experiment were carried out with Franz diffusion cell in vitro. Ligustilide， the main active ingredient of the monarch drug （Angelica sinensis） and ministerial drug （Ligusticum wallichii） in the prescription， was used as a marker， and measured by high performance liquid chromatography （HPLC） method. The accumulated and permeation amount were regressed linearly to time to calculate the release and permeation rate separately. Results The release equation of ligustilide from Wenjingzhitong Gel Paste was Q=4.37t+1.79， r=0.993； the release rate was 4.37 μg/（cm2・h） and the accumulated release ratio in 12 h was 90.9%. Permeation equation of Wenjingzhitong Gel Paste with inclusion technique applied to essential oil in 24 h was Q=1.45t+6.06 and the release rate was 1.45 μg/（cm2・h）， while permeation equation without inclusion technique was Q=2.65t+11.99 and the release rate was 2.65 μg/（cm2・h）. Conclusion The release rate of ligustilide from Wenjingzhitong Gel Paste is much greater than the permeation one， which can make ligustilide permeate sustainedly. Inclusion technique makes the permeation rate decrease little， thus the essential oil can be included in the cyclodectrin first and then be added into the hydrogel patch.
[Key words] Wenjingzhitong Gel Paste； Release in vitro； Permeation behavior； Ligustilide
凝胶膏剂又称为巴布剂，系指药材提取物、药物与适宜的亲水基质混匀后，涂布与无纺布上制成的外用制剂，凝胶膏剂具有载药量大、贴敷性和保湿型好、无致敏与刺激性等优点。作为一种经皮给药制剂、凝胶膏剂不经过肝脏“首过作用”和胃肠道的破坏，能维持稳定持久的血药浓度并降低毒副作用，进而提高疗效，减少给药次数[1-5]。温经止痛凝胶膏剂作为一种经皮给药制剂，药物中有效成分只有从基质中释放出来并透过皮肤才能发挥药效作用，因此研究药物的释放度和透皮特性是评价经皮给药制剂的必要内容。
温经止痛凝胶膏剂处方由当归、川芎、冰片、延胡索、吴茱萸、肉桂、细辛等7味中药组成，在治疗寒凝瘀滞、气滞血瘀所致的痛经时效果显著，其中当归、川芎分别为处方的君臣药。温经止痛凝胶膏剂制备时加入的挥发油由当归、川芎、细辛、吴茱萸等中药材提取而得，为了增加挥发油的稳定性，在凝胶膏剂的制备过程中，首先对挥发油进行了包合，但挥发油包合之后可能会对其透皮特性产生一定影响[6]。为了考察温经止痛凝胶膏剂的释放度、透皮特性以及包合技术对挥发油透皮特性的影响，本研究拟以当归、川芎的主要有效成分之一的藁本内酯为指标成分[7-14]，对温经止痛凝胶膏剂的体外释放度及体外透皮特性进行考察。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪包括515泵，2487紫外检测器（美国Waters公司）；N3000色谱工作站（浙江大学）；TK12A透皮扩散仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；KQ500型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DLB200电子天平（日本岛津公司）。
药物干浸膏、挥发油皆为实验室自制（处方中挥发油由当归、川芎等中药材提取而得，挥发油中藁本内酯的含量为0.08 g/mL）。藁本内酯对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号：121204）；β-环糊精（β-CD，湖北新颖河化工有限公司）；聚丙烯酸钠（NP700，广州市升彤京海淀会精细化工厂）；甘油，丙二醇（广州化学试剂厂）；油酸（OA，广州化学试剂厂）；氮酮（Azone，天津市北联精细化学试剂厂），冰片（江西吉安市林科天然冰片厂）；色谱纯甲醇（迪马公司），水为蒸馏水，透析袋（上海金穗生物科技有限公司，MWCO：8000～14000）；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 挥发油包合物的制备
取处方量的挥发油0.3 mL，加0.6 mL的无水乙醇溶解；另取2.4 g β-CD，在60℃的恒温水浴下，将β-CD搅拌溶解于其24 mL的蒸馏水中；将制好的β-CD溶解置于磁力搅拌器上，控制温度40℃，搅拌速度500 r/min，将挥发油乙醇溶液缓缓加入到β-CD溶液中，在磁力搅拌器上搅拌0.5 h后，将加入挥发油乙醇溶液的β-CD水溶液置于冰箱中静置过夜，过滤，滤渣在40℃真空干燥箱中干燥5 h后取出，置于避光阴凉处备用，滤液用封口膜封存，置于冰箱中备用，即得挥发油包合物。
2.2 温经止痛凝胶膏剂的制备
取卡波姆-980 0.035 g加入1.62 mL的水以及包合物滤液1.64 mL中溶胀24 h，并加入药物干膏粉1 g和挥发油包合物0.19 g，作为A相；取冰片0.05 g、甘油2.0 g、NP-700 0.35 g和乙醇0.4 mL置于烧杯中，搅拌均匀，作为B相；取甘羟铝0.07 g、酒石酸0.05 g、氮酮0.2 g、丙二醇0.1 g、水0.4 mL于50 mL烧杯，混匀，作为C相。将C相缓缓加入到A相中，混匀，然后再加入B相，搅拌5 min，即得黏度适宜的正常对照组凝胶膏剂。
2.3 藁本内酯含量测定方法的建立[15]
2.3.1 色谱条件 Platisil ODS色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（80∶20）；流速：1.0 mL/min；检测波长：328 nm；柱温25℃；进样量10 μL。以藁本内酯色谱峰面积计算，保留时间为7.5 min，理论塔板数按藁本内酯峰计应不低于5000。色谱图见图1。
2.3.2 对照品贮备液的制备 采用微量进样器吸取藁本内酯对照品适量，置于10 mL容量瓶中，精密称定其质量为5.04 mg，用甲醇定容至刻度，摇匀即得浓度为504 μg/mL的藁本内酯标准母液。
2.3.3 阴性样品与供试品溶液的制备 将生理盐水加入无水乙醇使两者比例为6∶4，即得空白接收液（阴性样品）；另取温经止痛凝胶膏剂体外透皮接收液，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
2.3.4 标准曲线的绘制 精密吸取标准母液0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，定容及摇匀，即得浓度2.52、5.04、12.6、25.2、37.8、50.4 μg/mL的系列标准溶液。按照“2.3.1”项下色谱条件，依次进样，进样量10 μL，重复3次。取平均峰面积（Y）与浓度（X）进行直线回归分析，得回归方程为Y=17 238X-3875.4，r = 0.9998。结果表明藁本内酯在质量浓度为2.52～50.4 μg/mL范围内线性关系良好。
2.3.5 精密度试验 取质量浓度25.2 μg/mL的对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样，连续重复进样6次，各10 μL，测得藁本内酯峰面积，并计算其RSD为0.49%，表明该仪器的精密度良好。
2.3.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样，测定溶液中藁本内酯的峰面积，并计算其RSD值为1.14%，表明供试品溶液在24 h内测定是稳定的。
2.3.7 加样回收率试验 精密量取已测藁本内酯含量的透皮吸收液6份，分别精密加入藁本内酯对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算回收率。结果平均回收率为98.9%，RSD为1.38%，表明该方法准确性良好，可作为制剂的体外释放度研究的含量测定方法。
2.4 体外释放度测定
采用改良Franz扩散池进行实验，扩散池容积为8 mL，有效扩散面积为3.14 cm2。将透析膜固定于供给池与接收室之间，供给池中均匀涂布温经止痛凝胶膏剂1 g，注意不要留空隙，接收室中加入已超声脱气的乙醇-生理盐水（4∶6）。调节温度至（32±0.5）℃，约200 r/min恒速搅拌，分别于实验开始后的1、2、4、6、8、10、12 h从样品接收室吸取1 mL接收液，并同时补加同温同体积的空白接收液，保持接收液与透析膜良好接触。吸取的接收液过0.22 μm微孔滤膜，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定藁本内酯，并按下式计算累计释放量（Qn）和累计释放率（R）[16-19]。
Qn=■
R=■×100%
其中Qn：第n个时间点的累积面积透过量（μg/cm）；V：接收室中接受液的总体积（8 mL）；Vi：每次的取样体积（1 mL）；Cn：第n个取样点测得的药物质量浓度（μg/mL）；A：有效扩散面积（3.14 cm2）；m：1 g温经止痛凝胶膏剂中藁本内酯的量（200 μg）。求得累积渗透量之后，将累积渗透量（Q）对时间（t）进行方程拟合，分别有下列3种方式：零级方程：Q=at+b；一级方程：lnQ=at+b；Higuchi方程：Q=at1/2+b[20-21]。将累计渗透量（Q）对时间（t）用上述3种方式进行回归，求得回归方程，并求得回归系数（r），回归系数最大的方程即为最佳拟合方程，也是能说明温经止痛凝胶膏剂释药方式的最佳方程。由表1可以得知，温经止痛凝胶膏剂中藁本内酯接近零级速率方程，药物累计渗透量与时间成正比，12 h温经止痛凝胶膏剂中藁本内酯的累计释放量达到181.9 μg，累计释放率达90.9%，说明温经止痛凝胶膏剂12 h的释药特性良好，温经止痛凝胶膏剂的制备工艺合理，满足经皮给药制剂的要求。实验数据及结果见表1。
2.5 包合技术对挥发油体外透皮特性的影响
2.5.1 离体鼠皮的制备与保存 取健康小鼠，用电动剃毛机剃去小鼠腹部毛，再用6%的硫化钠溶液对剩余的毛发进行脱除，2 d后小鼠脱臼处死，小心剥离腹部皮肤，剔除皮下脂肪组织及粘连物，用生理盐水反复冲洗干净，置于-20℃冰箱中保存备用（一周内使用完）。实验前自然解冻，每次实验前检查皮肤的完整性，不能有任何破损。
2.5.2 离体大鼠透皮试验 以藁本内酯24 h的透皮速率及累计透皮量为指标，按照“2.4”项下操作（将Franz扩散池中供给池和接收池之间的屏障换成离体鼠皮、角质层面向供给池）分别对挥发油包合组及挥发油未包合组（“2.2”项下包合物换成挥发油，包合物滤液换成同体积纯水）凝胶膏剂藁本内酯的透皮特性进行考察，从而包合技术对挥发油透皮效果的影响，从表2和表3可以看出，未包合组藁本内酯的累计透过量明显高于包合组，说明挥发油用β-环糊精包合之后，其透皮特性受到影响，透皮特性降低，但是仍然具有较好的透皮性能，但是挥发油包合之后能降低其挥发性能，较大程度地提高稳定性，因此最后选择将挥发油包合之后再加入到凝胶膏剂之中。见表2～3。
表2 挥发油包合组与未包合组24 h藁本内酯的透皮数据（n = 3）
表3 挥发油包合组与未包合组Q-t方程及相应参数（n = 3）
3 讨论
“2.2”项下温经止痛凝胶膏剂制备时，A相中加入了制备挥发油包合物时的滤液（制备时，挥发油加入β-CD饱和溶液中，搅拌，静置，过滤得挥发油饱和物，滤液则加入A相），是因为挥发油在采用饱和β-CD溶液包合时，未包合的挥发油溶于或分散在β-CD溶液中，若弃去此部分，将会造成挥发油的浪费，减少了处方的用量[22]。因此在计算藁本内酯的累计释放率时，温经止痛凝胶膏剂中藁本内酯的含量即按加入的挥发油中所含的藁本内酯计算。
冰片是温经止痛凝胶膏剂处方中的药物之一，为了减少损失冰片并没有和处方中其他药物一起提取制备浸膏，而是磨成极细粉之后直接加入到B相；另外冰片还有促渗剂的作用，能促进处方中其他药物成分的透皮吸收[23]，说明了处方组成的合理性。
温经止痛凝胶膏剂是将中药复方提取物直接制成的凝胶膏剂，有效成分较多，本研究仅以藁本内酯为指标成分考察其药物的释放特性，可能不能反映对全方整体的释放特性[24]，但也是一次有意义的探讨，今后将对多个代表性的指标成分进行释放度的考察。
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凝胶渗透色谱范文第4篇
摘要:目的 探讨不同浓度新型促渗剂壬代环戊双醚对双氯芬酸钠凝胶的透皮吸收影响。方法 采用改良Frans扩散池进行体外透皮吸收实验。流动相:甲醇乙酸水溶液(pH=3.0)(体积比70∶30),紫外检测波长284 nm。结果 壬代环戊双醚含量在2.0%时透皮吸收最好。结论 壬代环戊双醚具有较好的促渗作用,是较好的新型促渗剂。
关键词:壬代环戊双醚;双氯芬酸钠凝胶;透皮吸收;新辅料
经皮给药系统是目前药剂学研究的热点之一[1]。其可维持稳定持久的血浓,避免胃肠道的破坏及肝脏首过效应,毒性和不良反应小,使用方便。然而在治疗量下许多药物难以渗透皮肤,必须使用促渗剂增加药物穿透性和透皮速率。在实际应用中,常用的有油酸及其酯类、二甲亚砜及其衍生物和氮酮等,其中以氮酮(azone)最为普遍[2]。
本室合成一种新的透皮吸收促进剂――壬代环戊双醚[3],化学名为2正壬基1,3二氧戊环。由癸醛和乙二醇在对甲基苯磺酸催化下脱水环合而成。性状为无色、透明、无毒、略有香味的稀油状液体。其合成方法、药理毒性另文报道。
双氯芬酸钠为非甾体抗炎药[4],口服易引起胃肠道反应,采用经皮给药方法,可以消除其对胃肠道的刺激,但经皮吸收又受到角质层的限制,透皮速率较小,需添加促透剂以改善药物的透皮释药。本文选用双氯芬酸钠为模型药物结合不同浓度的新型促渗剂壬代环戊双醚研究其对药物透皮制剂吸收的影响,考察壬代环戊双醚新型促渗剂的开发价值。
1 试剂、仪器与实验动物
1.1 试剂与仪器
高效液相色谱仪(LC―10A,日本岛津),智能透皮实验仪(TP―2A,南京红蓝电子科技中心),改良Frans扩散池(购自沈阳药科大学),ZD―85双功能气浴恒温振荡器(江苏金坛市富华仪器有限公司),卡波姆940(Carbomer,美国Goodrich公司),双氯芬酸钠(北京双鹤药业有限公司),双氯芬酸钠对照品(购自中国药品生物制品检定所),壬代环戊双醚(本室合成),氮酮(azone,药用,广州化学助剂厂),甲醇(色谱醇,南京汉邦试剂厂),其他试剂均为分析纯。
1.2 实验动物
昆明种小白鼠,体质量20~22 g,SPF级,雌、雄兼用,福建医科大学动物实验中心提供,合格证号为医动字第23―006号(质)。
2 实验方法 1 双氯芬酸钠凝胶剂的制备
取双氯芬酸钠150 g溶解于60 ℃ 1 500 mL丙二醇中,另将150 g卡波姆940加入800 mL蒸馏水中充分溶胀,搅拌下将双氯芬酸钠溶液加入卡波姆基质中,并分别加入质量浓度为0%,0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,25%,3.0%的壬代环戊双醚、2.0%的氮酮,用三乙胺调pH为7.5,搅拌使成凝胶状,蒸馏水加至1 000 g,搅匀,分装即得。 2 含量测定 2.1 色谱条件
色谱柱shimpack ODS柱(4.6 mm×150 mm,10 μm);检测波长284 nm;流动相:甲醇乙酸水溶液(pH调3.0)(体积比70∶30);流速:1.0 mL?min-1;柱温为室温;进样量:20 μL。柱效以双氯芬酸钠计,理论塔板数不低于3 000。 2.2 标准曲线的制备
精密称取105 ℃干燥至恒重的双氯芬酸钠对照品50 mg,置于50 mL量瓶中,用流动相溶解定容,振荡摇匀,备用。精密量取标准液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL置于100 mL量瓶中,用流动相溶解定容,振荡摇匀。精密吸取20 μL进高效液相仪测定峰面积,以峰面积(A)为纵坐标与双氯芬酸钠质量浓度(ρ)进行线性回归,得标准曲线方程: A=2377.15 ρ+01152,r=0.9998,线性范围:5.0~30.0 μg?mL-1。 2.3 稳定性试验
取双氯芬酸钠适量,加接收液生理盐水配成高低不同浓度的溶液,分别在0,2,4,8,12,24 h处测定峰面积,RSD分别为0.78%和0.61%。结果表明,双氯芬酸钠在24 h内稳定。 2.4 精密度试验
精密吸取对照品溶液(15.078 μg?ml-1)20 μL,分别于同一日内,不同日内重复进样5次,测得RSD分别为1.19%和2.13%。 3 体外透皮试验 3.1 离体鼠皮的制备
取体质量20~22 g健康小鼠,处死后立即剃除腹部毛,剥离腹部皮肤,除皮下脂肪,用生理盐水冲洗后浸泡于生理盐水中,置于4℃冰箱冷藏,24 h内使用。 3.2 体外透皮试验
试验装置的透皮面积为4.52 cm2,接受池体积为10.05 mL。磁力搅拌器速度为60 r/min,实验温度为(37±0.5) ℃恒温水浴。接受液为生理盐水。
将双氯芬酸钠凝胶均匀涂布于预先处理好的鼠皮上,固定在释放池下端(角质层朝向玻璃管侧),凝胶含壬代环戊双醚的质量浓度分别为0%,0.5%,1.0%,15%,2.0%,2.5%,3.0%和含2.0%的氮酮在1,2,4,6,8,10,12,14 h取样4 mL,立即补充同温生理盐水4 mL,以0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,于284 nm处测定峰面积。 3.3 接受液含量测定和累积透皮量的计算
将所测峰面积代入标准曲线方程计算浓度,并量取接受液的体积,按以下公式计算累积释放药量(Q)。 4 统计学方法
数据的录入和分析处理在SPSS l0.0统计软件上完成。不同浓度各时间点累积透皮药量比较采用重复测量的方差分析,用LSD法作多重比较。
3 结 果
体外鼠皮透皮吸收试验结果见表1。表1 含不同浓度壬代环戊双醚和氮酮的双氯芬酸钠凝胶的体外释放量(略)
本实验对含药量相同,但含壬代环戊双醚浓度不同的7种凝胶分别进行6次体外鼠皮透皮吸收试验,经重复测量的分析,表明在6种浓度中,2.0%,2.5%,3.0%组的透皮药量显着高于其他浓度组(P0.05),在时间方面以14 h组最高(P0.05);但是2.5%,30%组的透皮药量与2.0%组的透皮药量差异无显着性。同样2.0%浓度组的氮酮略低于2.0%浓度组壬代环戊双醚(P0.05),两者差异无显着性。
综合考查,ρ=2.0%的壬代环戊双醚对双氯芬酸钠凝胶累积透皮药量较高,选择其为本凝胶的促渗剂。
4 讨 论
凝胶渗透色谱范文第5篇
[关键词] 丹皮酚；丁香酚；胡椒碱；经皮渗透性；活血止痛膏
Transdermal permeation of effective components in Huoxue Zhitong patch
YANG Chang， DU Shou-ying*， BAI Jie*， LI Peng-yue， CUI Ya-hua， YANG Bing
（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）
[Abstract] To establish a determination method for the contents of paeonol， eugenol and piperine in receptor liquid and to research the transdermal permeability of Huoxue Zhitong patch. The contents of paeonol， eugenol and piperine in receptor liquid were determined by high pressure liquid chromatography（HPLC）； and the receptor liquid was optimized by taking accumulative amount penetrated within 24 hours， percutaneous permeation rate and skin irritation as indexes. In vitro Franz diffusion experiment was applied to assess the percutaneous penetration characteristics and regularity of Huoxue Zhitong patch. The results showed that the accumulative penetration amount and penetration rate by using PEG 400-ethanol-normal saline 3∶3∶4 as receptor liquid were higher than those by using propylene glycol∶ethanol∶normal saline 3∶3∶4 and ethanol-normal saline 3∶7， the and skin irritation of PEG 400-ethanol-normal saline 3∶3∶4 was smaller than propylene glycol：ethanol： normal saline 3∶3∶4. Results of percutaneous permeability experiments displayed that the accumulative amount penetrated of paeonol， eugenol and piperine within 24 hours was 2.84， 19.9， and 0.753 μg・cm-2 respectively in Huoxue Zhitong patch and the penetration rate was 0.18， 1.22， and 0.02 μg・cm-2・h-1 respectively. Thus， the permeation of paeonol， eugenol and piperine through the skin was a diffusion process， which was irrelevant to their content in patch.
[Key words] paeonol； eugenol； piperine； transdermal permeation； Huoxue Zhitong patch
活血止痛膏是安徽安科余良卿药业有限公司自主研发的一种橡胶膏剂，现收载于2015年版《中国药典》一部[1]。其由牡丹皮、胡椒、丁香等20多味药组成，能够活血止痛、舒筋通络，临床上广泛用于筋骨疼痛、肌肉麻等的治疗。作为外用给药剂型，有效成分穿过皮肤屏障（角质层）到达靶部位是发挥治疗作用的前提。通常认为，橡胶膏剂载药量小[2]，有效成分是否能到达皮下及皮下组织，将直接影响治疗效果，因此有必要对活血止痛膏有效成分的经皮渗透性进行研究。
体外透皮实验法操作简单、实验条件易于控制，在经皮给药制剂经皮渗透性研究中得到广泛的应用[4]。该方法通常采用人体皮肤、动物皮肤或人工膜模拟在体皮肤环境，以生理盐水作为接收液，用Franz扩散池来评价药物的释放和皮肤渗透性[3]。但由于活血止痛膏中存在大量的脂溶性成分，在生理盐水中的溶解度很小，难以满足漏槽条件，因此本课题对透皮接受液进行筛选，建立活血止痛膏透皮接受液中丹皮酚（paeonol，Pae）、丁香酚（eugenol，Eug）、胡椒碱（piperine，Pip）的HPLC，并对活血止痛膏的经皮渗透性进行研究，为其进一步研究与开发提供理论依据。
1 材料
LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津，含1690型柱温箱和SPD-20A型紫外检测器）；BT125D型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；TK-20B型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；KQ5200DA 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BSA2245电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；RE-539C雷瓦电动理发器（上海雷瓦电器有限公司）；Quanta 250扫描子显微镜（美国FEI 公司）。
丹皮酚对照品（成都曼斯特生物科技有限公司中国科学院成都生物研究所，批号MUST-15020401）；丁香酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号110725-201414）；胡椒碱对照品（成都曼斯特生物科技有限公司中国科学院成都生物研究所，批号MUST-15071310）；活血止痛膏（安科余良卿药业有限公司）。甲醇（Fisher公司，色谱纯）；纯净水（娃哈哈集团有限公司）；乙酸（Fisher公司，色谱纯）；无水乙醇（北京化工厂，分析纯）；聚乙二醇-400（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；1，2-丙二醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；戊二醛溶液25%（国药集团化学试剂有限公司）；乙酸异戊酯（北京化工厂，分析纯），其他试剂均为分析纯。
雄性KM小鼠，体重（20±1） g，由维通利华实验动物中心提供，合格证号SCXK（京）2012-0001。
2 方法
2.1 色谱条件
2.1.1 丁香酚和丹皮酚的色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇为流动相A，以酸水（乙酸调节pH至2.8）为流动相B，梯度洗脱（0～20 min，55%～40% B；20～25 min，40%～20% B；25～30 min，20% B；30～35 min，20%～55% B），流速1.0 mL・min-1；分别以274，280 nm 作为丹皮酚、丁香酚的检测波长；柱温30 ℃。
2.1.2 胡椒碱的色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-酸水（乙酸调节pH至2.8）（77∶23）为流动相，流速1.0 mL・min-1；检测波长343 nm；柱温30 ℃。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称定丹皮酚、胡椒碱及丁香酚适量，置于10 mL 量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，分别制备成质量浓度为 0.593，0.983，1.056 g・L-1的对照品母液。
2.3 标准曲线的制备
用无水乙醇将上述对照品母液制备成不同浓度的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件检测。以待测成分质量浓度C （mg・L-1）为横坐标，以待测成分峰面积A为纵坐标，进行线性回归，得到Pae，Eug，Pip的标准曲线。Pae在0.094 85～9.485 mg・L-1线性关系良好，标准曲线回归方程为A=48 607C-1 233.9，r=0.999 8；Eug在0.08 448～8.448 mg・L-1线性关系良好，标准曲线回归方程为A=10 177C-903.7，r=0.999 2；Pip在0.039 31～3.931 mg・L-1线性关系良好，标准曲线回归方程为A=75 507C-4 529.6，r=0.999 3。
2.4 离体皮肤的制备
取雄性KM小鼠，断颈椎处死，除去腹部鼠毛，确保角质层完好，分离腹部皮肤，用脱脂棉擦去脂肪组织和结缔组织，生理盐水冲洗干净。用铝箔包裹后-20 ℃冷冻保存，1周内用完。
2.5 Franz 扩散池法[5]
将2.4所制备的离体皮肤自然解冻，备用。将鼠皮固定在渗透扩散装置的供给室与接收室之间，角质层朝向供给室（有效扩散面积3.46 cm2），分别加入20 mL透皮接收液，池内置磁力搅拌子，转速350 r・min-1，温度（32.5±0.2） ℃下平衡30 min，排尽皮肤下的空气，滤纸吸干皮肤表面的液体。将剪好的活血止痛膏置于离体皮肤上方，使其与皮肤紧密接触。分别于不同时间点取样0.4 mL，同时补加等体积同温度的新鲜接收液。所取接收液经0.22 μm微孔滤膜过滤，按上述色谱方法进行HPLC测定，按下述公式计算相应时间丹皮酚、丁香酚及胡椒碱的累计透过量（Qn）和透皮速率（Jss）。
Qn=（VCn+1.0×∑n-1i-1Ci）/S
公式中Qn为第n个时间点的单位面积累积透过量（μg），V为接收液的体积（20 mL），Cn为取样点接收液的质量浓度（mg・L-1），S为扩散池的有效面积（3.46 cm2）。
以累计透过量Qn纵坐标，t为横坐标，绘制累积透过量-时间曲线，其斜率为透皮速率Jss[6]。
2.6 皮肤标本的制备[7]
按2.4所述方法制备离体皮肤，随机分成4组，按2.5所述方法将其固定于渗透扩散装置的供给室与接收室之间，分别将30%聚乙二醇400-30%乙醇-40%生理盐水（PEG-Et-NS）、30%丙二醇-30%乙醇-40%生理盐水（PG-Et-NS）以及30%乙醇-生理盐水（Et-NS）作为透皮接收液。12 h后用眼科剪迅速将不同组离体皮肤于相同部位剪下面积为0.5 cm×0.5 cm的小块，迅速置于2.5%戊二醛溶液中固定。12 h 后用去离子水清洗3次，乙醇梯度脱水，CO2临界点干燥，真空溅射仪喷金，扫描电子显微镜观察超微结构。
3 结果
3.1 透皮接收液的筛选
3.1.1 不同接收液渗透量、渗透速率比较研究 分别以PEG-Et-NS，PG-Et-NS，Et-NS作为透皮接收液，活血止痛膏中丹皮酚、胡椒碱及丁香酚透皮吸收情况见图1，2。
由图可知，以PEG400-Et-NS 3∶3∶4为接收液，丹皮酚的Q24和Jss略大于以PG-Et-NS 3∶3∶4为接收液，明显高于以Et-NS 3∶7为接收液；丁香酚的Q24和Jss明显高于以PG-Et-NS 3∶3∶4，Et-NS 3∶7为接收液；胡椒碱的Q24略大于以Et-NS 3∶7为接收液，明显高于以PG-Et-NS 3∶3∶4为接收液，但3种接收液条件下Jss无明显差异。
3.1.2 不同接收液皮肤刺激性比较研究 取2.6项下皮肤样本，于扫描电镜下观察不同接收液条件下，小鼠皮肤下表面微^结构变化情况，结果见图3。
NS组：皮肤下表面胶原纤维丰满，呈紧密堆积排列；Et-NS组：皮肤下表面胶原纤维较丰满，排列整齐；PG-Et-NS组：皮肤下表面胶原纤维稀疏，排列紊乱，纤维较细，能看到纤维下皮肤有明显的褶皱；PEG400-Et-NS组：皮肤下表面胶原纤维较稀疏，排列紊乱，纤维较细。
综上所述，以PEG400-Et-NS 3∶3∶4为活血止痛膏经皮透过研究的透皮接收液。
3.2 活血止痛膏经皮渗透性研究
以PEG400-Et-NS 3∶3∶4为透皮接受液，活血止痛膏24 h累计经皮渗透量随时间变化规律见图4，表1。分别采用零级模型、一级模型、Higuchi 模型、Hixson-Crowell 模型对活血止痛膏经皮渗透曲线进行回归分析，结果见表2。
4 讨论
本课题组通过预实验发现，以生理盐水作为活血止痛膏透皮接收液，所收集的样品中Pae，Eug，Pip的浓度均不能达到HPLC的定量限。结合前期研究对微透析灌流液的筛选，以30%乙醇生理盐水作为灌流液，微透析探针对Pae，Eug，Pip均无明显吸附[8]，同时参考于娟等[9]活血止痛凝胶体外释放和经皮渗透性研究中的透皮接收液，选择30%乙醇生理盐水作为透皮接收液。又因为该3个成分尤其是Pip 的脂溶性较强，为增加三者在透皮接收液中的溶解度，对透皮接收液进行进一步的筛选。
本研究所制备的离体皮肤下缘处于真皮深层的网状层，与透皮接收液接触的下表面主要由各种纤维构成，以胶原纤维为主。本研究主要以纤维的排列规则度、稀疏程度、粗细为指标对透皮接收液的皮肤刺激性进行评判。由结果可知，Et-NS组皮肤下表面纤维更饱满，排列更规则，更接近生理盐水组；PG-Et-NS组皮肤下表面纤维细，稀疏，排列紊乱，最偏离皮肤正常结构。因此，透皮接收液皮肤刺激性由大到小为：PG-Et-NS 3∶3∶4>PEG-Et-NS 3∶3∶4> Et-NS 3∶7。结合累计透过量和透过速率两指标，最终选择PEG-Et-NS 3∶3∶4为透皮接收液。
由透皮接收液的筛选结果可以看出，同比例的PEG400和丙二醇，PEG400对3种成分的溶解作用更强。经分析，PEG400同丙二醇均可与生理盐水、乙醇组成潜溶剂，从而增加脂溶性成分在透皮接收液中的溶解度。但PEG400作为一种非离子表面活性剂，除有潜溶作用外，还可以与脂溶性化合物形成胶束[10]，因此增溶作用更强。
由方程模型拟合结果可以看出，接收液中Pae，Eug，Pip的浓度变化规律均符合零级模型，说明药物的透皮过程与膏中药物浓度无关；又因为三者Higuchi模型的相关系数r均大于Hixson-Crowell模型，因此可以推测3种成分是从活血止痛膏中扩散到达皮肤表面的。因活血止痛橡胶膏剂基质主要是橡胶、松香等，要经过混炼的步骤将基质和中药浸膏进行均匀混合，随后经历精炼、烘胶等步骤使药物被严密的包裹在以橡胶为骨架的混合基质中[11]。因为橡胶、松香等均不宜溶于水中，不会出现凝胶（膏）剂中药物在扩散和骨架溶蚀双重作用[12]下释放的现象。
由活血止痛膏橡胶膏剂经皮渗透性研究结果可以看出，3种成分24 h累积透过量较低、渗透速度较慢，尤其是胡椒碱Q24为0.753 μg・cm-2，Jss为0.02 μg・cm-2・h-1。同时与于娟等[9]研究结果相比，丹皮酚的Jss约为凝胶膏剂中丹皮酚Jss的1/10，这与其他研究[13-14]所得橡胶膏剂透皮性能较差相一致。另外，橡胶膏剂还存在皮肤刺激性、皮肤残留性等缺点，提示为提高活血止痛膏的生物利用度及药效，可寻找新型、安全、高效的载药体系。
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